一种2-甲基-l-色氨酸的酶法转化制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，将具有色氨酸合成酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含色氨酸合成酶的湿菌体；将上述湿菌体中加入转化液，所述转换液中包括：含L-丝氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一种；在20～50℃，pH5～12条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离得到2-甲基-L-色氨酸。本发明采用含色氨酸合成酶的特定菌株，在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶，使酶法合成2-甲基-L-色氨酸有较高的催化速率和转化率，L-丝氨酸摩尔转化率达到98％以上，酶法合成反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，适合工业化生产。
【专利说明】一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种2-甲基-L-色氨酸的转化方法，尤其涉及的是一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法。
【背景技术】
[0002]2-甲基-L-色氨酸是一种非蛋白质组成的氨基酸，L-2-甲基色氨酸是抗菌素硫链丝菌肽合成中重要中间体，中国发明专利:CN101914605，N-芴甲氧羰基-2-甲基色氨酸的合成方法，公开了含有L-2-甲基色氨酸寡肽化合物可以使亲躯体细胞(somatotrope)释放生长素，哺乳动物服用能诱导生长激素释放的化合物之后，动物体内生长素提高，使动物生长速度加快。2-甲基-L-色氨酸可用于医药领域和食品领域等，具有非常广泛的应用前景。
[0003]中国发明专利:CN101914605，N-芴甲氧羰基_2_甲基色氨酸的合成方法，报导了以2-甲基吲哚与福尔马林溶液及二甲胺合成2-甲基芦竹碱，再与乙酰氨基丙二酸二乙酯及硫酸二甲酯在强碱乙醇钠作用下生成中间体双酯，双酯用氢氧化钠溶液水解并在中性状态下脱羧得到中间体单酯，单酯通过α-糜蛋白酶水解拆分，获得D-N-乙酰-2-甲基色氨酸乙酯和L-N-乙酰-2-甲基色氨酸，然后用盐酸水解分别得到D-2-甲基色氨酸和L-2-甲基色氨酸。《苏州大学学报(自然科学版)》，2003，1:91-93中公开了以丁烯-2-酮，乙酰氨基丙二酸二乙酯以及苯肼为原料合成了非天然的N-乙酰基-DL-2-甲基-色氨酸的技术。
[0004]目前，我国2-甲基-色氨酸生产主要来源于化学合成法，该方法反应步骤多，操作难度大，生产成本高，不适合大规模工业化生产。而另一方面我国在氨基酸工业生产中，会产生大量不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的毛发酸水解液，该混合氨基酸料液直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，提高反应的催化速率和转化率。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤:
[0007](I)将具有色氨酸合成酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含色氨酸合成酶的湿菌体；
[0008](2)将上述湿菌体中加入转化液，所述转换液中包括:含L-丝氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一种；在20~50°C，pH 5~12条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离得到2-甲基-L-色氨酸。
[0009]所述步骤(1)中，具有色氨酸合成酶活性的菌株选自大肠杆菌ATCC15489、铜绿假单胞菌CGMCC NO:1.1129、施氏假单胞菌CGMCC NO: 1.202、枯草芽孢杆菌CGMCC NO: 1.1628中的一种。
[0010]所述步骤(1)中，培养基成分包括10~40g/L碳源物质、5~35g/L氮源物质、2.5g/L 柠檬酸、3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/LCoCl2,0.0OOlg/L MnC4H6O4.4H20，碳源物质采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种，氮源物质采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液中的一种或多种。
[0011]所述步骤(2)中，所述含L-丝氨酸的料液中L-丝氨酸的浓度为0.5~40.5g/L。
[0012]所述含L-丝氨酸的料液来源于毛发酸水解液或纯L-丝氨酸液；毛发酸水解液中总氨基酸的重量百分比为5%~45%，其中L-丝氨酸在总氨基酸中的重量百分比为10%~90%。
[0013]所述步骤(2)中，所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮，其浓度为0.001g/L~4.0g/L。
[0014]所述步骤⑵中，磷酸吡哆醛的浓度为0.2~0.8g/L，2-甲基吲哚的浓度为26.2 ~104.8g/L。
[0015]所述步骤(2)中，等电点结晶法的具体方法如下:
[0016]将酶促反应后的转化液3000~5000r/min离心10~20min,去除菌体细胞；加热
转化液，采用活性碳脱色，抽滤，滤液调至PH 5~6，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得2-甲基-L-色氨酸粗品，米用乙醇洗漆，真空抽滤，烘干得2-甲基-L-色氨酸精品。
[0017]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明采用含色氨酸合成酶的特定菌株，在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶，使酶法合成2-甲基-L-色氨酸有较高的催化速率和转化率，其中L-丝氨酸摩尔转化率达到98%以上； [0018]本发明采用含L-丝氨酸的毛发酸水解液为反应原料，价格低廉，并充分利用了工业副产物，解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸高效分离的难题，同时也为大规模低成本生产2-甲基-L-色氨酸提供了更为丰富的原料，具有良好的经济效益和社会效益；
[0019]酶法合成2-甲基-L-色氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0020]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0021]实施例1
[0022]本实施例包括以下步骤:
[0023](I)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体，加入到500mL转化液中，转化液中含21g的L-丝氨酸的毛发酸水解液、26.2g的2-甲基吲哚、0.2g/L的磷酸吡哆醛和0.005g/L的甲醇，pH8.0，37°C酶促反应12h，反应结束后转化液中2-甲基-L-色氨酸为42.7g，对L-丝氨酸摩尔转化率为98% ；
[0024](2)将转化液4000r/min离心10min,去除菌体细胞,加热,活性碳脱色，抽滤，滤液调pH5.5左右，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得39.5g 2-甲基-L-色氨酸粗品，质量浓度为95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得35.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，纯度为99.9 %。
[0025]本实施例的培养基成分包括40g/L碳源物质、35g/L氮源物质、2.5g/L柠檬酸、3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物质采用葡萄糖和麦芽糖，氮源物质采用牛肉膏和酵母膏。
[0026]实施例2[0027]本实施例包括以下步骤:
[0028](I)将1000mL铜绿假单胞菌CGMCC NO:1.1129在培养基中培养发酵，发酵液离心得到18g湿菌体，加入到500mL转化液中，转化液中含Ilg的L-丝氨酸、13.1g 2-甲基吲哚、
0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L乙醚，pH8.0，37°C酶促反应16h，反应结束后转化液中2-甲基-L-色氨酸为22.4g，对L-丝氨酸摩尔转化率为98 % ；
[0029](2)将转化液3000r/min离心20min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液调pH5.5左右，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得20.1g 2-甲基-L-色氨酸粗品，质量浓度为95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得18.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，纯度为99.8 %。
[0030]本实施例的培养基成分包括10g/L碳源物质、35g/L氮源物质、2.5g/L柠檬酸、3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物质采用麦芽糖和果糖,氮源物质采用酵母膏、蛋白胨和豆饼水解液。
[0031]实施例3
[0032]本实施例包括以下步骤:
[0033](I)将1000mL施氏假单胞菌CGMCC NO: 1.202在培养基中培养发酵，发酵液离心得到湿菌体20g，加入到500mL转化液中，转化液中含21g的L-丝氨酸的毛发酸水解液、26.2g2-甲基吲哚、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L丙酮，pH8.0, 37°C酶促反应15h，反应结束后转化液中2-甲基-L-色氨酸为42.9g，对L-丝氨酸摩尔转化率为98.5% ;
[0034](2)将转化液5000r/min离心10min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液调PH5.5左右，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得39.9g 2-甲基-L-色氨酸粗品，质量浓度为95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得36.3g 2-甲基-L-色氨酸精品，纯度为99.9 %。
[0035]本实施例的培养基成分包括30g/L碳源物质、20g/L氮源物质、2.5g/L柠檬酸、3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物质采用鹿糖和果糖,氮源物质采用玉米楽;、蛋白胨和豆饼水解液。
[0036]实施例4
[0037]本实施例包括以下步骤:
[0038](I)将1000mL枯草芽孢杆菌CGMCC NO: 1.1628在培养基中培养发酵，发酵液离心得到20g湿菌体，加入到500mL转化液中，转化液中含Ilg的L-丝氨酸、13.1g 2-甲基吲哚、
0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L乙醇，pH8.0，37°C酶促反应20h，反应结束后转化液中2-甲基-L-色氨酸为22.6g，对L-丝氨酸摩尔转化率为99 % ；
[0039](2)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液调pH5.5左右，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得21.1g 2-甲基-L-色氨酸粗品，质量浓度为95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得19.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，纯度为99.9 %。
[0040]本实施例的培养基成分包括30g/L碳源物质、5g/L氮源物质、2.5g/L柠檬酸、
3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物质采用葡萄糖,氮源物质采用豆饼水解液。
[0041]实施例5
[0042]本实施例包括以下步骤:
[0043](I)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体，加入到500mL转化液中，转化液中含42g的L-丝氨酸的毛发酸水解液、52.4g 2-甲基吲哚、0.4g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L甲醇，pH8.0, 37°C酶促反应16h，反应结束后转化液中2-甲基-L-色氨酸为85.4g，对L-丝氨酸摩尔转化率为98% ；
[0044](2)将转化液3000r/min离心20min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液调pH 5.5左右，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得78.4g 2-甲基-L-色氨酸粗品，质量浓度为95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得76.5g 2-甲基-L-色氨酸精品，纯度为99.8 %。
[0045]本实施例的培养基成分包括25g/L碳源物质、15g/L氮源物质、2.5g/L柠檬酸、
3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物质采用麦芽糖、鹿糖和果糖,氮源物质采用玉米楽;、蛋白胨和豆饼水解液。
[0046]实施例6
[0047]本实施例包括以下步骤:
[0048](I)将1000mL施氏假单胞菌CGMCC NO: 1.202在培养基中培养发酵，发酵液离心得到湿菌体20g，加入到500mL转化液中，转化液中含Ilg的L-丝氨酸的毛发酸水解液、13.1g
2-甲基吲哚、0.lg/L磷酸吡哆醛和0.05g/L乙醚，pH8.0，37°C酶促反应16h，反应结束后转化液中2-甲基-L-色氨酸为21.4g，对L-丝氨酸摩尔转化率为98.5% ;
[0049](2)将转化液5000r/min离心10min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液调PH5.5左右，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得19.9g 2-甲基-L-色氨酸粗品，质量浓度为95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得17.7g 2-甲基-L-色氨酸精品，纯度为99.8 %。
[0050]本实施例的培养基成分包括40g/L碳源物质、20g/L氮源物质、2.5g/L柠檬酸、
3.0g/L 硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物质采用葡萄糖和果糖，氮源物质采用牛肉膏和豆饼水解液。
【权利要求】
1.一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将具有色氨酸合成酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含色氨酸合成酶的湿菌体； (2)将上述湿菌体中加入转化液，所述转换液中包括:含L-丝氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一种；在20~50°C,pH 5~12条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离得到2-甲基-L-色氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，具有色氨酸合成酶活性的菌株选自大肠杆菌ATCC15489、铜绿假单胞菌CGMCC NO:1.1129、施氏假单胞菌 CGMCC NO: 1.202、枯草芽孢杆菌 CGMCC NO: 1.1628 中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，培养基成分包括10~40g/L碳源物质、5~35g/L氮源物质、2.5g/L朽1檬酸、3.0g/L硫酸铵、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物质采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种，氮源物质采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述含L-丝氨酸的料液中L-丝氨酸的浓度为0.5~40.5g/L。
5.根据权利要求4所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述含L-丝氨酸的料液 来源于毛发酸水解液或纯L-丝氨酸液；毛发酸水解液中总氨基酸的重量百分比为5%~45%，其中L-丝氨酸在总氨基酸中的重量百分比为10%~90%。
6.根据权利要求1所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮，其浓度为0.00^/1~4.(^/1。
7.根据权利要求1所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，磷酸吡哆醛的浓度为0.2~0.8g/L，2-甲基吲哚的浓度为26.2~104.8g/L0
8.根据权利要求1所述的一种2-甲基-L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，等电点结晶法的具体方法如下: 将酶促反应后的转化液3000~5000r/min离心10~20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，抽滤，滤液调至pH 5~6，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得2-甲基-L-色氨酸粗品，米用乙醇洗漆，真空抽滤，烘干得2-甲基-L-色氨酸精品。
【文档编号】C12R1/19GK104017838SQ201410274056
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】徐礼生, 高贵珍, 卓馨, 曹稳根, 赵亮, 袁维风, 吴超 申请人:宿州学院