一种宛氏拟青霉菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物菌株【技术领域】，尤其是一种宛氏拟青霉菌株及其应用，宛氏拟青霉（Paecilomyces?varioti）菌株MM2，于2013年7月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会，保藏号是CGMCC?NO.7903；将菌株加入到稻草麸皮液体培养基、滤纸无机盐液体培养基、PDA液体培养基中的任意一种液体培养基中，28-30℃下培养2-9d，制得单菌株的固体菌剂；能够高效降解利用纤维素，可用作木质纤维素类固体废弃物的资源化处理的外接菌种源，加快纤维素的降解；同时，从酒渣堆肥中分离出，应用于酒渣堆肥中，避免了定值难的问题，添加含该种菌株的菌剂后，有效的促进了酒渣堆肥的腐熟，加快有机肥的加工。
【专利说明】一种宛氏拟青霉菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物菌株【技术领域】，尤其是一种宛氏拟青霉菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 酒糟又叫酒渣，是指自谷物中蒸出酒精或酒精饮料后的残渣，即酿酒后产生的渣 滓，常用作家畜饲料。某些白酒生产企业的酒渣年产量达上万吨，如果不及时加以处理，就 会腐败变质，严重污染周围环境。利用酒渣堆肥生产有机肥，不仅可以变废为宝，还有利于 促进农村经济的发展，减少环境的污染。由于酿酒企业采用有机高粱、有机小麦作为白酒生 产的主要原料，其酒渣含有蛋白质、纤维素、脂肪、维生素以及各种微量元素等，也为有机肥 的也创造了有利条件。然而，在现有技术中，对于用于酒渣堆肥中的纤维素降解外源菌株报 道较少。
[0003] 目前，白酒酒渣主要用作饲料喂养猪牛等粗饲动物，主要因为这些动物的食物较 杂，且酒渣的适口性较好。根据一系列的实验证明，添加比例在25 %比较合适，除幼畜和孕 产期母畜外，其他牲畜均可用加工后的酒渣制品饲喂，尤其在育肥期增重效果十分明显，可 提高10%以上，同时降低成本13%以上。近几年有报道用加工后的酒渣作为能量饲料代替 麸皮喂养鸡、鸭、兔、鱼等，也收到了良好效果。蝇蛆是很好的动物性蛋白饲料，蝇蛆干粉的 蛋白质含量高达53. 26 %，赖氨酸4. 09 %，蛋氨酸1. 41 %，其中，必需氨基酸总量是鱼粉的 2. 3倍，蛋氨酸、赖氨酸分别是鱼粉的2. 7倍及2. 6倍，因此也有人使用酒渣为培养物养殖蝇 蛆生产动物性蛋白饲料。李许滨，吴建伟等利用固态酱香白酒酒渣生产工程蝇蛋白，同时 通过工程蝇的代谢生长，作用于白酒酒渣，生产生物活性有机肥。但以上方法消耗的酒渣量 较小，不能充分利用酒渣，因此需要为酒渣的资源化寻找更为有效的途径。
[0004] 堆肥是利用有机固体废弃物，在高温、多湿的条件下，经过微生物发酵腐熟而制成 的一种有机肥料。经堆肥化过程制成的有机肥具有改良土壤、培肥地力的优点。有机肥料施 入土壤后，有机质能有效地改善土壤理化状况和生物特性，熟化土壤，增强土壤的保肥供肥 能力和缓冲能力，为作物的生长创造良好的土壤条件。另外，经堆肥化过程制成的有机肥还 可增加广量、提1?品质。有机肥料含有丰富的有机物和各种营养兀素，为农作物提供营养。 有机肥腐解后，为土壤微生物活动提供能量和养料，促进微生物活动，加速有机质分解，产 生的活性物质等能促进作物的生长和提高农产品的品质。经堆肥化过程制成的有机肥还能 提高肥料的利用率。有机肥含有养分多但相对含量低，释放缓慢，而化肥单位养分含量高， 成分少，释放快。两者合理配合施用，相互补充，有机质分解产生的有机酸还能促进土壤和 化肥中矿质养分的溶解。有机肥与化肥相互促进，有利于作物吸收，提高肥料的利用率。
[0005] 虽然酒渣中含有大量纤维素，但是如CN1928074A、CN101560488A、CN101974436A 和CN1460664A公开的微生物菌株，应用于酒渣堆肥的效果并不理想。
[0006] 如 CN102021120A 公开的一种宛氏拟青霉（Paecilonyces variotii)菌株 H6 及其 应用，所述宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)菌株H6于2010年4月9日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会，保藏号是CGMCC No. 3722。该种宛氏拟青霉菌株在降解甲醛的 效果较好，但是在降解纤维素和应用于酒渣堆肥时的效果不理想。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种可加速纤维素降解和腐熟的菌株，以及这种宛氏拟青 霉菌株在降解纤维素和酒渣堆肥中的应用。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明的宛氏拟青霉菌株丽2,其分类命名为 Paecilomyces varioti，现已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地 址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0. 7903,保藏日期2013年 7月8日。
[0009] 本发明的宛氏拟青霉菌株MM2的形态和显微学特征是：菌株加在麦芽汁琼脂培养 基上，在25°C黑暗条件下，培养7天，菌落直径扩展为80mm，黄褐色，绒毛状，至近粉状；分生 孢子梗自气生菌丝生出，瓶梗单生或轮生（8-20) X (2. 5-3) μ m。分生孢子呈椭圆形或短柱 形，光滑，链状着生于瓶梗上，长径为（3-5) X (2-2. 5) μ m。
[0010] 由微检字第052号检测鉴定报告得出，根据送检菌种的培养特征、显微特征和 rRNA基因序列的实验数据的综合分析，送检菌种编号为：丽2的菌株，其鉴定结果为一新 菌，属于宛氏拟青霉菌株（Paecilomyces varioti MM2);并且经过中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心对该生物材料的存活性检测，结果为存活。
[0011] 本发明的宛氏拟青霉菌株丽2的培养方法，是将菌株加入到液体培养基中， 28-30°C下培养2-9d，制得单菌株的固体菌剂；其中，培养基为稻草麸皮液体培养基、滤纸 无机盐液体培养基、PDA液体培养基中的任意一种。
[0012] 所述的稻草麸皮液体培养基为 K2HP04 2g、（NH4)2S04 1. 4g、MgS04. 7H20 0· 3g、CaCl2 0· 3g、CoCl2 2mg、FeS04. 7H20 5mg、MnS04. H20 1. 6mg、ZnS04 1. 7mg、琼脂 20g，蒸馏水 1000mL、 稻草粉和麸皮10. 56g、调节pH为7. 2?7. 3配制。
[0013] 所述的滤纸无机盐液体培养基为 NaN032. 5g、KH2P04 lg、CaCl2 · 2H20 0. lg、MgS04 0· 3g、NaClO. lg、FeCl3 0· 01g、滤纸片 10g、蒸馈水 lOOOmL 配制。
[0014] 所述的PDA液体培养基为马铃薯100g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，PH7. 2?7. 4， 以蒸馏水配制。
[0015] 本发明的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的应用方案是通过以下技 术方案得以实现的：
[0016] 当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌剂以> 8%。的接种量添加到酒渣 堆肥中，可有效促进酒渣堆肥升温，并获得保持较高温度的高温期，从而加快堆肥进程，缩 短堆肥周期，提高堆肥的腐熟度。
[0017] 本发明的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2在纤维素降解中的应用。
[0018] 本发明的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2在利用酒渔堆肥生产有机 肥中的应用。
[0019] 本发明的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2在制备用于酒渔堆肥的微 生物菌株中的应用。
[0020] 本发明通过原位分离方法，在白酒酒糟中分离纯化得到宛氏拟青霉 (Paecilomyces varioti)MM2菌株，可加速纤维素降解和腐熟；按一定比例接种添加到酒渔 中，能够高效降解利用纤维素。
[0021] 本发明在长期探索用于酒渣堆肥的菌株时，经试验偶然发现，宛氏拟青霉丽2菌 株在某白酒生产基地广泛分布，并且具有较强的纤维素降解性能，在酒渣中生长迅速。因 此，将其应用于酒渣堆肥中，既可避免外来菌源对当地微生态的不适应性及干扰性，又可加 快当地酒渣的资源化处理，同时也丰富了菌种资源。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有的技术效果体现在：
[0023] ①本发明的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2能够高效降解利用纤维 素，可以作为酒渣堆肥的起爆剂和强化剂，加快堆肥过程，提高堆肥腐熟度，制作有机肥，尤 其适用于木质纤维素类固体废弃物的资源化处理和利用酒渣生产有机肥。
[0024] ②本发明采用的纤维素降解菌株可从酒渣堆肥中筛选出，并用于酒渣堆肥中， 由于菌种原位施用，避免了菌种对酒渣环境的不适应性和对酒渣生态的干扰性，加之菌 株依据碳源协同性组合，不仅有利于菌株间协同性增强，也有利于菌株在酒渣中的定植， 能有效促进酒渣堆肥的有机质的转化，加快堆肥腐熟，促进了宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2在酒渔堆肥中的应用。
[0025] ③本发明通过稻草粉与麸皮的平板培养试验及滤纸溃烂试验，证明了宛氏拟青霉 (Paecilomyces varioti)菌株MM2能够高效降解利用纤维素，可用作木质纤维素类固体废 弃物的资源化处理的外接菌种源。
[0026] ④本发明在研究高效降解纤维素的菌种组成的时候，针对有机物质纤维素，筛选 含有宛氏拟青霉MM2菌株的菌剂来有效降解纤维素，可以加快纤维素的降解；同时，该种菌 株可从酒渣堆肥中分离出，对酒渣堆肥具有很强的适应性，不存在难以定植的问题，因此添 加由该种菌株制成的菌剂，尤其适于对酒渣中的主要有机物纤维素的降解，能有效促进酒 渣堆肥腐熟进程，加快有机肥的制作效率。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的 范围不仅局限于所作的描述。
[0028] 实施例1
[0029] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株 MM2 加入到由 K2HP04 2g、（NH4)2S04 1. 4g、MgS04· 7H20 0· 3g、CaCl2 0· 3g、CoC12 2mg、FeS04· 7H20 5mg、MnS04· H20 1. 6mg、ZnS04 1. 7mg、琼脂20g、蒸馏水1000mL、稻草粉和麸皮10. 56g、其中通过灭菌处理的稻草粉和麸皮 按照2:1的比例，调节pH为7. 2配制的稻草麸皮液体培养基中，在28°C下进行液体培养2d， 得到宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2。
[0030] 实施例2
[0031] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株 MM2 加入到由 K2HP042g、（NH4)2S04 1. 4g、MgS04. 7H20 0· 3g、CaCl2 0· 3g、CoC12 2mg、FeS04. 7H20 5mg、MnS04. H20 1. 6mg、ZnS04 1. 7mg、琼脂20g、蒸馏水1000mL、稻草粉和麸皮3%、其中通过灭菌处理的稻草粉和麸皮按 照1:1的比例，调节pH为7. 3配制的稻草麸皮液体培养基中，在30°C下进行液体培养9d， 得到宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2。
[0032] 实施例3
[0033] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2加入到含有由K2HP04 2g、 (NH4)2S04 1. 4g、MgS04. 7H20 0· 3g、CaCl2 0· 3g、CoCl22mg、FeS04. 7H20 5mg、MnS04. H20 1. 6mg、 ZnS04 1. 7mg、琼脂20g、蒸馏水1000mL、稻草粉和麸皮3%、其中通过灭菌处理的稻草粉和麸 皮按照1:1的比例，调节pH为7. 3配制的稻草麸皮液体培养基的斜面培养器皿中，在28°C 下进行液体培养2d，得到宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的单菌株菌剂。
[0034] 实施例4
[0035] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2加入到含有由K2HP04 2g、 (NH4) 2S04 1. 4g、MgS04. 7H20 0· 3g、CaC12 0· 3g、CoC122mg、FeS04. 7H20 5mg、MnS04. H20 1. 6mg、ZnS04 1. 7mg、琼脂20g、蒸馏水1000mL、稻草粉和麸皮3%、其中通过灭菌处理的稻草 粉和麸皮按照1:1的比例，调节pH为7. 3配制的稻草麸皮液体培养基的斜面培养器皿中， 在28°C下进行液体培养2d，得到宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的单菌株， 再将该单菌株与其他纤维素降解菌混合得到复合固体菌剂。
[0036] 实施例5
[0037] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株 MM2 加入到由 NaN032. 5g、KH2P04 lg、 CaCl2 · 2H20 0· lg、MgS04 0· 3g、NaCl 0· lg、FeCl30. 01g、滤纸片 10g、蒸馏水 1000mL 配制，并 经121°C灭菌30min后，自然PH环境下的滤纸无机盐液体培养基中，在28°C的环境下培养 9d，观察滤纸有明显的溃烂状态，滤纸失重率达15. 85%。
[0038] 实施例6
[0039] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株 MM2 加入到由 NaN032. 5g、KH2P04 lg、 CaCl2 · 2H20 0· lg、MgS04 0· 3g、NaCl 0· lg、FeCl30. 01g、滤纸片 10g、蒸馏水 1000mL 配制，并 经121°C灭菌30min后，自然PH环境下的滤纸倾斜放入的无机盐液体培养基中，在28°C的 环境下培养9d，观察滤纸有明显的溃烂状态，滤纸失重率达15. 85%。
[0040] 实施例7
[0041] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2接种于500ml三角瓶中的PDA液 体培养基内，在三角瓶中装入液量为200ml，置于摇床上，在30°C，135r · mirT1的条件下培 养48h，获得种子菌剂；再将种子菌剂以10% (v/w)接种于灭菌后的麸皮和/或稻草上，接 种均匀后，置于竹篓中，采用4层纱布覆盖，在室温条件下培养，每1天搅拌一次，培养6天 后，微生物数量达6X108个/克，瞭晒，共制得宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株 丽2固体菌剂20kg左右。
[0042] 实施例8
[0043] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2接种于500ml三角瓶中由马铃 薯l〇〇g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，以蒸馏水配制，调节PH为7. 2的PDA液体培养基内， 在三角瓶中装入的液量为200ml，置于摇床上，在30°C，135r 的条件下培养48h，获得 种子菌剂；再将种子菌剂以10% (v/V)接种于灭菌后的麸皮和/或稻草上，接种均匀后，置 于竹篓中，采用4层纱布覆盖，在室温条件下培养，每1天搅拌一次，培养6天后，微生物数 量达6X108个/克，瞭晒，共制得宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2固体菌剂 20kg左右。
[0044] 实施例9
[0045] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2接种于500ml三角瓶中由马铃 薯l〇〇g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，以蒸馏水配制，调节PH为7. 4的PDA液体培养基内， 在三角瓶中装入的液量为200ml，置于摇床上，在28°C，130r 的条件下培养3d，获得 种子菌剂。
[0046] 实施例10
[0047] 将宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2接种于500ml三角瓶中由马铃薯 l〇〇g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，以蒸馏水配制，调节PH为7. 4的PDA液体培养基内，在 三角瓶中装入的液量为200ml，置于摇床上，在29°C，140r 的条件下培养2d，获得种 子菌剂；再将种子菌剂以10% (v/V)接种于灭菌后的麸皮和/或稻草上，接种均匀后，置于 竹篓中，采用4层纱布覆盖，在室温条件下培养，每1天搅拌一次，培养7d后，微生物数量达 6X 108个/克，瞭晒，共制得宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2固体菌剂20kg 左右。
[0048] 实施例11
[0049] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为8%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0050] 实施例12
[0051] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为2%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0052] 实施例13
[0053] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为4%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0054] 实施例14
[0055] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为6%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0056] 实施例15
[0057] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为7%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0058] 实施例16
[0059] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为10%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0060] 实施例17
[0061] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为12%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
[0062] 实施例18
[0063] 在实施例1-4或7-10的基础上，当固体菌剂含菌量> 6X108CFU/g时，将固体菌 剂以质量含量为>8%。的接种量添加到酒渣堆肥中，使酒渣堆肥升温发酵生产有机肥。
[0064] 试验例：
[0065] 试验例1宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)MM2菌株的应用量的测定。
[0066] 堆置8堆酒渣堆肥，其中堆2至堆8分别采用实施例11-17的所述的固体菌剂量 加入到酒渣堆肥中，测定堆肥开始的10天内的温度变化情况，如表1所示：
[0067] 表1堆肥开始的10天内的温度高低情况，单位°c
[0068]
【权利要求】
1. 一种宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2,其特征在于：于2013年7月8 日保藏于中国微生物保藏管理委员会，保藏号是CGMCCN0. 7903。
2. 如权利要求1所述的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的培养方法，其 特征在于：是将菌株加入到液体培养基中，28-30°C下培养2-9d，制得单菌株的固体菌剂； 其中，培养基为稻草麸皮液体培养基、滤纸无机盐液体培养基、PDA液体培养基中的任意一 种。
3. 如权利要求2所述的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的培养方法， 其特征在于：所述的稻草麸皮液体培养基为K2HP042g、（NH 4)2S041. 4g、MgS04. 7H200. 3g、 CaCl20. 3g、CoCl22mg、FeS04. 7H205mg、MnS04. H20L 6mg、ZnS04l. 7mg、琼脂 20g，蒸馏水 1000mL、稻草粉和麸皮10. 56g、调节pH为7. 2?7. 3配制。
4. 如权利要求2所述的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的培养方法， 其特征在于：所述的滤纸无机盐液体培养基为NaN032. 5g、KH2P04lg、CaCl2 · 2H200. lg、 MgS040. 3g、NaClO. lg、FeCl30. Olg、滤纸片 10g、蒸馈水 lOOOmL 配制。
5. 如权利要求2所述的宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的培养方法， 其特征在于：所述的PDA液体培养基为马铃薯100g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，PH7. 2? 7. 4,以蒸馏水配制。
6. 如权利要求1所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2或权利要求 2-5任一项所述宛氏拟青霉（Paecilomycesvarioti)菌株MM2培养方法培养的宛氏拟 青霉（Paecilomyces varioti)菌株丽2的应用方法，其特征在于：当固体菌剂含菌量 彡6X108CFU/g时，将固体菌剂以彡8%。的接种量添加到酒渣堆肥中。
7. 如权利要求1所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2或权利要求2-5任 一项所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2培养方法或权利要求6所述的宛氏 拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的应用方法在纤维素降解中的应用。
8. 如权利要求1所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2或权利要求2-5 任一项所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti )菌株MM2培养方法或权利要求6所述的宛 氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的应用方法在利用酒渔堆肥生产有机肥中的应 用。
9. 如权利要求1所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2或权利要求2-5任 一项所述宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2培养方法或权利要求6所述的宛氏 拟青霉（Paecilomyces varioti)菌株MM2的应用方法在制备用于酒渔堆肥的微生物菌株中 的应用。
【文档编号】C12N1/14GK104059854SQ201410130198
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】王和玉, 汪地强, 江友峰, 胡旭, 袁颉, 王岩 申请人:贵州茅台酒股份有限公司