一种实时荧光rt-pcr检测人星状病毒和诺如病毒的探针、引物、试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种特异性检测人星状病毒和诺如病毒的通用探针，特异性扩增引物，含有所述探针及引物的试剂盒，以及利用实时荧光定量RT-PCR的方法同时检测人星状病毒和诺如病毒的非诊断性的方法，所述的探针利用通用碱基，可以特异性的结合由特异性引物扩增得到的来自人星状病毒和诺如病毒的特异性片段，在PCR过程中可以同时检测待测样本中是否存在星状病毒以及诺如病毒，所述的方法可以针对儿童粪便，肛拭子等样本进行检测。本发明所述的检测方法具有周期短，效率高，特异性强，准确率高的特点，同时具有操作简单，重复性好等特点。同时本申请克服了现有技术中不能同时检测星状病毒和诺如病毒的缺陷，具有良好色市场应用前景。
【专利说明】—种实时荧光RT-PCR检测人星状病毒和诺如病毒的探针、引物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因检测领域，涉及一种同时检测人星状病毒和诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测探针及其引物，以及所述的探针及引物在制备检测人星状病毒和诺如病毒的试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]小儿腹泻是世界行的常见病，严重危害儿童的身体健康和生命安全。据世界卫生组织统计，每年有超过一千万小于5岁的儿童夭亡，而由于腹泻引起的死亡占18%。另有文献报道每年约有2百万幼儿因腹泻及其并发症死亡，发展中国家死亡率大于发达国家，而其中约85%死亡病例来源于世界上的欠发达国家。引起小儿腹泻的常见病原超过20种，但病毒性腹泻较为常见，也越来越受到临床工作者的重视。急性小儿腹泻的常见病原体有人轮状病毒(Human Rotavirus, HRV)、肠道腺病毒(EntericAdenovirus, 90EAdV)、人杯状病毒(Human Caliciviruses, HuCV)、星状病毒(Astrovirus, AstV)与诺如病毒(Norovirus, NV)
坐寸ο
[0003]人星状病毒是由Madeley在1975年首次在电镜下观察到的病毒，根据宿主的不同可以分为哺乳动物 属和禽类属。1997年，Noel等将星状病毒分为7个基因型，发现其与血清型的划分一致，随后各地又报道了血清型8的发现。星状病毒属于单股正链RNA病毒，基因组从5’端到3’端包括一个85nt的5’非编码区，3个开放阅读框(ORFla、ORFlb、0RF2)，I个约80nt的3’非编码区以及一个30nt的poly A尾巴。其中ORFla和ORFlb编码非结构蛋白，分别是丝氨酸蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶，0RF2编码衣壳蛋白。目前现有技术中检测星状病毒的方法主要为电镜检测、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测、基因芯片检测、核酸序列依赖扩增技术(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)检测。其中，实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、操作简易，是临床常规选择的检测方法。
[0004]诺如病毒是1968年在美国俄亥俄州诺瓦克地区的一所学校中暴发的一起流行性腹泻的患者粪便中发现的，因此而得名，是首个被确认为引起人类急性胃肠炎的病毒。近年来随着对诺如病毒分子生物学研究的进展。现在人们认为诺如病毒是造成胃肠炎流行的首要原因，也是儿童和成人散发性胃肠炎的重要原因。常年都有诺如病毒感染病例发生，发病高峰为秋冬季，可通过食物、水源、接触等多种途径传播，因而在一些公共场所如医院、学校、军队中引起大规模爆发，人群危害较大。
[0005]诺如病毒是一个单股正链无包膜RNA病毒。属于人杯状病毒科,诺如病毒属在电镜下是有结构的小圆病毒，直径26~35nm,呈二十面体对称,外壳是由180个同一种外壳蛋白组成的90个二聚体构成。整个基因组分为三个开放阅读框，其中ORFl编码非结构蛋白(一个约200kD的多蛋白，被病毒编码蛋白酶切割后产生病毒复制必需的RNA多聚酶蛋白，ORFl编码包括保守的具有RNA多聚酶在内的非结构蛋白);0RF2和0RF3编码结构蛋白:0RF2编码57kD的主要结构蛋白VPl ；0RF3编码一个22kD的小结构蛋白。根据诺如病毒RNA多聚酶区和衣壳区的核酸序列，将NoV分为5个基因组:G I，G II，G III，G IV，G V，其中根据0RF2全基因组序列，GI可分为14个基因型，G II可分为19个基因型，其中我国主要感染的是G II 1，G II 3，G II 4。现有技术中常用的检测诺如病毒的方法是电镜法、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR检测以及ELISA技术。
[0006]现有技术中，已经有多种检测星状病毒以及诺如病毒的方法，以及可以同时检测双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测G I，G II型诺如病毒。但是，现有技术中并未有同时检测星状病毒和诺如病毒的检测方法，本发明的目的即为克服现有技术中的缺陷，即通过一步RT-PCR方法检测待测样本中是否存在星状病毒或诺如病毒，以此来提高检测效率，节约检测成本。
【发明内容】
[0007]本发明的原理在于针对星状病毒和诺如病毒的稳定保守区域设计特异性引物，并针对序列对比同源性较高区域设计共用探针，然后通过实施定量RT-PCR检测待测样本中是否存在星状病毒或诺如病毒。
[0008]为高效、特异、灵敏的检测出星状病毒和诺如病毒，本发明在GenBank中现有的所有的星状病毒和诺如病毒的基因序列进行序列的生物信息学分析，分别找出了星状病毒和诺如病毒的特异性保守区，并真对这些保守区域设计了引物及探针。通过对星状病毒和诺如病毒标准株的检测，确定分别针对星状病毒和诺如病毒的引物对，并通过实验筛选得到一条灵敏度高、特异性好，且针对星状病毒和诺如病毒的一条探针，即分别与星状病毒的双链基因组特异性结合的上游引物AstV-F和下游引物AstV-R、与诺如病毒的双链基因组特异性结合的上游引物NoV-F和下游引物NoV-R以及能够分别与上述两对儿引物扩增片段特异性结合的通用探针P，所述的探针P两端分别结合荧光报告基团(FLUO)和荧光淬灭基团(QUEN)，其中荧光报告基团任选自FAM，TET, JOE, HEX, VIC ;荧光淬灭基团任选自TAMRA, DABCYL, BHQ。
[0009]本发明的一个实施例中提供了一条特异性结合星状病毒和诺如病毒的通用探针，其中所述的探针序列为 FLU0-5’ -TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA-3’ -QUEN。其中，FLUO代表荧光报告基团，所述的荧光报告基团可以选自本领域常规选用的荧光基团，优选的为FAM, TET, JOE, HEX, VIC,更优选的为FAM, TET，最优选的为FAM ；QUEN代表荧光淬灭基团，所述的荧光淬灭基团可以选自本领域常规选择的淬灭基团，优选的为TAMRA, DABCYL, BHQ,更优选的为TAMRA，BHQ,最优选为TAMRA。所述探针的序列中，M、W、Y、S为通用碱基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
[0010]本发明的另一个实施例中，提供了可以特异性扩增星状病毒和诺如病毒的引物对，其中扩增星状病毒的上游引物为Astv-F5’ -CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，扩增星状病毒的下游引物为AstV-R5’ -GATGGCATACACATCAGCTT-3’ ；扩增诺如病毒的引物为NoV-F
[0011]5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，扩增诺如病毒的下游引物为 NoV-R
[0012]5，-GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3，。
[0013]本发明的另一个实施例提供了一种同时检测星状病毒和诺如病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括RT-PCR反应液、阴性质控液，人星状病毒和诺如病毒的阳性质控品等。其中所述的阴性质控液为双蒸水；其中所述的阳性质控品为通过引物扩增得到的特异性片段连接入质粒而得到；其中所述的RT-PCR扩增反应液包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs和PCR buffer ;其中所述的RT-PCR反应液还包括可以特异性扩增星状病毒和诺如病毒的引物对，其中所述的引物对分别为扩增星状病毒的上游引物为AstV-F
[0014]5’ -CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，扩增星状病毒的下游引物为 AstV_R5’ -
[0015]GATGGCATACACATCAGCTT-3’ ； 扩增诺如病毒的引物为NoV-F5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，扩增诺如病毒的下游引物为NoV-R5’ -GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’ ；其中所述的RT-PCR反应液还包括同时特异性结合人星状病毒和诺如病毒的通用探针，所述的探针序列为为FLU0-5 ’ -TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA-3’-QUEN。其 中，FLUO代表荧光报告基团，所述的荧光报告基团可以选自本领域常规选用的荧光基团，优选的为FAM，TET, JOE, HEX, VIC,更优选的为FAM，TET,最优选的为FAM ;QUEN代表荧光淬灭基团，所述的荧光淬灭基团可以选自本领域常规选择的淬灭基团，优选的为TAMRA，DABCYL，BHQ，更优选的为TAMRA，BHQ,最优选为TAMRA。所述探针的序列中，M、W、Y、S为通用碱基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
[0016]本发明的另一个实施例是一种非诊断性的同时检测人星状病毒和诺如病毒的方法，其中所述的方法包括利用RNA提取试剂盒提取来自待测样本的RNA样本，通过逆转录的方法得到cDNA样本，通过实时RT-PCR的方法通特异性引物分别扩增星状病毒和诺如病毒的片段，并利用通用探针结合PCR扩增得到的特异性片段，通过荧光信号判断待测样本中是否存在星状病毒和诺如病毒。
[0017]在进一步的实施例中所述的方法还包括利用RNA/DNA提取试剂盒及逆转录试剂盒获得粪便核酸样本，并通过PCR扩增星状病毒和诺如病毒获得PCR产物，所述产物经过纯化后TA克隆到pGM-T载体，摇菌获得标准质粒，进行荧光PCR获得标准曲线。
[0018]在进一步的实施例中，使用该体系检测了两例星状病毒和诺如病毒阳性粪便标本，每个样本重复三次；在更具体的实施例中，荧光PCR引物探针比例为，星状病毒引物:诺如病毒引物:通用探针=2:2:1 ;进一步的，所述的方法中的引物和探针的浓度分别为星状病毒上下游引物浓度为0.5-1 μ mol/L,诺如病毒上下游引物浓度为0.5-1 μ mol/L，通用探针浓度为0.25-0.5 μ mol/L，通过与标准曲线的对比，判断待测样本中目的检测物的拷贝数。
[0019]进一步的，逆转录采用大连宝生物PrimeScript?RT-PCR Kit,具体操作步骤，参照试剂盒的说明书进行，其中反应体系为dNTP Mixturel μ L, random6mersl μ L,粪便核酸样本 5 μ L, RNase Free dH20 补足至 10 μ L, 65 °C 变性 5min 后，加入 5 XPrimeScriptBuffer4 μ L> RNaseinhibitor0.5 μ L> PrimeScript RTase0.5 μ L> RNase Free dH20 补足至20 μ L。所述的反应条件为42°C 45min,85°C 5min。
[0020]进一步的，所述的方法采用如下体系扩增星状病毒和诺如病毒获得PCR产物:cDNA样本0.5 μ L，Taq DNA聚合酶2U/反应，上下游引物为I μ L (0.5 μ mol/L), dNTPs0.2mmol/Ll μ L, 10Xbuffer2 μ I，余量用双蒸水补齐20 μ L ;所述的PCR反应条件为 94°C 5min,94°C 15sec，61°C 30sec，72°C 30sec，共 35 个循环，所述的 PCR 结果见图 la，图lb。
[0021]进一步的，所述的扩增产物经TA克隆连接入pGM-T载体，所述的连接体系为:T4DNA连接酶1U，扩增片段与载体摩尔浓度比为4-9:1，用双蒸水补足10 μ L ;连接条件为16 °C连接过夜。
[0022]进一步的，所述的连接有特异性片段的pGM-T经转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，经抗生素筛选获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒提取阳性质粒，经测序验证连接片段的正确性。
[0023]所述的实时荧光定量PCR反应体系为10 X buffer5 μ I，25mmol/L Mg2+6.0 μ I，2.5mmol/L dNTP, 4.0 μ 1,10 μ mol/L 的两种病毒的上下游引物(10 μ mol/L)均 1.0 μ I,两种病毒通用TaqMan探针(10 μ mol/L)为0.5 μ 1，Taq酶1.0U，标准质粒5.0 μ 1，加去离子水至50.0μ1。PCR反应条件为:94°C C5min，94°C 15s、60°C 45s，共40循环。实验获得标准曲线参见图2a和图2b。
[0024]本发明与现有技术相比，具有以下的优点:1)可同时检测待测样品中的人星状病毒和诺如病毒，并检测其感染量，真实反映出样本内的病原体类型、拷贝数高低以及复制情况；2)与现有技术中的ELISA等检测方法相比，本申请所述的方法具有更高的灵敏性，适用于大便、肛试子等多种样本的检测；3)针对病毒的特异性引物以及探针，具有更高的特异性，避免了与其他病原体如轮状病毒、人腺病毒等交叉反应；4)将PCR的敏感性以及探针的特异性结合，缩短了反应时间、简化了操作步骤、提高了检测效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1PCR扩增得到的星状病毒和诺如病毒的特异性片段，其中a为星状病毒，b为诺如病毒，M代表marker，水代表阴性对照。
[0026]图2连接有人星状病毒以及诺如病毒的特异性扩增片段的质粒，经过RT-PCR检测，获得标准曲线，其中，a为星状病毒标准曲线，b为诺如病毒标准曲线，每张图中从左至右分别为从左至右曲线分别为IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10°拷贝质粒。
[0027]图3实际样本的RT-PCR检测，其中普通凝胶电泳图为待测样本的特异性引物扩增产物的电泳，M代表marker，中间泳道为星状病毒，右边泳道为诺如病毒；溶解曲线图代表待测样本的RT-PCR检测结果，每个样本设置三个重复，左边为星状病毒扩增结果，右边为诺如病毒扩增结果。
【具体实施方式】
[0028]为便于本领域技术人员理解本发明，现通过具体实施例对本发明进行具体详细说明，本领域技术人员应当知晓，本发明要求保护的范围并不囿于以下实施例，凡是本领域常规选用的方式，可适用于以下方法的技术手段均落入本发明要求保护的范围。
[0029]实施例1引物、探针的设计
[0030]发明人在GenBank中所有的现有的星状病毒和诺如病毒的基因序列进行序列的生物信息学分析，选择无二级结构且高度保守的区段，分别找出了星状病毒和诺如病毒的特异性保守区，并真对这些保守区域设计了引物及探针，其序列如下:
[0031]扩增星状病毒的上游引物为AstV-F5’-CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，扩增星状病毒的下游引物为 AstV-R5’ -GATGGCATACACATCAGCTT-3’ ；
[0032]扩增诺如病毒的引物为NoV-F5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，扩增诺如病毒的下游引物为 NoV-R5’ -GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’。[0033]同时可以特异性结合上述引物对扩增得到的特异性片段的探针序列为:
[0034]FLU0-5，-TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA-3，-QUEN，其中，FLUO 代表荧光报告基团，所述的荧光报告基团可以选自本领域常规选用的荧光基团，优选的为FAM, TET, JOE, HEX, VIC,更优选的为FAM，TET,最优选的为FAM ；QUEN代表荧光淬灭基团，所述的荧光淬灭基团可以选自本领域常规选择的淬灭基团，优选的为TAMRA，DABCYL, BHQ，更优选的为TAMRA，BHQ，最优选为TAMRA。所述探针的序列中，M、W、Y、S为通用碱基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
[0035]实施例2样本核酸提取
[0036]采用大连宝生物工程有限公司的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0提取试剂盒。取待测样本即选取2013年I月至2013年12月长兴县人民医院收治的腹泻患儿的粪便标本粪便标本用生理盐水制成混悬液，2000rpm离心后，取上清冻存于_80°C。对粪便标本中病毒核酸的提取采用大连宝生物工程有限公司的TaKaRa MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取试剂盒提取样本中的RNA,具体操作步骤，参照试剂盒的说明书进行。
[0037]实施例3粪便核酸样本逆转录
[0038]逆转录采用大连宝生物PrimeScript?RT-PCR Kit,具体操作步骤，参照试剂盒的说明书进行，其中反应体系为dNTP Mixturel μ L, random6mersl μ L,幾便样本5 μ L, RNaseFree dH20 补足 至 10 μ L, 65 V 变性 5min 后，加入 5 X PrimeScript Buffer4 μ L、RNaseinhibitor0.5 μ L、PrimeScript RTase0.5 μ L、RNase Free dH20 补足至 20 μ L。所述的反应条件为 42°C 45min,85°C 5min。
[0039]实施例4标准质粒的构建以及标准曲线的获得
[0040]采用如下体系进行PCR扩增:cDNA样本0.5 μ L，Taq DNA聚合酶2U/反应，上下游引物为 I μ L (0.5 μ mol/L), dNTPs0.2mmol/Ll μ L, 10XPCR Mix2 μ L,余量用双蒸水补齐20 μ L ;所述的 PCR 反应条件为 94°C 5min,94°C 15sec，61°C 30sec，72°C 30sec，共 35 个循环，所述的PCR结果见图la，图lb。
[0041]所述的扩增产物经TA克隆连接入pGM-T载体，所述的连接体系为:T4DNA连接酶1U,扩增片段与载体摩尔浓度比为4-9:1，用双蒸水补足10 μ L ;连接条件为16°C连接过夜。
[0042]将连接后的产物加入200 μ I制备好的感受态大肠杆菌DH5 α中，冰浴30分钟后42°C热激90秒后冰浴3分钟；加入800μ I LB液体培养基，37 °C，150转/分钟摇菌I个小时后取1000 μ I菌液低速离心去700ul上清后剩余300ul菌液均匀涂布于氨苄青霉素(50 μ g/ml)的LB琼脂培养板上。倒置平板，37°C培养箱内12_16h，每个转化平板分别挑取5个克隆进行测序，验证扩增片段的序列正确性。
[0043]所述的实时荧光定量PCR反应体系为10 X buffer5 μ I，25mmol/L Mg2+6.0 μ I，
2.5mmol/L dNTP, 4.0 μ 1,10 μ mol/L 的两种病毒的上下游引物(10 μ mol/L)均 1.0 μ I,两种病毒通用TaqMan探针(10 μ mol/L)为0.5 μ 1，Taq酶1.0U，标准质粒5.0 μ 1，加去离子水至50.0μ1。PCR反应条件为:94°C C5min，94°C 15s、60°C 45s，共40循环。实验获得标准曲线参见图2a和图2b。
[0044]实施例5待测样本的实验验证
[0045]选取了各感染人星状病毒和诺如病毒的粪便标本各一份儿，按照实施例2所述的方法提取核酸，并按照实施例3所述的方法进行逆转录获得cDNA样本。
[0046]使用实施例4所述的体系体系检测了星状病毒和诺如病毒阳性粪便标本各一例，每个样本的逆转录cDNA样本重复三次，结果见图3。
[0047]实验结果可见，本发明所设计的引物以及通用探针可以同时灵敏、特异性的检测得到待测样本中的人星状病毒和诺如病毒，并且通过与标准曲线的对比，可以判断待测样本中的病毒的拷贝数。由此可见，本申请所述的探针、引物以及方法克服了现有技术的缺陷，取得了本领域技术人员预料不 到的技术效果。
【权利要求】
1.一种利用RT-PCR方法检测星状病毒(Astrovirus)和诺如病毒(Norovirus)的通用探针，其序列为 FAM-1TTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA，其中 M、W、Y、S 为通用碱基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
2.根据权利要求1所述的探针，其中FLUO代表荧光报告基团，所述的荧光报告基团和淬灭基团选自本领域常规选用的荧光基团和淬灭基团，优选的为FAM，TET, JOE, HEX, VIC，更优选的为FAM，TET，其中最优选的为FAM ;QUEN代表荧光淬灭基团，所述的荧光淬灭基团可以选自本领域常规选择的淬灭基团，优选的为TAMRA，DABCYL, BHQ,更优选的为TAMRA，BHQ,最优选为TAMRA。
3.—种扩增人星状病毒的引物对，所述的引物的序列为上游引物为AstV-F5’ -CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，下游引物为 AstV_R5’ -GATGGCATACACATCAGCTT-3’。
4.一种扩增诺如病毒的引物对，所述的引物的序列为上游引物为NoV-F5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，下游引物为 NoV_R5’ -GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’。
5.一种检测星状病毒和诺如病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括权利要求1-2任一项所述的通用探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述的试剂盒还包括权利要求3和4所述的引物对。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中还包括所述的试剂盒包括RT-PCR反应液、阴性质控液，人星状病毒和诺如病毒的阳性质控品。
8.一种非诊断性的检测人星状病毒和诺如病毒的方法，所述的方法包括如下步骤: 1)提取待测样本中的RNA； 2)逆转录获得cDNA模板； 3)利用权利要求3和4所述的引物对扩增cDNA模板，获得特异性片段； 4)将步骤3)所得的特异性片段连接入T载体，并转化感受态细胞，经抗生素筛选、测序获得正确连接的标准质粒； 5)利用权利要求1或2所述的探针以及权利要求3和4所述的引物利用实时荧光定量PCR的方法检测步骤4)制备的标准质粒，获得标准曲线，其中设置IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10。浓度梯度； 6)选取待测样本，利用步骤5)所述的实时荧光定量PCR方法检测，每个样本设置三个重复； 7)对比待测样本的溶解曲线与标准曲线，获得待测样板中人星状病毒和诺如病毒的拷贝数。
【文档编号】C12N15/11GK104017905SQ201410291136
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】施前锋 申请人:长兴县人民医院