一种hpv高危型分型荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种或以上的PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列。应用本发明提供的该试剂盒，可以对疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒的DNA核酸片段进行快速荧光PCR进行分型检测，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断，及宫颈癌的早期筛查、宫颈病变的随访、用于指导疫苗的开发。
【专利说明】—种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型荧光PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HP V)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型。
[0003]HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。全世界每年约有50万妇女宫颈癌新发病例，其中亚洲约占38万；每年约有27万女性死于子宫颈癌。在不同地区、不同经济状况的国家宫颈癌的发病率和死亡率有着显著的差别，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年约有15万宫颈癌新发病例，每年约有3万人死于子宫颈癌，其死亡率居妇科肿瘤的第二位。近年来，宫颈癌病人数目在逐渐上升，并呈年轻化的趋势。
[0004]对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7%宫颈癌患者存在HP V感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年。因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。在检出的所有型别中主要有册￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，因此，快速、准确的检测出HPV高危型的感染，且能够准确分型，对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。
[0005]目前，国内外对于宫颈癌的早期筛查方法主要有细胞学检测和分子生物学检测。细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查(TCT)等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法大大改进了细胞学检查的准确性，逐渐取代传统的巴氏法。可观察宫颈上皮血管微小变化的阴道镜检查虽敏感、准确，但会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染，且HPV不能在培养环境中稳定生长，大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果，因此，该感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现，只能通过HPV DNA检测得知。
[0006]目前HPV DNA的检测主要通过应用分子生物学方法，包括核酸杂交方法、基因芯片技术以及聚合酶链反应(PCR)技术等。其中核酸杂交方法又包括DNA印迹杂交、原位杂交技术、杂交捕获方法和分子导流杂交。基因芯片技术的出现时间不长，其发展势头迅猛，应用十分广泛，但其存在的缺陷限制了其在临床的应用。首先是成本的问题，由于芯片制作的工艺复杂，信号检测也需专门的仪器设备，一般实验室难以承担其高昂的费用，其次在芯片实验技术上还有多个环节尚待提闻，如在探针合成方面，如何进一步提闻合成效率及芯片的集成程度是研究的焦点。目前认为PCR技术是检测HPV DNA及分型的最好方法。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。大量研究表明用PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术，是当今用于HPV感染诊断最常用的有力工具，且能更好的应用于HPV致病、致癌机理的研究之中。
[0007]结合国内情况，在临床高危型人乳头瘤病毒感染的分型诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前只有极少量荧光PCR诊断试剂盒在临床高危HPV感染诊断中使用，但是缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
[0008]运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
[0009]目前国内临床上主要采用煮沸法对人乳头瘤病毒的核酸进行提取:先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有 的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。
[0010]临床上检测高危HPV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
[0011]国内已有一些基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的高危型HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。且这些试剂盒的检测灵敏度不高，约在lOOOOcopies/ml左右；还因没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性，和一般没有预防PCR产物污染的措施。且现有HPV基因分型方法复杂，操作过程繁琐，需要开盖操作，容易污染，现有的荧光PCR分型试剂，所能区分的型别少。另外，受限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种检测高危型HPV-DNA特异性好且综合性能优良的分型PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于解决现有高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的高危型人乳头瘤病毒荧光定量PCR分型检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型这15种型别的DNA核酸片段进行快速荧光PCR进行分型检测，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断，及宫颈癌的早期筛查、宫颈病变的随访、用于指导疫苗的开发。
[0013]因此，本发明提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种或以上的PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婦(surfactin) 0.01~
0.5mmol/L，氯化钾20~300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1% ;其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列；
[0014]其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
[0015]16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
[0016]16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
[0017]16 型探针:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ；
[0018]18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
[0019]18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC,
[0020]18 型探针:AATCATCAACAITTACCAGCCCGACG ；
[0021]内标上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，
[0022]内标下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG，
[0023]内标探针:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
[0024]在一种具体的实施方案中，所述试剂盒中共含任选的2~16种PCR反应液，且在所述2~16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；
[0025]其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为，
[0026]31 型上游引物:AGCCAACAACACCACCACATC，
[0027] 31 型下游引物:GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG，[0028]31 型探针:TCGCCCGCCGCACACCTTCA ；
[0029]33 型上游引物:ACCGCCCAGCCCCTTAC，
[0030]33 型下游引物:GTCCGCTGCTTGTTTGTGC，
[0031]33 型探针:CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG ；
[0032]35 型上游引物:TATTTAGCAGCACAGAACTATCCACT，
[0033]35 型下游引物:TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT，
[0034]35 型探针:CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC ；
[0035]39 型上游引物:CCAGACGGGATGAACCACA，
[0036]39 型下游引物:CACACCACGGACACACAAATC，
[0037]39 型探针:AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA ；
[0038]45 型上游引物:TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
[0039]45 型下游引物:AAAACCAGCCGTTACAACCC，
[0040]45 型探针:TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC ；
[0041]51 型上游引物:TCGGATGATGAGGATGAAAATG，
[0042]51 型下游引物:CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT，
[0043]51 型探针:TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA ；
[0044]52 型上游引物:CTCCAAGACCTCCGCAGTGT，
[0045]52 型下游引物:TGTTGTCCCCGCAAAAGG，
[0046]52 型探针:CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA ；
[0047]53 型上游引物:GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT，
[0048]53 型下游引物:TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
[0049]53 型探针:TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC ；
[0050]56 型上游引物:TGTGCGITTTAGTAGGCTAGGC，
[0051]56 型下游引物:CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC，
[0052]56 型探针:CATAATAATAATGCACACGAGCACCTAITTG ；
[0053]58 型上游引物:CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG，
[0054]58 型下游引物:CCAACGCCTGACACAAATCAT，
[0055]58 型探针:TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT ；
[0056]59 型上游引物:TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG，
[0057]59 型下游引物:TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG，
[0058]59 型探针:ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA ；
[0059]66 型上游引物:GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT，
[0060]66 型下游引物:CGTTTTACATAGGTATCCGTTG，
[0061]66 型探针:CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG ；
[0062]68 型上游引物:AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG，
[0063]68 型下游引物:GCACGGTGGGCTTTGGT，
[0064]68 型探针:CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
[0065]在本发明中，我们把15种高危HPV型别(HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型)和所使用的内标一起简称为16种型别。
[0066]在本发明中，优选地，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
[0067]在一种具体的实施方式中，所述试剂盒包括核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、HPV高危型定量参考品、HPV高危型阳性对照和HPV高危型阴性对照。
[0068]本发明还提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括两种或以上的PCR反应液，其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列；
[0069]其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
[0070]16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
[0071]16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
[0072]16 型探针:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ；
[0073]18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
[0074]18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC，
[0075]18 型探针:AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG ；
[0076]内标上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，
[0077]内标下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG,
[0078]内标探针:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
[0079]在一个【具体实施方式】中，所述试剂盒中共含任选的2~16种PCR反应液，且在所述2~16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列如上所示。
[0080]优选的，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
[0081]本发明还提供一种核酸释放剂在HPV高危型分型荧光PCR检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婦(surfactin) 0.01~0.5mmol/L,氯化钾20~300mmol/L,十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。
【具体实施方式】
[0082]实施例1
[0083]本实施例提供一种能检测15种高危型人乳头状瘤病毒并能准确分型的检测试剂盒，它至少由以下组分组成:
[0084]①核酸释放剂:莎梵婦(surfactin)0.01~0.5mmol/L(质量/体积)，氯化钾(此1)50~200臟01/1(质量/体积)，十二烷基磺酸钠(SDS)0.01%~2% (质量/体积)，乙醇0.05 %~I % (体积/体积)；
[0085]②PC R反应液:包含HPV16型和18型引物探针序列的第一种PCR反应液，用于检测HPV16型及18型；包含HPV39型和31型引物探针序列的第二种PCR反应液，用于检测HPV39型及31型；包含HPV33型和58型引物探针序列的第三种PCR反应液，用于检测HPV33型及58型；包含HPV45型和59型引物探针序列的第四种PCR反应液，用于检测HPV45型及59型；包含HPV51型和66型引物探针序列的第五种PCR反应液，用于检测HPV51型及66型；包含HPV52型和53型引物探针序列的第六种PCR反应液，用于检测HPV52型及53型；包含HPV56型和68型引物探针序列的第七种PCR反应液，用于检测HPV56型及68型；包含HPV35型和β -globin引物探针序列的第八种PCR反应液，用于检测HPV35型及内标。其中每种PCR反应液均包括IOXPCR反应缓冲液5 μ 1，0.05mmol/L~0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，且八种PCR反应液中相应每种靶核苷酸引物探针序列的浓度均为0.1 μ mol/L~0.3 μ mol/L，八种PCR反应液中总共的引物序列记为:HPV16-F与HPV16-R、HPV18-F与HPV18-R、HPV31-F 与 HPV31-R、HPV33-F 与 HPV33-R、HPV35-F 与 HPV35-R、HPV39-F 与 HPV39-R、HPV45-F 与 HPV45-R、HPV51-F 与 HPV51-R、HPV52_F 与 HPV52-R、HPV53_F 与 HPV53-R、HPV56_F与 HPV56-R、HPV58-F 与 HPV58-R、HPV59-F 与 HPV59-R、HPV66-F 与 HPV66-R、HPV68-F 与HPV68-R ;八种PCR反应液中总共的探针序列记为:HPV16_P、HPV18-P、HPV31-P、HPV33-P、HPV35-P、HPV39-P、HPV45-P、HPV51-P、HPV52-P、HPV53-P、HPV56-P、HPV58-P、HPV59-P、HPV66-P、HPV68-P ;第八种PCR反应液中还包括0.05 μ mol/L~0.2 μ mol/L的用于内标片段扩增的上下游引物IC-F与IC-R和0.05 μ mol/L~0.2 μ mol/L的用于检测内标的探针IC-P。所述10XPCR反应缓冲液 包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、20臟01/1氯化镁溶液、500臟01/1氯化钾溶液、0.2% (体积/体积)曲拉通溶液和10% (体积/体积)甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP ;所述引物探针的喊基序列见表1。
[0086]表1
[0087]
【权利要求】
1.一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种或以上的PCR反应液,所述核酸释放剂包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.5mmol/L,氯化钾20~300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~I %;其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列； 其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为， . 16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG， .16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， . 16 型探针:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； . 18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， . 18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC, . 18 型探针:AATCATCAACAITTACCAGCCCGACG ； 内标上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 内标下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG， 内标探针:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含任选的2~16种PCR反应液，且在所述2~16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、.51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列； 其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为， . 31 型上游引物:AGCCAACAACACCACCACATC， . 31 型下游引物:GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG， .31 型探针:TCGCCCGCCGCACACCTTCA ； . 33 型上游引物:ACCGCCCAGCCCCTTAC, . 33 型下游引物:GTCCGCTGCTTGTTTGTGC， . 33 型探针:CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG ； . 35 型上游引物:TAITTAGCAGCACAGAACTATCCACT， . 35 型下游引物:TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT， . 35 型探针:CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC ； . 39 型上游引物:CCAGACGGGATGAACCACA， . 39 型下游引物:CACACCACGGACACACAAATC， . 39 型探针:AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA ； . 45 型上游引物:TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC， . 45 型下游引物:AAAACCAGCCGTTACAACCC， . 45 型探针:TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC ； . 51 型上游引物:TCGGATGATGAGGATGAAAATG， .51 型下游引物:CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT， . 51 型探针:TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA ；.52 型上游引物:CTCCAAGACCTCCGCAGTGT， . 52 型下游引物:TGTTGTCCCCGCAAAAGG， . 52型探针:CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA ； . 53型上游引物:GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT， .53 型下游引物:TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
.53 型探针:TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC ； . 56 型上游引物:TGTGCGITTTAGTAGGCTAGGC， . 56 型下游引物:CAATAATGGCTGCAITTCAAITTC， . 56 型探针:CATAATAATAATGCACACGAGCACCTAITTG ； .58 型上游引物:CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG， .58 型下游引物:CCAACGCCTGACACAAATCAT， .58型探针:TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT ； . 59型上游引物 :TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG， .59 型下游引物:TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG， . 59 型探针:ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA ； . 66 型上游引物:GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT， .66 型下游引物:CGTTTTACATAGGTATCCGTTG， .66 型探针:CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG ； . 68 型上游引物:AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG， . 68 型下游引物:GCACGGTGGGCTTTGGT， . 68 型探针:CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、HPV高危型定量参考品、HPV高危型阳性对照和HPV高危型阴性对照。
5.一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括两种或以上的PCR反应液，其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列； 其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为， . 16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG， . 16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， . 16 型探针:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； . 18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， . 18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC, . 18 型探针:AATCATCAACAITTACCAGCCCGACG ； 内标上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 内标下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG，内标探针:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含任选的2~16种PCR反应液，且在所述2~16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列为如权利要求2所示的序列。
7.根据权利要求6所述的试剂盒 ，其特征在于，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
8.—种核酸释放剂在HPV高危型分型荧光PCR检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婦(surfactin) 0.01 ~0.Smmol /I,,氯化钾 20 ~300mmol/L,十二烷基横酸钠 0.01 ~2%和乙醇0.05~1%。
【文档编号】C12Q1/70GK104017906SQ201410298440
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】戴立忠, 刘佳, 李勃, 邓中平 申请人:湖南圣维尔医学检验所有限公司