一种产连翘脂苷a、b和连翘苷的连翘内生真菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用，属于生物【技术领域】。该内生真菌为枝状枝胞菌（Cladosporium cladosporioides）LQ-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No.8728；可以代谢产生与连翘成分相同的成分，具有较强的灭菌、抑菌作用，发酵培养后能够产生对致病性大肠杆菌（E.coli K99，ATCC hb-8178）、沙门氏菌（Salmonella.Typhimurium，ATCC 14028）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus，ATCC 29213）等有抑制作用的活性代谢产物，包括连翘脂苷A、B和连翘苷等，是医药行业重要的微生物资源。
CGMCC No.8728
2014.01.15
【专利说明】一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 从微生物中寻找能应用于农业和医药的天然产物是一个不断变化发展的过程。这 些潜在的菌种资源对研究生物多样性、发现新化合物和开发新药都具有重要的意义。内生 真菌次生代谢产物的化学结构多样性也蕴藏着其生物活性的多样性，在农业和医药业中具 有重要的应用潜力。在过去70多年中，已从微生物中发现了 3万?5万种天然产物，其中 1万多种有生物活性，8千多种具有抗菌或抗肿瘤活性。从微生物中获得的抗生素、抗肿瘤 齐U、杀虫剂、以及微生物产生的酶、维生素和氨基酸等都有广泛应用。
[0003] 植物内生真菌是个巨大的微生物新资源，具有重要的农药和医药应用潜力。从特 殊生境植物和传统的药用植物内生真菌次生代谢产物中筛选具有药用价值的活性物质或 新型化合物以创制新药，解决自然资源不足，开发紧缺及新型药物，将在很大程度上丰富人 类的药物宝库。
[0004] 连翘出自《神农本草经》，其别名又有旱连子、空翘、落翘、黄奇丹，为植物连翘的干 燥果实。其对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌、人型结核杆菌、百日咳杆菌，以及流 感病毒、真菌、鼻病毒等均有抑制作用。能明显抑制炎性渗出和增强小鼠吞噬炎症细胞能 力。水溶液能降压，所含芦丁能增强毛细血管致密度。此外，还有解热、利尿、镇吐、抗肝损 伤等作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌。
[0006] 同时，本发明还提供一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌，所述的连翘内生真菌为枝状枝孢 (Cladosporium cladosporioides)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号： CGMCCNo. 8728。
[0009] 一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，具体的，连翘内生真菌在 生产药物活性成分(连翘脂苷A、B和连翘苷）中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌 (CGMCC No. 8728)发酵培养液，分离药物活性成分即可。更具体的，连翘内生真菌在制备药 物中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌（CGMCC No. 8728)发酵培养液，分离药物活性 成分，与辅料混合即可。
[0010] 所述的药物活性成分为连翘脂苷A、连翘脂苷B和连翘苷，经分离、纯化后，可以按 照常规方法制备成片剂、颗粒剂、粉剂、注射液、口服液、脂质体等剂型。所述的辅料为医药、 农药领域常规辅料。当制备成注射液时，辅料可采用甘露醇、葡萄糖、山梨醇等，片剂时采用 淀粉、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素等；口服液时采用油性基质如脂肪酸、脂肪酸甘油酯等。
[0011] 所述发酵培养液的制备方法为：取经活化的连翘内生真菌置于PDB培养基中，在 27?29°C下震荡培养4?7天即可。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 本发明中连翅内生真菌为枝胞菌黑霉菌（Cladosporium cladosporioides)，从河 南省洛阳市周山风景区的连翘活体中分离得到，属于一种共生微生物，可以代谢产生与连 翘成分相同的成分，具有很强的杀灭和抑制细菌的作用，发酵培养后能够产生对致病性大 肠杆菌（E. coli K99, ATCC hb-8178))、沙门氏菌（Salmonella. Typhimurium，ATCC14028)和 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus, aureus，ATCC29213)等有抑制作用的活性代谢产物，包 括连翘脂苷A、B和连翘苷等，是医药行业重要的微生物资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1中连翘内生真菌在IOOX油镜下的菌株形态图；
[0015] 图2为实施例1中连翘内生真菌18s rDNA PCR扩增产物的电泳图；
[0016] 图3为实施例1中连翘内生真菌的系统发育树图；
[0017] 图4中实施例2中连翘内生真菌的抑菌效果图；
[0018] 图5为实施例2中连翘内生真菌发酵上清液的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0019] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0020] 实施例1
[0021] 本实施例中产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌，为枝状枝胞菌 (Cladosporium cladosporioides)LQ_l，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No. 8728。该菌株是从河南省洛 阳市周山风景区连翘活体中分离得到。
[0022] 所述连翘内生真菌的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0023] (1)连翘组织预处理：采集新鲜无虫害的连翘茎、叶和花，用无菌水将表面的尘土 冲洗干净，放入超净工作台，切成2cm的片段；
[0024] (2)连翘组织的表面消毒：将步骤（1)中采集的组织在无菌操作台上进行表面消 毒，先用75%的酒精浸泡4min(3?5min均可),然后用无菌水漂洗4次（3?4次均可),再 在0. 1%的升萊中浸泡4min (3?5min均可)，最后用无菌水漂洗5次，阴干待用；
[0025] (3)检验消毒效果：取步骤（2)中最后一次无菌水冲洗液，涂布到PDA平板上，37°C 培养3天，检验灭菌效果，发现培养皿中无菌落出现，证明组织表面灭菌彻底(否则该分离 结果不能使用）；
[0026] (4)连翘组织内生菌的培养：检验合格后，将步骤（2)中表面消毒过的叶和花在超 净工作台上用灭菌的解剖刀切成0. 5cmX0. 5cm大小的薄片，茎则用无菌刀片除去外皮层， 分内皮层、韧皮部和木质部各切成Icm长的片段，然后从纵切方向剪为4个部分，将小块样 品紧贴于PDA培养基平板上，每个平板接种2片（1?2片均可)，做4个重复，置于28°C恒 温培养箱中避光培养6天（5?7天均可）；
[0027] (5)连翘内生菌的分离纯化：待步骤（4)中材料周围长出菌落时，采用尖端菌丝 挑取法对所分离的不同形态的内生真菌于PDA固体培养基平板上用划线分离法进行纯化， 28°C恒温培养6天（5?7天均可)，直到分离得到单菌落；
[0028] (6)连翘分离菌的镜检：挑取步骤（5)中的单菌落固定在载玻片上，用革兰氏染色 法进行染色(草酸铵结晶紫染色lmin，自来水冲洗，碘液染lmin，水洗，95%的酒精脱色20s， 水洗，番红复染2min，水洗)，干燥后，滴加香柏油，在高倍镜下观察菌落形态（图1所示为 100X油镜下连翘内生菌菌丝形态)，并根据其菌落特征和菌丝特点，对所分离到的内生真 菌进行初步分类鉴定，见图1 (图中LQ-I的菌丝在100X油镜下呈长杆状，无隔，有少量分 支）；
[0029] (7)连翘分离菌的保存：挑取步骤（6)中镜检时所用的菌丝接种于含有PDB培养基 的三角瓶中，在37°C、150r/min摇床中培养12h，至细菌长到对数期，蘸取菌悬液接种于PDA 斜面培养基上，37°C培养3天（2?4天均可)，再转移到4°C的冰箱中斜面真空冷冻干燥保 存备用。
[0030] 所述连翘内生真菌的分子生物学鉴定方法，包括以下步骤：
[0031] (1)连翘内生真菌的活化：将保存的连翘内生真菌菌种用平板划线法接种在PDA 平板上，在28°C恒温条件下倒置培养，待菌落生长成熟后，保存待用；
[0032] (2)连翘内生真菌基因组DNA的提取，采用CTAB法提取连翘内生真菌的rDNA，具 体操作步骤如下：
[0033] 1)取步骤（1)中活化的少量孢子(约0.2g)置于研钵内，加入IOOOiiL IXCTAB提 取液，研磨；
[0034] 2)将研磨混合液转入I. 5mL离心管中，并向离心管中再加入300 ii L IXCTAB提取 液，轻轻摇动，再将管置于65°C水浴中消化lh，在此过程中轻轻摇动3次（2?3次均可）；
[0035] 3)加入等体积预冷的苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1 )，摇匀，12000rpm离心 lOmin，将上清液移至干净的离心管中；
[0036] 4)在步骤3)上清液中加入等体积预冷的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，并剧烈振 荡使之形成悬乳状，12000rpm离心lOmin，将上清液移至干净的离心管中；
[0037] 5)重复3)、4)步骤，最终收集得到上清液；
[0038] 6)在步骤5)上清液中加人3mol/L NaAc使溶液终浓度为0? lmol/L，再加入2倍 体积预冷的无水乙醇，上下转动混匀，放入_20°C冰箱过夜，沉淀DNA，沉淀完毕于12000rpm 离心15min，收集沉淀；
[0039] 7)弃去上清后，用预冷75%的乙醇洗涤DNA沉淀，然后弃去冷乙醇，共洗涤3次；
[0040] 8)将管中乙醇倒净后，将管倒置在吸水纸上，使乙醇完全挥发；
[0041] 9)加入30 ii L TE缓冲液溶使DNA沉淀，-20°C保存备用；
[0042] (3 )PCR扩增连翘内生真菌rDNA，采用真菌通用引物ITSl和ITS4在PCR仪上完成 PCR扩增，基因扩增反应体系（50 iiL)如下：
[0043]
【权利要求】
1. 一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌，其特征在于：所述的连翘内生真菌 为枝状枝胞菌（Cladosporium cladosporioides) LQ-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCCNo. 8728。
2. -种如权利要求1所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特征 在于：所述的连翘内生真菌在生产药物活性成分中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真 菌发酵培养液，分离药物活性成分即可。
3. 根据权利要求2所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特征在 于：所述的连翘内生真菌在制备药物中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌发酵培养 液，分离药物活性成分，与辅料混合即可。
4. 根据权利要求2或3所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特 征在于：所述的药物活性成分为连翘脂苷A、连翘脂苷B和连翘苷。
5. 根据权利要求2或3所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其 特征在于：所述发酵培养液的制备方法为：取经活化的连翘内生真菌置于PDB培养基中，在 27?29°C下震荡培养4?7天即可。
【文档编号】C12R1/645GK104293678SQ201410149031
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】牛明福, 万鹏, 张婷婷, 李鑫玲, 秦翠丽, 宫强, 张敏, 孙军杰, 李翔 申请人:河南科技大学