植物冷诱导强表达启动子Poscold4及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种植物冷诱导强表达启动子Poscold4及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物基因工程中。本发明提供的启动子能够特异地驱动外源基因在低温/冷胁迫条件下在植物中表达，因此在基因工程中用该启动子替代组成型启动子驱动抗寒基因，既可以有效的提高低温下转基因植物的耐寒性，又将避免常温下抗寒基因的无效表达，从而达到对抗寒基因的最佳利用。
【专利说明】植物冷诱导强表达启动子PoscolcM及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种植物冷诱导强表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在植株中表达。
【背景技术】
[0002]低温寒冷是植物遇到的一种常见的环境胁迫因子，过低温度或持续低于生长最适温度会对植物/作物生产造成重要影响。苗期低温，可能抑制萌发，降低出苗率；破坏光合反应中心，降低光合作用；大量产生活性氧，破坏和失活蛋白质、脂类等生物大分子，直接损伤细胞；最终抑制植物生长，甚至导致植株死亡。而在生殖生长时期，低温导致配子体发育不完全，花粉败育，直接影响产量。每年全球因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿美元，因此如何克服低温伤害，培育抗低温的基因工程作物是作物分子设计育种的热点问题。
[0003]植物中存在着一个复杂的低温胁迫信号应答网络系统。植物在受到低温胁迫后能通过该系统进行一系列的基因遗传修饰，对自身的代谢和生长进行调节以适应该不利因素对其造成的影响。利用这一应答网络中关键基因，可以有效提高植物对低温的耐受性。但目前基因工程操作中，多使用组成型启动子驱动这些关键节点基因过表达，所获转基因植株虽然能够表现出较强的低温耐性，但组成型启动子带来的不必要表达往往造成植株的矮小，发育延滞和物质能量浪费，不利于潜在的实际应用推广。因此，利用冷诱导启动子，仅在低温胁迫时激活关键调控基因，将是抗冷基因工程改良的主要发展方向之一。
[0004]目前已有部分冷诱导启动子的报道，如拟南芥PCBF3等。这些启动子虽然可以较为特异的响应环境低温胁迫诱导，但或多或少的存在本底表达泄露、诱导后强度不足支撑功能基因充分发挥抗冷作用等缺陷。因此，分离鉴定低本底、诱导倍数高、诱导后高表达的新型冷诱导启动子对作物基因工程将有着重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种驱动外源基因在低温诱导条件下表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0006]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物冷诱导强表达启动子，所述植物冷诱导强表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻冷诱导强表达启动子，本文中称为PoscolcM或启动子Poscold4。具体而言,本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare) L0C_0s03g52410.1基因上游包括转录起始位点在内的1841bp的DNA序列，具有驱动目标基因在寒冷条件下特异性表达的的功能,并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0007]优选地，本发明提供的植物冷诱导强表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:l所示的序列，即PoscolcM或启动子Poscold4。
[0008] 另一方面，本发明提供一种植物冷诱导强表达启动子，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者,所述植物冷诱导强表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物冷诱导强表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物冷诱导强表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物中表达。
[0009]另一方面，本发明还提供一种包含上述植物冷诱导强表达启动子的表达盒。
[0010]又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物冷诱导强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导强表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Poscold4，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即PoscolcM或启动子PoscolcM构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-Poscold40或者待表达基因可以为任何对作物的耐寒性具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该耐寒基因在寒冷条件下集中表达，从而实现改善作物耐寒性状的功能。
[0011]另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物冷诱导强表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0012]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物冷诱导强表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0013]再一方面，本发明提供上述植物冷诱导强表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物冷诱导强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0014]并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0015]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0016]GTCATCATCCGTCCAAAATCCTGGACAAGGTTTTCACCTAGAGCTTCTTGCCGAGGGGGGAGGGGTACCTCAACAATGCCCTCAGGAGGGTTACCACGCTTGAAGGCGTAGCCATTGCTGGCCCAAAGAATTGGGCTAAGCTTTCGCTCGGAACCCTTTACCGCCGTGGTCCGTCTCTCCATCCGAATCCACCATCTAAACATCGGCGGCACATGGCTTCCACCACACCCGACCGACGCCCCTCTGCCGGTCATCCAGTCCTGCCAACGACAAGACTACCACCACACCACACCGACGCCCCTCCGTCAGCCGACTTCGTCGAACCGCCATCCCTAAGAGCTGGCCCAGGACCCTTCCGTTCCACCACCCGCCGGCCACCTCGCCAGATCTAGCTGAAGGAGAACCCGGGATTGGGTGGCACTGCTTCGGTACCCTAAGCTTCCCCCGTTAACGAGCAGCCACCTCAATCCAATCTAGAAACTCCCCGCAAAGAAGGGGAGGAGCTCTAGGAAGGGTGAGGGTGCCGACCGGCAACGAGGAAGATGACTCACCGCCGCCAGCTCCCTTTGCACTGCCATCTGACCACCAACGCCCCCGTAGCCCGGCTGCCGCGCCTCGCCTTGCCACCGGGGCGGCATTAGCAAAATGGAGCAGGAGGCCGCACGCCGGCAATAGCACCCATGGTGTGCACATGGCGGGCGTGCCCTGCTGCGGCCGGGAAGGACAAGCAGCAGAGGGCTAGGGCGCCACCCCTAGCCGCCGAAGACACGGCCGCCGCGCCCCAGGCTGCTCGCCGAGCCGCCGCTGCCGCCCCCAGCTGCCTTCCGCCGAGCCGCCGCCTCTGCTTCCGGGCCAGCCAACCTTTTGTGAAGCAGTCTAAATTCAGCTCCTCAAAATTTTGTTCATTCTTATTTTA
GATGCAGCTCTTGTATAGCTGAGCCGTGGCAAGCAGACCCAACACCTGAGTGCCCTCTTCCAATCCCGCCACTGAAA
CAGGCCCGCGGCAAGCGTTCTCATCTGCCGGCCGCGCAATCGTCGGCGAACGTCATACCGGCCGAGAAGTAGTAGTA
CTCCGTATTAGATATGCAGGGGACGAATTGCCCCCCGGCGGATTGAGCAAGCGGCGCCGGCGATCGCGTTCCAACAG
ATCGAGAAGGTCACTGACCAGTCCACTAATCCAGCCAGACGACCCGTCAATTAATCCAGAGAACACGGACTGCGTCA
GTCAGACACACCGCCACAGACGCGGCTCACGCCACCCTTCCCTCTATGGCCCCGTCACGTTCTCCGCCTTTTCCTTT
CACACCCTCCTCGATCGGTCGCCCGGCCACGGGCGGGCCACGGCCACCGAGCGGTGAAAAGGGGCAGCAAACGCACG
CTTCCCACCCCGCCGTTTTTACGTGGTCGCCGCGCAACACCACCGACGACGACGTCAACCCGCACCCACCGGGGGCT
CGTTCCACACGCGCGCGCAAGCGCAACCACCGCTACCAACTGCCTCCTTCCGCTGAGGCGCTGACCGAGAGAGACAA
ATGGGGCACGTTTAAACTCAAGTCTCGCCTTCTTCTTCCCACCCACGCCAACGAAAAGCCCAGCAACCACCACGAAA
CCCACGCGAAACACACGCCCTCCCCGCCAAGTCAGCTCTCCTCTCCCAACCGTATATAACCCCCGCTTCCCCTTCCC
CAGGAGAAATCCACCCATTCCGCCGCCTCCTCGCAGCTCGGAGAATTTTTTTTTTCGAGAATTCGATCGAGAGCGAG
CCACGCTTGCGTGCTTTGGAAGAAAATCATATATCAAGCAGCAGCAGCAGCTGTCGGAGATGTCGCGGTACGTGGAG
T
[0017]需要说明的是:上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“GTCATCATCCGTCCAAAATCCT”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“GAGATGTCGCGGTACGTGGAGT”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp ;该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0018]综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare) L0C_0s03g52410.1基因上游包括转录起始位点在内的1841bp的DNA序列，并将其命名为PoSCold4(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行⑶S表达定量检测发现，转基因植株在低温诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平提闻，从而证明该1841bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻低温诱导处理后表达。
[0019]本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在低温诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。
[0020]技术效果
[0021]本发明所克隆的水稻启动子PoscolcM能够调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性，尤其是耐寒特性，从而培育出实用有效的耐寒植物品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0023]图1为将PoscolcM启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中A为pCAMBIAl391示意图，B为pCAMBIA1391_Poscold4示意图，其中示出了利用PoscolcM启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；
[0024]图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
[0025]图3为低温处理(4°C )下启动子表达活性的示意图，图中示出了将萌发7天后的PoscolcM::gus转基因幼苗和PActin::gus对照幼苗,放在4°C条件下分别冷处理4小时、8小时、12小时、24小时和48小时的结果，以便鉴定PoscolcM启动子的诱导倍数和表达活性，图中实心柱表示PActin::gus对照幼苗中⑶S表达强度，空心柱表示PoscolcM::gus转基因幼苗中⑶S表达强度。
【具体实施方式】
[0026]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0027]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂、耗材原料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0028]含有酶切位点的 PoscolcM启动子的获得
[0029]步骤1、引物的设计
[0030]根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻PoscolcM基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
[0031]本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391 (图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物(SEQ ID No:2)5’端带PstI，酶切位点(CTGCAG)，
[0032]反向引物(SEQ ID No: 3) 5，端带BamHI酶切位点(GGATCC)，引物序列如下:
[0033]正向引物:CTGCAGGTCATCATCCGTCCAAAATCCTPstI
[0034]反向引物:GGATCCGAGATGTCGCGGTACGTGGAGTBamHI
[0035]由深圳华大基因公司合成。
[0036]步骤2、启动子PoscolcM的获得
[0037]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子PoscoId4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序:
[0038]95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循环 35 次；最后 72°C延伸 1min0
[0039]回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1841bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上,按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用PstI和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子PoscolcM,其核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0040]植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0041]从上面“启动子PoscolcM的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用PstI和BamHI双酶切，回收启动子Poscold4片段。同时利用PstI和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的PoscolcM片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子PoscolcM与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-P0SC0ld4(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
[0042]利用启动子PoscolcM驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0043]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0044]成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌转化。
[0045]采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得PoscolcM::gus转基因水稻植株,该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformat1n based on phosphomannose isomerase positive select1n in Japonicarice (Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.D0I10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
[0046]步骤2、Poscold4-pCAMBIA1391植株的冷胁迫处理和PoscolcM的冷响应活性
[0047]将萌发后7 天的 Poscold4-pCAMBIA1391 植株和作为对照的 PActin_pCAMBIA1391植株(来自于美国康奈尔大学，由目前基因工程中常用的组成型启动子水稻PActin驱动GUS基因，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)分别置于低温(4°C )中，4小时、8小时、12小时、24小时和48小时处理后分别取全株样本，使用天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，再使用天根生化科技有限公司的FastQuant RT试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，以ACTIN基因为内参，以天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus实时荧光定量PCR预混液为反应试剂，在ABI公司的PRISM7500荧光PCR仪上，通过qRT-PCR反应检测P0scold4和PActin启动子驱动的⑶S表达强度。其中，用于标定ACTIN基因的定量qRT-PCR引物为:
[0048]ACTIN 上游引物:5，-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3，，
[0049]ACTIN 下游引物:5’ -CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’
[0050]用于检测⑶S基因表达的qRT-PCR引物为:[0051 ]⑶S 上游引物:5’ -TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3，
[0052]⑶S下游引物:5’ -CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3 ’
[0053]结果显示，在没有冷诱导时，Poscold4-pCAMBIA1391植株中Gus基因的表达量仅约为PActin驱动⑶S活性的万分之五，而随着冷处理，PoscolcM表达活性显著提高，在冷处理24小时后，PoscolcM表达活性为PActin启动子的1.5倍以上，结果见图3。该结果说明PoscolcM是一种低本底、冷响应灵敏且诱导后强度极高的冷诱导启动子。
[0054]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【权利要求】
1.一种植物冷诱导强表达启动子P0SC0ld4，其特征在于，所述植物冷诱导强表达启动子Poscold4包含SEQ ID No:1所不的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物冷诱导强表达启动子PoscolcM，其特征在于，所述植物冷诱导强表达启动子PoscolcM的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
3.—种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1-2中任意一项所述的植物冷诱导强表达启动子Poscold4。
4.一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导强表达启动子PoscolcM，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导强表达启动子PoscolcM连接于载体中待表达的基因序列的上游。
5.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因或耐冷基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Poscold4，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。
6.—种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-2中任意一项所述的植物冷诱导强表达启动子PoscolcM、权利要求3所述的表达盒、或根据权利要求4或5所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。
7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-2中任意一项所述的植物冷诱导强表达启动子PoscolcM、权利要求3所述的表达盒、或根据权利要求4或5所述的重组表达载体、或者权利要求6所述的宿主菌。
8.一种根据权利要求1-2中任意一项所述的植物冷诱导强表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括:将根据权利要求1-2中任意一项所述的植物冷诱导强表达启动子PoscolcM连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物:水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N5/10GK104073493SQ201410326194
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 李莉, 李 浩, 秦瑞英, 马卉 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所