一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、作物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在作物基因工程中。本发明提供的启动子可以特异地驱动外源基因在作物颖果糊粉层中表达，从而可有效用于种子品质和萌发特性的基因工程改良。用于改善作物颖果糊粉层的性状。
【专利说明】—种作物糊粉层特异表达启动子PosALI及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和作物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种作物糊粉层特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在颖果糊粉层中特异表达，从而可在不影响其他组织部位生理活动的情况下达到通过改变糊粉层结构特性改良种子品质或萌发能力的目的。
【背景技术】
[0002]启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，通过和众多转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义。如何让外源基因在植物体内定向、高效、稳定的表达是植物基因工程研究的出发点和落脚点。用组织特异表达启动子来驱动目的基因表达可有效的避免用组成型表达启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。
[0003]主要的单子叶主粮作物如水稻和小麦的表层胚乳会形成糊粉层，在颖果发育过程中，糊粉层将灌浆物质转运到胚和胚乳细胞内部；籽粒萌发时，分泌水解酶水解胚乳细胞中贮藏的淀粉和蛋白从而发挥重要的水解功能，同时糊粉层细胞也是种子中主要积累脂类、蛋白、维生素、铁锌元素的部位，因此，糊粉层细胞是作物基因工程改良的主要靶点。要精确操纵糊粉层细胞的生理生化活性，糊粉层特异表达启动子将至关重要，但目前仅有少量的特异启动子的报道，如大麦LTP2启动子和玉米AL9启动子，远远无法满足分子设计育种的需求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种驱动外源基因特异的在作物糊粉层特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“作物”是指单子叶作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0005]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种作物糊粉层特异表达启动子，所述作物糊粉层特异表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ IDNo:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为PosALl或启动子PosALl。具体而言,本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)中L0C_0s03g49190基因前包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列具有驱动目标基因在作物糊粉层特异表达的作用。并且分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0006]优选地，本发明提供的作物糊粉层特异表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即PosALl或启动子PosALl。
[0007]另一方面，本发明提供一种作物糊粉层特异表达启动子，其DNA序列与SEQ IDNo:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者,所述作物糊粉层特异表达启动子为在SEQID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述作物糊粉层特异表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些作物糊粉层特异表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在作物中表达。
[0008]另一方面，本发明还提供一种包含上述作物糊粉层特异表达启动子的表达盒。
[0009]又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的作物糊粉层特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述作物糊粉层特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosALl，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即PosALl或启动子PosALl构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIAl391-P0SAL1。
[0010]或者待表达基因可以为任何对作物的糊粉层性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在糊粉层中特异性地集中表达，从而实现改善作物糊粉层相应性状的功能。
[0011]另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述作物糊粉层特异表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0012]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述作物糊粉层特异表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0013]再一方面，本发明提供上述作物糊粉层特异表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述作物糊粉层特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。
[0014]并且优选地，所述应用可以用于改良作物生长特性，所述作物为单子叶作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0015]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0016]aatcactac2 caataWtt ,gfa^cccaal tlcaagactt accgalcall lgtgcaggag60
gglgigaaac algggalctc UgcUgtcl caagaclcgl algglgccta taligctgcg120
IcaLgcatgg ataacaggia Laaccgcaal caaccacacl gcctcagact IaaLatgcca180
UlgLgaagg ctgccULga cLilaLaagc ctticaggal ctaUlgtac agigclctic240
atatggataa aggcccaatt aaggcttaca clggcagcaa aatlgaatct tutttgtca300
agglcagtga glgaacaagc tgagtlgatl tccalttUc aaaccgcalg cclgcttgtt360
cltaggtagt Utatctgct atgUUata acacctgata tgttggtcaa atgcagtctg420
clatcagccc tgatggaaci cacaUcUg gtggttcgag tgatggcaac gtgtacttat480
ggcaggtagt lgttggalca lgttalcatl tcgcacacgc atlagctgct cUUaciit540
clallcalgc cactactttl tcaclgacat agglggalca gcctgaaaga gglcclalaa600
LUtggaagg ccalgaaggt gaagctactl cagttgactg glatgttcta catacaatlg660
LagUlUtl Uglgia aai cLlatcaacc atccaalgil cagatlicag iacgaUtti720
tcacaaitlt cagglgtgca tcagagglcg ggaagalcgc aacgtcalct gacgatlcca780
aggtgagtal gtgatlaacc UgcaaaUl tgtlcatlca actttcatga atcttatgag840
aatgagaicc UUcttUt ctattacaca cctacatgtt gcaagcgaat ttaaatgcct900
gUttggtat gtagaaaggg gagctgctga taticagtat UtttUaag aaaaccaclg960
alaacaacac Utalgatgt gtalcialca ggtlcgcgla lggaalactg agagaagggi1020
gitcccaaac acaagtlccc caacggtcal ccgcaagaga ataaccgcac caaacactgg1080
aagccgglct gcLagccalg agcLagctac tacctcaaga galgtaggag lagcagcclg1140
caccaglgca gatggtgaaL tgccaactgg Ucacgctci ccccUcagc ccagagLact1200
[0017]
【权利要求】
1.一种作物糊粉层特异表达启动子PosALl，其特征在于，所述作物糊粉层特异表达启动子PosALl包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的作物糊粉层特异表达启动子PosALl，其特征在于，所述作物糊粉层特异表达启动子PosALl的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
3.一种作物糊粉层特异表达启动子PosALl，其特征在于，所述作物糊粉层特异表达启动子PosALl的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述作物糊粉层特异表达启动子PosALl为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物； 或者，所述作物糊粉层特异表达启动子PosALl具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。
4.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的作物糊粉层特异表达启动子PosALl。
5.—种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的作物糊粉层特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述作物糊粉层特异表达启动子连PosALl接于载体中待表达的基因序列的上游。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIAl391-PosALl，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达基因是具有改善糊粉层性状功能的基因。
7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的作物糊粉层特异表达启动子PosALl、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5或6所述的重组表达载体。
8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的作物糊粉层特异表达启动子PosALl在培育转基因作物中的应用，其特征在于，所述应用包括:将根据权利要求1-3中任意一项所述的作物糊粉层特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于作物基因工程改良，所述作物为单子叶作物:水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N15/113GK104073492SQ201410326191
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 李莉, 秦瑞英, 李 浩 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所