一种有机氮源、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种有机氮源、其制备方法及应用。所述氮源为枯草芽孢杆菌干粉制剂，总氮含量6%至9%，氨基氮含量2%至3%，蛋白质水解度20%至50%。其制备方法包括以下步骤：（1）用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其pH值在10至12，使得菌丝体中的核黄素溶出；（2）除去残留的碱性溶液，获得中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥；（3）枯草芽孢杆菌菌丝体泥，干燥后粉碎得到所述的有机氮源。本发明提供的有机氮源能应用于发酵法生产核苷类产品。本发明提供的有机氮源成本低、质量稳定，可回收利用生产核黄素用的枯草芽孢杆菌菌丝体，应用于发酵法生产核苷类产品，能显著提高产量，缩短发酵时间。
【专利说明】一种有机氮源、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，更具体地，涉及一种有机氮源、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]目前核苷类产品，如鸟苷和肌苷，其生产方法有化学合成法、酶水解RNA法、菌体自溶法和发酵法4种。发酵法因其产率高、周期短、易控制等优点，已经成为工业生产鸟苷的重要来源。碳源和氮源是鸟苷发酵培养基的主要成分，用于鸟苷发酵的主要碳源是葡萄糖或者是利用淀粉水解制作成淀粉糖。基于保证产量的考虑，通过改变碳源来降低发酵成本是难以实现的。因此，研究氮源用来提高鸟苷产量或是降低成本具有重要意义。
[0003]氮源主要用于构成菌体细胞物质和合成代谢产物，用于核苷类产品如鸟苷和肌苷发酵的常用氮源分为无机氮源和有机氮源，无机氮源主要是一些铵盐、硝酸盐，包括氨水；有机氮源有豆饼粉，酵母粉，蛋白胨，玉米浆，尿素等。无机氮源相比有机氮源来说，成分单一，缺乏某些营养物质和生长因子，迅速利用后会引起PH值的变化，对发酵过程有一定的影响。有机氮源，如大豆蛋白胨、酵母提取物、尿素等成本高昂，同时质量不稳定，受产地、批次等因素的影响较大；而较廉价的有机氮源，如玉米浆干粉，则品质难以控制，导致发酵生产不稳定；有些有机氮源，如玉米浆干粉和酵母粉等，含有少量不溶性固形物，给后续的分离带来了一定的负担。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的 以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种有机氮源及其制备方法和应用，其目的在于通过制备一种成本低且质量稳定的有机氮源，由此解决目前发酵法，尤其是发酵法生产核苷类产品时，由于有机氮源成本高或不稳定问题，导致核苷类产品价格昂贵的技术问题。
[0005]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种有机氮源，所述氮源为枯草芽孢杆菌干粉制剂，其总氮含量在6%至9%之间，氨基氮含量在2%至3%之间，蛋白质水解度在20%至50%之间。
[0006]优选地，所述有机氮源，其总含氮量为8%。
[0007]优选地，所述有机氮源，其氨基氮含量为3%。
[0008]优选地，所述有机氮源，其蛋白质水解度为40%。
[0009]按照本发明的另一方面，提供了所述有机氮源的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其pH值在10至12之间，使得菌丝体中的核黄素溶出，得到不含核黄素的枯草芽孢杆菌菌丝体；
[0011](2)将步骤(1)中得到的菌丝体除去残留的碱性溶液，获得中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥；
[0012](3)将步骤(2)中获得的枯草芽孢杆菌菌丝体泥，干燥后粉碎得到如权利要求1所述的有机氮源。[0013]优选地，所述的有机氮源的制备方法，其步骤(1)中的枯草菌菌丝体，按照如下步骤制备:
[0014](a)采集生产核黄素过程中提取后的含有枯草芽孢杆菌菌丝体的悬浊液；
[0015](b)将所述悬浊液高速离心，使菌丝体与液体完全分开，得到上层液体和下层枯草芽孢杆菌菌丝体；
[0016](c)将所述上层液体除去，保留下层，即制得所述枯草芽孢杆菌菌丝体。
[0017]优选地，所述的有机氮源的制备方法，其步骤(1)中的枯草菌菌丝体的制备步骤中，步骤(b)高速离心转速为6000至8000转/分钟，离心时间15分钟至20分钟。 [0018]优选地，所述的有机氮源的制备方法，其步骤(1)所述碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
[0019]优选地，所述的有机氮源的制备方法，其步骤(3)所述的干燥温度为70°C至90°C。
[0020]按照本发明的另一个方面，提供了所述的有机氮源的一种应用，即所述的有机氮源应用于发酵法生产核苷类产品，优选的核苷类产品为鸟苷或肌苷。
[0021 ] 优选地，所述的应用，其有机氮源分批添加到发酵培养基中。
[0022]优选地，所述的应用，其有机氮源分2次添加到发酵培养基。
[0023]优选地，所述的应用，其有机氮源分2次添加的时间分别是发酵起始和产苷高峰期。
[0024]总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果:
[0025](I)本发明提供的有机氮源，来源为枯草芽孢杆菌，含氮量高，蛋白质水解度较好，品质稳定，是较为理想的有机氮源。
[0026](2)本发明提供的所述有机氮源的制备方法，使用碱性溶液分离枯草芽孢杆菌菌丝体中的核黄素，避免该有机氮源因含有大量核黄素而对发酵效果产生不利影响。
[0027](3)本发明提供的所述有机氮源制备方法，能再利用核黄素生产的副产物，成本低，且对于核黄素生产过程中清洁生产、废物利用具有重要意义。
[0028](4)本发明提供的所述有机氮源制备方法，通过对枯草芽孢杆菌菌丝体制备中各项工艺参数、碱液PH值及干燥温度等参数进行优化，使得制备的氮源质量稳定，用于发酵法生产核苷类产物如鸟苷和肌苷效果较好。
[0029](5)本发明提供的有机氮源，以分次添加的方式应用于核苷如鸟苷和肌苷发酵，一方面缩短了发酵时间，另一方面提高了鸟苷和肌苷产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是本发明提供的有机氮源制备方法流程图。
【具体实施方式】
[0031]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0032]本发明提供的有机氮源，为枯草芽孢杆菌干粉制剂，其总氮含量在6%至9%之间，氨基氮含量在2%至3%之间，蛋白质水解度在20%至50%之间，优选地，所述有机氮源的总氮含量在8%左右，氨基氮含量在3%左右，蛋白质水解度40%左右。
[0033]所述有机氮源的制备方法，如图1所示，包括以下步骤:
[0034](I)用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其pH值在10至12之间，使得菌丝体中的核黄素溶出，得到不含核黄素的枯草芽孢杆菌菌丝体。
[0035]所述碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液。优选的碱性溶液为3mol/L的氢氧化钠溶液。
[0036]所述枯草芽孢杆菌菌丝体，按照如下步骤制备:
[0037](a)采集生产核黄素过程中提取后的含有枯草芽孢杆菌菌丝体的悬浊液；
[0038](b)将所述悬浊液高速离心，使菌丝体与液体完全分开，形成上层液体和下层枯草芽孢杆菌菌丝体；高速离心转速为6000转/分钟至8000转/分钟，离心时间15分钟至20分钟。优选地，所述高速离心转速更优选为8000转/分钟，所述离心时间更优选为15分钟。
[0039](c)将所述上层液体除去，保留下层，即制得所述枯草芽孢杆菌湿菌丝体。
[0040](2)将步骤(1)中得到的菌丝体除去残留的碱性溶液，获得pH值中性的枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥；pH值中性指pH值在6至8之间。
[0041](3)将步骤(2)中获得的中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥干燥后粉碎得到所述的有机氮源。干燥温度优选70摄氏度至90摄氏度，更优选为80摄氏度。
[0042]本发明提供的有机氮源可应用于发酵法生产核苷类产品，如鸟苷或肌苷。向核苷产品的发酵培养基内，添加所述有机氮源，可提高其产量。优选地分2次添加所述有机氮源:第一次在发酵起始，即第一次添加是在发酵第O小时至5小时之间，添加氮源总用量的40%至50%，前期添加是为了提供培养基中菌体生长必要的氮源及维持基质浓度，同时避免底物渗透压过高对生核苷产品的菌体生长所产生的不利影响；第二次在发酵产苷高峰期，即第二次添加是在发酵第36小时至48小时，在此时期内核苷大量合成，为了避免因各种营养成分的消耗所引起的碳氮比失调以及PH值的改变，进行的第二次添加时添加量为所述氮源总用量的50%至60%，为核苷的合成提供了保证。
[0043]对氮源的添加解除了高浓度底物对核苷产品生产菌体生长的抑制作用，发酵时间缩短，单位产量提高。以鸟苷为例，发酵时间可缩短至55小时，鸟苷的发酵单位由40g/L提高到了 60g/L，较现有的技术水平40g/L而言，产量提高了 50%。(是否还需提及肌苷？)
[0044]以下为实施例:
[0045]实施例1
[0046]所述有机氮源的制备方法，包括以下步骤:
[0047]( I)用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其pH值在10，使得菌丝体中的核黄素溶出，得到不含核黄素的枯草芽孢杆菌菌丝体。
[0048]所述碱性溶液为I摩尔/升的氢氧化钠溶液。
[0049]所述枯草芽孢杆菌菌丝体，按照如下步骤制备:
[0050](a)采集生产核黄素过程中提取后的含有枯草芽孢杆菌菌丝体的悬浊液；
[0051](b)将所述悬浊液高速离心，使菌丝体与液体完全分开，形成上层液体和下层枯草芽孢杆菌菌丝体；高速离心转速为6000转/分钟，离心时间20分钟。[0052](c)将所述上层液体除去，保留下层，即制得所述枯草芽孢杆菌湿菌丝体。
[0053](2)将步骤(1)中得到的菌丝体除去残留的碱性溶液，获得pH值中性的枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥；pH值中性指pH值在6至8之间。
[0054](3)将步骤(2)中获得的中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥干燥后粉碎得到所述的有机氮源。干燥温度为70摄氏度。
[0055]按照本实施例制备的有机氮源，检测其各项指标，结果如表1所示。
[0056]实施例2
[0057]所述有机氮源的制备方法，包括以下步骤:
[0058](1)用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其pH值在11，使得菌丝体中的核黄素溶出，得到不含核黄素的枯草芽孢杆菌菌丝体。
[0059]所述碱性溶液为2摩尔/升的氢氧化钾溶液。
[0060]所述枯草芽孢杆菌菌丝体，按照如下步骤制备:
[0061](a)采集生产核黄素过程中提取后的含有枯草芽孢杆菌菌丝体的悬浊液；
[0062](b)将所述悬浊液高速离心，使菌丝体与液体完全分开，形成上层液体和下层枯草芽孢杆菌菌丝体；高速离心转速为7000转/分钟，离心时间18分钟。
[0063](c)将所述上层液体除去，保留下层，即制得所述枯草芽孢杆菌湿菌丝体。
[0064](2)将步骤(1)中得到的菌丝体除去残留的碱性溶液，获得pH值中性的枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥；pH值中性指pH值在6至8之间。
[0065](3)将步骤(2)中获得的中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥干燥后粉碎得到所述的有机氮源。干燥温度为80摄氏度。
[0066]按照本实施例制备的有机氮源，检测其各项指标，结果如表1所示。
[0067]实施例3
[0068]所述有机氮源的制备方法，包括以下步骤:
[0069](1)用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其pH值在12，使得菌丝体中的核黄素溶出，得到不含核黄素的枯草芽孢杆菌菌丝体。
[0070]所述碱性溶液为3摩尔/升的氢氧化钠溶液。
[0071]所述枯草芽孢杆菌菌丝体，按照如下步骤制备:
[0072](a)采集生产核黄素过程中提取后的含有枯草芽孢杆菌菌丝体的悬浊液；
[0073](b)将所述悬浊液高速离心，使菌丝体与液体完全分开，形成上层液体和下层枯草芽孢杆菌菌丝体；高速离心转速为8000转/分钟，离心时间15分钟。
[0074](c)将所述上层液体除去，保留下层，即制得所述枯草芽孢杆菌湿菌丝体。
[0075](2)将步骤(1)中得到的菌丝体除去残留的碱性溶液，获得pH值中性的枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥；pH值中性指pH值在6至8之间。
[0076](3)将步骤(2)中获得的中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥干燥后粉碎得到所述的有机氮源。干燥温度为90摄氏度。
[0077]按照本实施例制备的有机氮源，检测其各项指标，结果如表1所示。
[0078]表1:
[0079]
【权利要求】
1.一种有机氮源，其特征在于，所述氮源为枯草芽孢杆菌干粉制剂，其总氮含量在6%至9%之间，氨基氮含量在2%至3%之间，蛋白质水解度在20%至50%之间。
2.如权利要求1所述的有机氮源的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)用碱性溶液洗涤枯草芽孢杆菌菌丝体，调节其PH值在10至12之间，使得菌丝体中的核黄素溶出，得到不含核黄素的枯草芽孢杆菌菌丝体； (2)将步骤(1)中得到的菌丝体除去残留的碱性溶液，获得中性枯草芽孢杆菌湿菌丝体泥； (3)将步骤(2)中获得的枯草芽孢杆菌菌丝体泥，干燥后粉碎得到如权利要求1所述的有机氮源。
3.如权利要求2所述的有机氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的枯草菌菌丝体，按照如下步骤制备: Ca)采集生产核黄素过程中提取后的含有枯草芽孢杆菌菌丝体的悬浊液； (b)将所述悬浊液高速离心，使菌丝体与液体完全分开，得到上层液体和下层枯草芽孢杆菌菌丝体； (C)将所述上层液体除去，保留下层，即制得所述枯草芽孢杆菌菌丝体。
4.如权利要求3所述的有机氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的枯草菌菌丝体的制备步骤中，步骤(b)高速离心转速为6000至8000转/分钟，离心时间15分钟至20分钟。
5.如权利要求2所述的有机氮源的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
6.如权利要求2所述的有机氮源的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的干燥温度为70°C至 90°C。
7.如权利要求1所述的有机氮源应用于发酵法生产核苷类产品。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，如权利要求7所述的有机氮源分批添加到发酵培养基中。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述有机氮源分2次添加到发酵培养基。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述有机氮源分2次添加的时间分别是发酵起始和产苷高峰期。
【文档编号】C12R1/125GK103923855SQ201410141566
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】何峰, 何谧, 刘守德, 田洪敏, 李 和, 项磊, 刘幸 申请人:湖北普信工业微生物应用技术开发有限公司