小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦山融3号甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1。本发明还公开了所述基因TaMsrA4.1在拟南芥和小麦植株中提高其抗盐性的应用。实验结果表明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的抗盐能力得到了很大程度的提高，为通过基因工程手段提高作物抗盐性提供了理论依据和实践基础。
【专利说明】小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物基因工程【技术领域】，尤其涉及一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1及其应用。 【背景技术】
[0002] 高盐是限制植物生长发育和相关产量的重要因素。因此，发掘和鉴定抗盐相关基 因用于农作物改良是育种科学家考虑的关键问题之一。甲硫氨酸亚砜还原酶（Methionine Sulfoxide reductase, Msr)家族基因能被多种非生物胁迫诱导表达。在植物体内，Msr不 但可以清除机体内过量的活性氧（Reactive oxygen radical species, R0S)，而且可以体 外催化因 R0S氧化的R和S型的MetSO还原为Met，这些证据表明Msr在植物胁迫应答中可 能发挥重要作用。
[0003] 小麦是世界上最为重要的甜土粮食作物之一，不耐盐碱。不过近年来世界范围内 的土壤盐渍化加剧，严重限制了作物生长发育和产量。因此加强小麦应对耐盐的能力是扩 大小麦种植范围和提高小麦产量最为有效的途径之一。本实验室前期将小麦近缘禾草中耐 逆性极强的长穗偃麦草的染色质渐渗入小麦济南177的基因组，创制了一批抗逆新种质资 源并从中选育出高产/耐盐小麦新品种山融3号（SR3)。前期的盐旱处理SR3幼苗构建的 cDNA芯片显示其中的TaMsrA4. 1有显著响应。尽管MsrA家族基因在拟南芥、水稻以及一些 其他植物中抗胁迫方面的作用已有初步结果，但在主要粮食作物小麦中该家族基因特别是 TaMsrA4. 1基因的克隆、功能验证尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一个抗盐相关基因--小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1，以及利用该基因在提高植株抗盐性中的应用。
[0005] 本发明的技术方案是：从小麦山融3号（SR3)中分离得到小麦甲硫氨酸亚砜还原 酶基因 TaMsrA4. 1，首先在拟南芥中验证其功能，随后在小麦中证实其提高抗盐性。
[0006] 本发明所述的小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1，其特征在于：所述基因 cDNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，所述小麦是山融3号小麦。
[0007] 本发明在小麦中克隆的甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1与其他物种中的 类似基因相比同源性在60?79 %之间。对其保守区分析发现，小麦中甲硫氨酸亚砜 还原酶基因 TaMsrA4. 1推导的氨基酸序列含有类似"GCFWG"的保守序列和位于C端的 "KGCNDPIRCYG"保守序列，这其中的三个Cys是酶的热稳定性和催化活性所必须。和其它 同类基因相比，也存在N-和C-端的较高的变异性，这暗示在小麦中该基因存在功能上的分 化。
[0008] 本发明所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1在提高植株抗盐性中的应 用。
[0009] 实验证实：在盐处理下，转入本发明所述基因 TaMsrA4. 1的植株过表达系生长状 况和根长比野生型生长更好，说明该基因的转化的确增强了植株（拟南芥和小麦）抗盐的 能力。
[〇〇1〇] 本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦 SR3甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1并进行了功能验证。实验发现该基因与抗盐性密 切相关。故对于该基因 TaMsrA4. 1的研究具有重要理论意义和应用如景。 【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 :TaMsrA4. 1基因的cDNA电泳图，其中：M为DNA Marker，泳道1-2为 TaMsrA4. 1的cDNA，泳道NC为阴性对照，水为模版。
[0012] 图2 :转TaMsrA4. 1基因的拟南芥转基因植株筛选，绿苗为转基因植株。
[0013] 图3 :甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1在转基因拟南芥中RealTime-PCR表达 分析，Clo-Ο为野生型拟南芥，0E1和0E2为不同转基因纯系，Actin为内标对照。
[0014] 图4 :转基因的拟南芥中NaCl处理分析，WT为野生型，0E1和0E2为过表达系。
[0015] 图5 :转基因小麦PCR筛选电泳结果，NC为阴性对照，Μ为DNA Marker，其余为检 测的转基因小麦。 【具体实施方式】
[0016] 实施例 1、TaMsrA4. lcDNA 的克隆
[0017] 1. 1SR3小麦总RNA的提取
[0018] (1)将生长到2叶一心期小麦剪碎放入研钵中，加入液氮覆盖材料后将其研磨成 粉；
[0019] (2) -旦液氮挥发后，立即取约200mg粉末转入1.5ml离心管中，加入1ml TrizolRNA提取液，涡旋震荡充分混匀于室温静置5min ;
[0020] (3)4°C，12000rpm条件下离心lOmin，取0.9ml上清液移入另一个1.5ml离心管 中，加入0. 2ml氯仿剧烈振荡15sec混勻后于室温静置5min ;
[0021] (4)在4°C，12000rpm条件下离心lOmin，取0· 4ml上清液移入新的1. 5ml离心管 中，取0. 4ml异丙醇加入后混勻于室温静置15mim ;
[0022] (5)4°C，12000rpm条件下离心lOmin，弃上清后用lml75%的乙醇连续洗涤两次， 4°C，8000rpm 条件下离心 5min ;
[0023] (6)弃上清，在超净工作台中干燥RNA5min，加入40μ 1 RNase-Free水，在60°C中 溶解 RNAlOmin ;
[0024] (7)用紫外分光光度计测RNA样品的浓度和质量，A26(i/A28(i达到1. 7-2. 0为好；再 利用1. 2%的琼脂糖凝胶标准电泳检测提取RNA的质量。
[0025] 1. 2 合成 TaMsrA4. lcDNA 第一链
[0026] (1)向离心管中依次加入下列物质（40 μ 1体系）：
[0027]
【权利要求】
1. 一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1，其特征在于：所述基因 cDNA的核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 如权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1，其特征在于：所述小麦 是山融3号小麦。
3. 权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4. 1在提高植株抗盐性中的应 用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植株是小麦或拟南芥。
【文档编号】C12N15/53GK104087600SQ201410313383
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】陈凡国, 李翔, 丁鹏程, 张尚立, 夏光敏 申请人:山东大学