一种小鼠rankl突变体及其表达载体的构建、表达及应用的制作方法
【专利摘要】本发明所述的小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用中，提供了一种小鼠RANKL突变体、小鼠RANKL突变体的表达载体的构建方法以及所述小鼠RANKL突变体的表达载体转染入细胞的制备方法，还提供了表达小鼠RANKL突变体的表达载体的细胞和表达系统，解决了现有技术中不能方便、高效的对小鼠RANKL进行研究的问题。
【专利说明】一种小鼠 RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物学、分子生物学及基因工程【技术领域】，具体涉及一种具有生物 活性的不同半胱氨酸位点（Cys)突变的小鼠核因子κΒ受体活化因子配基（RANKL)的突变 体及其载体的构建、表达及应用。
【背景技术】
[0002] 骨骼具有为了自身的形态变化和维持血钙浓度而重复形成和吸收、进行重建的特 征。正常的骨豁通过由成骨细胞、骨细胞介导的骨形成及由破骨细胞介导的骨吸收而处于 动态平衡状态。骨骼动态平衡的维持是一个多因素、多环节的复杂调控过程，而成骨细胞、 骨细胞与破骨细胞间的信号耦联是核心。这种信号耦联是由一系列的分泌性蛋白在起着关 键的调控作用，而其中最为重要的便是到目前为止研究最为透彻的核因子κΒ受体活化因 子配基（receptor activator of NF_K：Bligand，RANKL)。
[0003] 在骨骼系统中，RANKL主要由成骨细胞、骨细胞表达和分泌，它通过与破骨细胞表 面的RANK蛋白（即RANKL的受体)相互作用进而调节破骨细胞的分化成熟。同时，成骨细胞 还会分泌骨保护素蛋白（0PG)，它通过与RANK蛋白竞争结合RANKL，从而起到抑制破骨细胞 分化成熟的作用。一系列研究已经充分表明，RANKL/RANK/0PG信号体系在成骨细胞-破骨 细胞耦联及骨骼代谢平衡中具有核心作用。但是，相较于已被充分阐释的RANKL-RANK相互 作用后导致破骨细胞分化成熟的信号机制，RANKL蛋白在成骨细胞内的定位情况及其影响 机制目前尚不清楚。
[0004] RANKL蛋白在体内存在两种形式：全长RANKL及可溶性RANKL (soluble RANKL， sRANKL)。其中，小鼠 RANKL蛋白全长316个氨基酸，人RANKL蛋白全长317个氨基酸，两者 同源性达84%。而sRANKL则是分泌至细胞外的RANKL，它由一系列的蛋白酶如TACE、ADAM10 和MMP-14等对全长RANKL进行剪切得到，剪切位点在小鼠 RANKL的139Phe，在人RANKL的 140Ile。RANKL 蛋白具有典型的 TNF 结构域，与 TNFalpha、CD401igand、Apo2L (TRAIL)及 Fas ligand(FasL)等同属TNF家族。此外，全长RANKL还包括茎状结构区、一段短片段的疏 水性跨膜区和位于RANKL氨基端1-48的低复杂性氨基酸序列。TNF结构域是RANKL-RANK及 RANKL-0PG的相互作用区，是调控破骨细胞分化成熟的关键部位；225Glu、222Arg、299Asp 氨基酸对于RANKL-RANK的相互作用是关键的。研究发现，RANKL-0PG的相互作用对于RANKL 在细胞（Hela细胞、原代成骨细胞和骨细胞）内的定位至关重要，0PG使RANKL定位于细胞 溶酶体中，而CRD结构域（RANKL-0PG相互作用的关键区域）缺失的0PG蛋白则不具有这种 作用。但是否有其它因素影响RANKL在成骨细胞内的定位及分泌还有待于进一步的研究。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的问题在于提供一种小鼠 RANKL突变体以及表达该突变 体的表达载体和表达系统，进而便于更准确、方便、高效的研究不同Cys位点突变对小鼠 RANKL蛋白表达及定位的影响。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠 RANKL突变体，其氨基酸序列如 SEQ. ID NO ：USEQ. ID NO ：2,SEQ. ID NO ：3,SEQ. ID NO ：4,SEQ. ID NO ：5,SEQ. ID NO ：6,SEQ. ID NO ：7, SEQ. ID NO ：8,SEQ. ID NO ：9,SEQ. ID NO ：10,SEQ. ID NO ：1USEQ. ID NO ：12,SEQ. ID NO : 13、SEQ. ID NO :14 或 SEQ. ID NO :15 中任一所示。
[0007] 本发明还提供了一种编码上述小鼠 RANKL突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ. ID NO ：16, SEQ. ID NO ：17,SEQ. ID NO ：18,SEQ. ID NO ：19,SEQ. ID NO ：20,SEQ. ID NO ：2USEQ. ID NO :22、SEQ. ID NO :23、SEQ. ID NO :24、SEQ. ID NO :25、SEQ. ID NO :26、SEQ. ID NO :27、 SEQ. ID NO :28、SEQ. ID NO :29 或 SEQ. ID NO :30 中任一所示。
[0008] 本发明提供了一种含有编码上述小鼠 RANKL突变体的基因的表达载体。
[0009] 所述的表达载体为带有EGFP标签的载体。所述的EGFP标签(增强型绿色荧光蛋 白Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP)是一种优化的突变型绿色突光蛋白，其突 光比野生型强35倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点。EGFP标签可位于蛋 白质的C端或N端，该系统已被广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞 等。结合荧光显微镜，EGFP表达系统可用于检测基因表达效率、和目的蛋白融合表达以检 测目的蛋白的表达和分布以及细胞示踪标记等研究。相应的EGFP标签抗体不仅可以检测 EGFP蛋白，也可以检测和EGFP融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检 测EGFP融合表达蛋白等。
[0010] 所述表达载体是通过将编码上述小鼠 RANKL突变体的基因克隆至PEGFP-C1载体 中的MCS区域获得的。
[0011] 本发明提供了一种含有所述的表达载体的重组细胞，所述重组细胞为由上述的表 达载体转染的HEK293细胞。所述HEK293细胞株来源于人胚肾上皮细胞，其极少表达细胞 外配体所需的内生受体，由于容易转染且容易培养，常被用于转染试验，是一个很常用的表 达研究外源基因的细胞株。
[0012] 本发明提供了一种构建上述重组细胞的方法，取上述的表达载体转染入HEK293 细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有EGFP标签的小鼠 RANKL突变体的细胞。
[0013] 本发明提供了一种所述的重组细胞在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀 试验中的应用。
[0014] 本发明提供了一种重组细胞表达系统，所述表达系统为分别将上述的各个表达载 体转染入细胞得到的细胞总和。
[0015] 本发明提供了一种所述的表达系统在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀 试验中的应用。
[0016] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0017] (1)本发明所述的小鼠 RANKL突变体，提供了一种将小鼠 RANKL蛋白中位于不同位 点的半胱氨酸（Cys)位点选择性突变为甘氨酸（Gly)的小鼠 RANKL突变体，从而可以方便 的、高效的研究不同半胱氨酸（Cys)位点突变对小鼠 RANKL蛋白表达及定位的影响；
[0018] (2)本发明表达带有EGFP标签的小鼠 RANKL突变体的细胞可表达产生小鼠全长 RANKL及小鼠可溶性RANKL蛋白，且小鼠全长RANKL的N端融合了 EGFP标签，表达产生的全 长RANKL发绿色荧光，可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下直观检测不同Cys位点突变了的 小鼠 RANKL蛋白的表达及亚细胞的定位，从而可以方便、高效的研究不同Cys位点突变对小 鼠 RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；
[0019] (3)本发明所述的表达带有EGFP标签的小鼠 RANKL突变体的表达系统，该系统为 具有生物活性的、带有EGFP标签、不同半胱氨酸位点（Cys)突变的小鼠核因子κ B受体活 化因子配基（RANKL)的表达系统，通过该表达系统可以进一步研究不同Cys位点突变对小 鼠 RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；
[0020] (4)本发明所述的小鼠 RANKL突变体的表达载体的构建方法可采用现有技术的常 规方法进行处理，步骤简单易于操作，耗时短，可以快速的获得小鼠 RANKL突变体的表达载 体；
[0021] (5)本发明所述的带有EGFP标签的小鼠 RANKL突变体可以通过现有技术的常规方 法进行稳定的表达，进而方便研究小鼠 RANKL蛋白相关生理生化特征影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0023] 图1为实施例1的PCR克隆获得小鼠 RANKL基因片段的电泳结果；
[0024] 图2为实施例1的重组pEGFP-RANKL载体的限制性内切酶鉴定结果；
[0025] 图3为实施例2的使用多位点定点突变方法获得的8种小鼠 RANKL突变体的表达 载体的限制性内切酶鉴定结果；
[0026] 图4为实施例2的使用单位点定点突变方法获得的7种小鼠 RANKL突变体的表达 载体的限制性内切酶鉴定结果；
[0027] 图5为实施例3的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠 RANKL突变体的 重组细胞的RT-PCR鉴定结果；
[0028] 图6为实施例3的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠 RANKL突变体的 重组细胞的荧光显微镜观察拍照结果；
[0029] 图7为实施例4的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠 RANKL突变体的 重组细胞产生可溶性RANKL蛋白的ELISA实验结果；
[0030] 图8为实施例4的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠 RANKL突变体的 重组细胞诱导破骨细胞分化的实验结果。
【具体实施方式】
[0031] 本发明的下述实施例中所用的试剂、载体、蛋白、细胞等均为市售产品，不同厂家、 不同型号的下述试剂、载体、蛋白、细胞均可实现本发明的目的，效果并无明显差异，本发明 的下述各实施例仅以如下型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白、细胞为代表，进行技术效果 的阐述，并不局限于以下所列举的型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白或细胞。
[0032] 质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、核酸纯化试剂盒均购自上海生工生物 工程有限公司；
[0033] pMD 19_T Simple Vector、TaKaRa LA Taq、TaKaRa MutanBEST Kit、TRACP 染色试 剂盒、T4DNA连接酶、各种限制性内切酶以及E. coli Competent CellsJM109均购自TaKaRa 公司；
[0034] 1Kb plus DNA Ladder、Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司；
[0035] pEGFP-Cl 载体购自 Clontech 公司；
[0036] UAMS-32、HEK293、RAW264. 7 细胞购自美国 ATCC 公司；
[0037] 胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产品；
[0038] G418 购自 Sigma 公司；
[0039] α -MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS)、胰酶购自GIBC0公司；
[0040] 总RNA抽提试剂Beyozol购自碧云天公司；
[0041] cDNA反转录试剂盒购自美国Applied biosystems公司；
[0042] 引物合成及DNA测序服务均由上海生工生物工程有限公司提供；
[0043] 多位点定点突变试剂盒 QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (210515)购自 Agilent 公司；
[0044] 小鼠 RANKL定量检测ELISA试剂盒为美国R&D公司产品。
[0045] 本发明下述实施例中所述的Kan+LB平板培养基为按照现有技术中常规方法制 备，以本发明下述各实施例而言，所述Kan+LB平板培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵 母提取物，l〇g/L氯化钠，20g/L琼脂粉，30 μ g/ml卡那霉素。
[0046] 本发明下述实施例中所述的细胞培养条件，如无特别说明，所有细胞均在37°C、 5%C0 2条件下培养，所用培养基组成均为：90%DMEM，10%FBS，100U/ml青霉素，0. lmg/ml链霉 素。
[0047] 实施例1小鼠 pEGFP-RANKL载体构建
[0048] 培养小鼠成骨细胞样细胞UAMS-32,所用培养基组成为：90% α -MEM，10%FBS， 100U/ml青霉素，0. lmg/ml链霉素。将UAMS-32细胞铺60mm培养皿，细胞长满后提取总RNA， 然后反转录成cDNA，以此cDNA为模板，进行PCR反应，所用引物为RANKLFor :
[0049] 5,-ATCTCGAGCTATGCGCCGGG-3' 和 RANKLRev :
[0050] 5' -TTCGAAGCTTGTCAGTCTATGTCCTG-3'，上述带下划线碱基分别为引入的Xho I和 Hind III限制性内切酶的识别位点。
[0051] 所述 PCR 反应体系为：2XGCbufTer I 25 μ L，cDNA template 1 μ L，primers (1(^]\〇各14 1^，(1^1311^叉（2.51111)8 4 1^，丁&1^1^1^了&9〇.5 4 1^，（1〇1*16-(^8衍116(1!120 补至 50μ L ;所述 PCR 反应条件为：94°C预变性 5min，94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，30 个 循环，72 °C延伸7min ;所述PCR反应结束后，对上述步骤获得的PCR反应液进行1%琼脂糖 凝胶电泳检测，检测结果见图1，结果表明扩增获得了长度约为966bp的基因片段(泳道1为 1Kb plus DNA Ladder，泳道2为PCR结果，箭头所示为长度约为966bp的基因片段)，切胶 回收并纯化该基因片段，然后使用限制性内切酶Xho I和Hind III双酶切该基因片段，同时 使用限制性内切酶Xho I和Hind III双酶切pEGFP-Cl载体质粒，使用核酸纯化试剂盒分别 对上述酶切的基因片段和质粒载体进行纯化后，利用T4连接酶连接上述纯化后的基因片 段和质粒载体，将连接产物转化JM109感受态细胞，挑取克隆，提质粒，对质粒用Xho I和 Hind III进行双酶切检验，电泳结果见图2,将酶切结果为含有966bp和4. 7kb两条片段的质 粒(见图2第3、5、7泳道，泳道1为1Kb plus DNA Ladder)进行测序验证，结果表明获得了 含有正确的小鼠 RANKL基因的重组载体pEGFP-RANKL。
[0052] 实施例2不同Cys位点突变的小鼠 RANKL基因及其表达载体的获得
[0053] 利用Agilent多位点定点突变试剂盒对小鼠 RANKL基因片段的不同Cys位点进 行定点突变，将RANKL基因片段中Cys的密码子序列tgc置换成Gly的密码子序列ggc，所 使用的定点突变引物使用Agilent公司定点突变引物设计软件（https://www. genomics, agilent. com/primerDesignProgra m. jsp)设计获得（见表 1):
[0054] 表1多位点定点突变引物
【权利要求】
1. 一种小鼠 RANKL突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ. ID NO :1、SEQ. ID NO :2、 SEQ. ID NO ：3,SEQ. ID NO ：4,SEQ. ID NO ：5,SEQ. ID NO ：6,SEQ. ID NO ：7,SEQ. ID NO ：8,SEQ. ID NO :9、SEQ. ID NO :10、SEQ. ID NO :11、SEQ. ID NO :12、SEQ. ID NO :13、SEQ. ID NO :14 或 SEQ. ID NO :15 中任一所示。
2. -种编码权利要求1所述突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID NO: 16、SEQ. ID NO : 17、SEQ. ID NO : 18、SEQ. ID NO : 19、SEQ. ID NO :20、SEQ. ID NO :21、SEQ. ID N0:22、SEQ.IDN0:23、SEQ.IDN0:24、SEQ.IDN0:25、SEQ.IDN0 :26、SEQ.IDN0:27、SEQ. ID NO :28、SEQ. ID NO :29 或 SEQ. ID NO :30 中任一所示。
3. -种含有权利要求2所述的基因的表达载体。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为带有EGFP标签的载 体。
5. 根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是通过将权利要求 2所述的基因克隆至pEGFP-Cl载体中的MCS区域获得的。
6. -种含有权利要求3-5任一所述的表达载体的重组细胞，其特征在于，由权利要求 3-5任一所述的表达载体转染的HEK293细胞。
7. -种构建权利要求6所述重组细胞的方法，其特征在于，取权利要求3-5任一所述 的表达载体转染入HEK293细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有EGFP标签的小鼠 RANKL 突变体的细胞。
8. -种如权利要求6所述的重组细胞在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试 验中的应用。
9. 一种重组细胞表达系统，其特征在于，所述表达系统为分别将权利要求3-5任一所 述的各个表达载体转染入细胞得到的细胞总和。
10. -种如权利要求9所述的表达系统在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试 验中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK104059141SQ201410148903
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】彭莹, 邓黎莉, 吴郁, 陈全成, 丁月娣, 束婷婷, 付强 申请人:江苏省原子医学研究所