一种化脓隐秘杆菌lamp检测用引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法，是通过A.pyogenes的PLO基因序列设计lamp引物，所建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的化脓隐秘杆菌LAMP可视化检测方法。本发明设计和筛选的6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；环引物的加入扩增效率大大提高，耗时短。
【专利说明】—种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化脓隐秘杆菌检测【技术领域】，涉及一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法。
【背景技术】
[0002]化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes, A.pyogenes)是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌，曾经被认为是化脓棒状杆菌，而后被分类到放线菌属。Ramos根据16S rRNA基因进行系统进化分析后将其重新分类到隐秘杆菌属。化脓隐秘杆菌常寄生于上呼吸道、消化道等黏膜处，是一种条件性致病菌，能引起多种动物如猪、牛、羊、禽和人类的多种器官、黏膜的化脓性感染，如肺炎、乳房炎、子宫内膜炎、关节炎、外耳炎、膀胱炎及肝脏、肾脏脓肿等症状。唐婕等报道了化脓隐秘杆感染林麝可引起其颌下、鼻镜等处的脓肿。且与大肠杆菌、链球菌等混合存在，使感染加重，可导致麝的死亡，给麝养殖业带来较大的经济损失。
[0003]已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子主要有溶血素(PLO)、神经氨酸酶(Nan)、胶原结蛋白(CbpA)及菌毛合成蛋白(Fim),其最主要的致病因子是细胞外毒素溶血素Pyolysin(PLO)0 1997年，Billington等从野生型化脓隐秘杆菌BBRl中克隆了 PLO全基因，并测定其核苷酸序列。
[0004]目前，化脓隐秘杆菌诊断技术主要有传统的细菌生化鉴定和PCR方法。传统细菌培养及生化鉴定需较长的时间，PCR检测需进行电泳及PCR仪等仪器，不便于目前野外临床快速的检测。
[0005]2000 年，Notomi 等开发了环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP),其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶在约62°C进行等温扩增。该方法具有灵敏度高，特异性好，反应时间短，判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，广泛应用于病毒、细菌、寄生虫的诊断。
【发明内容】
[0006]本发明解决的问题在于提供一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用弓丨物及检测方法，从而能够对化脓隐秘杆菌进行特异性强、灵敏度高的快速检测，而且还能够适用于野外临床样品的可视化检测。
[0007]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0008]一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物，包括以下3对引物:F3和B3、FIP和BIPl μ L、FLP和BLP ;其核苷酸序列分别为:
[0009]FIP:ttgcctccag ttgacgctta atagcaagta tcctgaccat g ；
[0010]BIP:aaggtctcag ccaagctcaa cgaaggaagc gatagccac ；
[0011]F3:taaggtcgtc atcaacaatc c ；
[0012]B3:tatgtggaga tgtcggtgta ；[0013]LoopF:cgtcaccata gtctcatcgt ag ；
[0014]LoopB:acttcgatgc aattcataag eg。
[0015]一种基于权利要求1所述化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物的试剂盒，包括:
[0016]IOXThermopol buffer2.5 μ L.5 μ M 的 F3 和 Β3 各 1μL、40μΜ 的 FIP 和 BIP各 I μ L、20 μ M 的 FLP 和 BLP 各 I μ L、IOmM 的 dNTPs4 μ L、5M 的甜菜碱 5 μ L、IOOmM 的MgSO4I μ L、8U/μ L 的Bst DNA polymerasel μ L、2 μ LDNA模板和 3.5 μ L ddH20 ;共计 25yL。
[0017]一种化脓隐秘杆菌LAMP检测方法，包括以下操作:
[0018]I)提取待检测对象的DNA模板；
[0019]2)将以下组份进行混合，构建25 μ L的LAMP反应体系:
[0020]IOXThermo 各 I μ L、20 μ M 的 FLP 和 BLP 各 I μ L、IOmM 的 dNTPs4 μ L、5M 的甜菜碱 5 μ L、IOOmM 的MgS041 μ L、8U/ μ L 的 Bst DNA polymerasel μ L、2 μ L DNA 模板和 3.5 μ L ddH20 ；
[0021]F3和B3、FIP和BIPl μ L、FLP和BLP的核苷酸序列分别如SEQ.1D.N0.1~6所示；
[0022]3)将LAMP反应体系在63°C恒温反应60min，然后85°C加热2min，反应完成；
[0023]4)待反应完成后通过以下两种方式进行结果的判定:
[0024]方式之一:向反应终体系加入显色液，I~5min后观察是否有颜色的变化，若反应体系颜色发送变化则为阳性反应，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；若反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明待测对象中未检测到脓隐秘杆菌；
[0025]方式之二:将反应终体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果呈梯形条带，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；否则表明待测对象中未未检测到化脓隐秘杆菌。
[0026]所述的待检测对象的DNA模板的提取为:
[0027]将待测对象的组织液或化脓液接种于新鲜的BHI培养基中，37°C微需氧条件下培养48h，取菌液离心取上清；用DNA试剂盒提取DNA，或者将菌液煮沸IOmin离心取上清作为含DNA模板的提取液。
[0028]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0029]本发明提供的化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法，是通过A.pyogenes的PLO基因序列设计lamp引物，所建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的化脓隐秘杆菌LAMP可视化检测方法，具有以下显著的优势:
[0030](I)本发明设计和筛选的6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了 LAMP扩增的高度特异性；
[0031](2)环引物的加入扩增效率大大提高，耗时短，在Ih可将靶序列扩增至IO9倍；
[0032](3)在等温条件下采用特异性酶进行扩增，对实验仪器要求低，检测成本低；
[0033](4)通过加入显色液，可通过肉眼快速观察结果，利于现场的临床样品快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为各引物在PLO基因序列中对应的位置；
[0035]图2A、图2B分别为化脓隐秘杆菌LAMP方法的特异性检测结果；其中，M:marker,天恩泽基因70503x ；1:阴性对照；2:化脓隐秘杆菌标准菌株；3:沙门氏菌；4:霍乱弧菌；5:单增李斯特氏菌；6:表皮葡萄球菌；7:金黄色葡萄球菌；8:嗜水气单孢菌；9:副溶血性弧菌；10:蜡样芽孢杆菌；
[0036]图3A、图3B分别为化脓隐秘杆菌LAMP方法的灵敏度检测结果；
【具体实施方式】
[0037]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0038]本发明通过A.pyogenes的PLO基因序列设计ILAMP引物，通过LAMP检测方法建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的化脓隐秘杆菌可视化检测方法。
[0039]化脓隐秘杆菌溶血素(Pyoly sin, PL0)是化脓隐秘杆菌一个主要的致病因子，PLO基因为化脓隐秘杆菌的特异性基因，目前对所有化脓隐秘杆菌分离株的检测发现，它们都能产生PLO。PCR等技术鉴定该菌大多采用该基因。
[0040]针对A.pyogenes 的 PLO 基因(编号:US4782,长度 l623bp),米用 PrimerExploerV4软件设计进行设计，通过筛选得到一套特异性的LAMP引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP, BIP以及环引物LoopF, Loop B，具体的引物序列见图1、表1和SEQ.1D.N0.1~6。所选择的引物能进行LAMP扩增并得到预期的扩增片段。
[0041 ] 表1扩增PLO基因的LAMP弓丨物序列
[0042]
【权利要求】
1.一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物，其特征在于，包括以下3对引物:F3和B3、FIP和BIPl μ L、FLP和BLP ;其核苷酸序列分别为:
FIP:ttgcctccag ttgacgctta atagcaagta tcctgaccat g ；
BIP:aaggtctcag ccaagctcaa cgaaggaagc gatagccac ；
F3:taaggtcgtc atcaacaatc c ；
B3:tatgtggaga tgtcggtgta ；
LoopF:cgtcaccata gtctcatcgt ag ；
LoopB:acttcgatgc aattcataag eg。
2.一种基于权利要求1所述化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物的试剂盒，其特征在于，包括:
IOXThermopol buffer2.5 μ L、5 μ M 的 F3 和 Β3 各 I μ L、40yM 的 FIP 和 BIP 各 I μ L、20 μ M 的 FLP 和 BLP 各 I μ L、IOmM 的 dNTPs4 μ L、5M 的甜菜碱 5 μ L、IOOmM 的 MgSO4I μ L、8U/μ L 的 Bst DNA polymerasel μ L、2 μ LDNA 模板和 3.5 μ L ddH20 ;共计 25 μ L。
3.一种化脓隐秘杆菌LAMP检测方法，其特征在于，包括以下操作: 1)提取待检测对象的DNAI旲板； 2)将以下组份进行混合，构建25μ L的LAMP反应体系:
IOXThermopol buffer2.5 μ L、5 μ M 的 F3 和 Β3 各 I μ L、40yM 的 FIP 和 BIP 各 I μ L、20μ M 的 FLP 和 BLP 各 I μ L、IOmM 的 dNTPs4 μ L、5M 的甜菜碱 5 μ L、IOOmM 的 MgS041 μ L、8U/μ L 的 Bst DNA polymerasel μ L、2 μ LDNA 模板和 3.5 μ L ddH20 ； F3和Β3、FIP和BIPl μ L、FLP和BLP的核苷酸序列分别如SEQ.1D.N0.1~6所示； 3)将LAMP反应体系在63°C恒温反应60min，然后85°C加热2min，反应完成； 4)待反应完成后通过以下两种方式进行结果的判定: 方式之一:向反应终体系加入显色液，I~5min后观察是否有颜色的变化，若反应体系颜色发送变化则为阳性反应，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；若反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明待测对象中未检测到脓隐秘杆菌； 方式之二:将反应终体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果呈梯形条带，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；否则表明待测对象中未检测到化脓隐秘杆菌。
4.如权利要求3所述的化脓隐秘杆菌LAMP检测方法，其特征在于，所述的待检测对象的DNA模板的提取为: 将待测对象的组织液或化脓液接种于新鲜的BHI培养基中，37°C微需氧条件下培养48h，取菌液离心取上清；用DNA试剂盒提取DNA，或者将菌液煮沸IOmin离心取上清作为含DNA模板的提取液。
【文档编号】C12Q1/04GK103937889SQ201410148848
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】唐婕, 刘二龙, 卢丽, 夏健, 刘文华, 胡罕 申请人:陕西省动物研究所