检测CpG ODN序列纯度的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种使用反相柱、适宜的流动相和洗脱程序进行CpG?ODN纯度的检测的方法。能把CpG?ODN合成过程中缺失的一个碱基（n-1）、两个碱基（n-2），或多了的一个碱基（n+1）、两个碱基（n+2）与主要产物（n）分离开，且该方法操作自动化，可定性定量，精密度高，重现性好；本发明还公开了反相层析色谱柱对CpG?ODN序列纯度进行检测的方法在CpG?ODN序列纯度检测中的应用。
【专利说明】检测CpG ODN序列纯度的方法及应用
[0001] 发明所属领域：
[0002] 本发明涉及一种使用HPLC进行脱氧核苷酸纯度检测的方法，具体地说，本发明涉 及一种使用反相柱、适宜的流动相和洗脱程序进行CpG 0DN纯度的检测。
【背景技术】：
[0003] CpG-ODN是以非甲基化的CpG二级核苷酸为核心，具有免疫刺激作用的核苷酸序 列。早在19世纪90年代，人们就发现给癌症患者注射细菌提取物能明显减轻病情，后来研 究表明，细菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗肿瘤作用。通过合成的寡聚脱氧核苷酸进 行实验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用和其中的非甲基化CpG二核苷酸（CpG)有关。
[0004] CpG-ODN能促进B细胞增殖分化并分泌IL-6,从而诱导抗体的分泌；激活单核细 胞，巨噬细胞，树突状细胞等抗原提呈细胞分泌多种细胞因子，诱导细胞内病原体产生细胞 免疫。因此CpG-ODN作为佐剂提高疫苗免疫效力成为研究热点。目前，Coley公司、Dynavax 公司、云南沃森的国内外三家公司开展了 CpG 0DN作为乙型肝炎疫苗的佐剂进行了研究。
[0005] CpG 0DN采用化学合成是经硫代修饰的单链脱氧寡核苷酸高分子聚合物。合成过 程中工艺采用固相亚磷酰胺合成法，在DNA自动合成仪上进行。按照设定的碱基长度和序 列，经脱保护一偶联一硫代一封闭的多次循环，使DNA寡核苷酸链得以加长。合成产物在浓 氨水条件下去除固相支持物并脱去磷酸和碱基的保护基，得到5'端和3'端都带羟基的硫 代寡核苷酸。
[0006] 化学合成DNA过程中可能存在"n-"，"n+"系列产物。化学合成DNA不及活细胞内 DNA复制具有高保真性，其每次合成循环的错误率约为1/100,通常缺失一个碱基（n-1)或 两个碱基（n-2)，相反也存在着合成过程多了一个碱基（n+1)或两个碱基（n+2)的情况。
[0007] 反相液相色谱是一种以疏水作用为基础的色谱分离模式。由于它具有分辨率高、 重复性好、回收率高等优点，在蛋白质及多肽的分离分析中得到了极为广泛的应用。其特点 是固定相的极性比流动相弱。由于RPLC固相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物 质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。 疏水性较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱，因此较快流出；反之，疏水性相对较强 的分子和固定相间存在较强的相互作用，在柱内保留时间相对较长。
[0008] CpG 0DN为硫代产物本身随链长度的增加疏水差异性减小，这就使得常规反相 HPLC对这些失败序列（相关物质）的分析变得较为困难，在现有技术中，通常采用比用比色 法检测CpG 0DN纯度，如王学菊刘璟等"MTT比色法建立B型CpG 0DN活性检测标准"（《细 胞与分子免疫学杂志》2008年01期，69-71)，人未甲基化寡聚脱氧核苷酸ELISA检测试剂 盒，在中国专利CN100526876C -种未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测方法，公开了采用 特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，然后利用核酸酶P1和细 菌碱性磷酸酶将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法对修饰和未修饰的DNA 水解样品中5-甲基胞嘧啶含量做测定，并通过修饰和未修饰的DNA水解样品中5-甲基胞 嘧啶检出量的差别而对CpG进行定量，但这些方法稳定性差，重复性低，特别是作为疫苗佐 剂使用时，要求纯度高的CpG ODN，且疫苗中的CpG ODN需精确定量，因此该方法在疫苗制品 纯度的检测中存在局限性。
[0009] 目前CpG 0DN佐剂的纯度检测的另外一种方法为毛细管电泳（capi 1 lary electrophoresis, CE)检测。该方法优势为成本低，操作较为简便，劣势为重现性差，对PH 值要求较高，不易应用到实际生产中。且其检测主要设备之一毛细管电泳仪价格昂贵，设 备普及率低，使用该方法检测对于中小企业或资金有限的科研院所会造成较大压力。本发 明所述方法采用高效液湘开展反相液相色谱层析，降低了检测初期对设备要求的成本。而 高效液湘普及率较高，一般的高校及科研院所均有配备，因此租借设备或委托检验比较方 便。本发明所述方法的优点在于投入资金较少的情况下仍能取得良好的检测结果，且操作 简单，重现性能好，易于应用到实际生产中。
[0010] 发明技术内容：
[0011] 本发明的目的是提供一种基于RPC-HPLC技术的CpG 0DN纯度检测方法，该方法能 把CpG 0DN合成过程中缺失的一个碱基（n-1)、两个碱基（n-2)，或多了的一个碱基（n+1)、 两个碱基（n+2)与主要产物（η)分离开，对CpG 0DN序列纯度进行精确检测，弥补现有CpG 0DN序列或核酸纯度检测工作的不足。
[0012] 本发明的再一个目的是提供反相层析色谱柱对CpG 0DN序列纯度进行检测的方法 在CpG 0DN序列纯度检测中的应用。
[0013] 本发明公开了一种使用反相层析色谱柱对CpG 0DN序列纯度进行检测的方法，该 方法是：
[0014] [1]·上Xbridge 0ST C18柱的反相层析色谱柱；
[0015] [2]·输入参数，检测波长245nm ;流速0· 1?lml/min ;柱温30?80°C
[0016] [3].流动相：用A、B液两种流动相进行梯度洗脱；
[0017] [4].用A液平衡色谱柱，待基线平稳后准备上样；
[0018] [5].上样，取20u 1样，注入上样阀，将阀门扳下；
[0019] [6].进行分离，鉴定；
[0020] [7].打印结果，并分析，可得到峰数，峰高，面积百分比，保留时间等参数。
[0021] 其中：A液为10?50mM TEA和200?800mM六氟异丙醇溶液组成；B液为20 %? 80%甲醇的10?50mM TEA和200?800mM六氟异丙醇溶液组成；洗脱方式是在60min内 A液从100 %?0 %，B液从0 %?100 %的顺序梯度浓度进行洗脱；
[0022] 在本发明中，反相层析色谱柱优选为Xbridge 0ST C18柱，柱温为30?80°C，柱流 速为 0· 1 ?lml/min。
[0023] 本发明公开了一种优选的使用反相层析色谱柱对CpG 0DN序列纯度进行检测的方 法，该方法是：
[0024] [1]·上Xbridge 0ST C18柱的反相层析色谱柱；
[0025] [2].输入参数，检测波长245nm ;流速0. 5ml/min ;柱温50°C
[0026] [3].流动相：用A、B液两种流动相进行梯度洗脱；
[0027] [4].用A液平衡色谱柱，待基线平稳后准备上样；
[0028] [5].上样，取20U 1样，注入上样阀，将阀门扳下；
[0029] [6].进行分离，鉴定；
[0030] [7].打印结果，并分析，可得到峰数，峰高，面积百分比，保留时间等参数；
[0031] 其中：A液为30mM TEA和400mM六氟异丙醇溶液组成；B液为40%甲醇的30mM TEA 和400mM六氟异丙醇溶液组成；洗脱方式是在60min内A液从100%?0%，B液从0%? 100 %的顺序梯度浓度进行洗脱；
[0032] 在本发明中，基于RPC-HPLC技术的CpG 0DN序列纯度检测方法，其步骤是：使用反 相层析色谱柱，如 Xbridge OST C18 柱，2. 5um2. 流动相：A 液：15mM TEA+400 mM 六 氟异丙醇；B液：50%甲醇+A ;检测波长：260nm，洗脱程序见下表。计算方法：面积归一化 法。
[0033] 表1 Xbridge OST C18柱的洗脱方式
[0034]
【权利要求】
1. 一种使用反相层析色谱柱对CpG ODN序列纯度进行检测的方法，该方法是： 1) 上Xbridge OST C18柱的反相层析色谱柱； 2) 输入参数，检测波长245nm ;流速0. 1?lml/min ;柱温3(T80°C 3) 用A、B液两种流动相进行梯度洗脱； 4) 用A液平衡色谱柱，待基线平稳后准备上样； 5) 上样，取20 u 1样，注入上样阀，将阀门扳下； 6) 进行分离，鉴定； 7) 打印结果，并分析，可得到峰数，峰高，面积百分比，保留时间等参数； 其中：A液为1(Γ50 mM TEA和20(T800 mM六氟异丙醇溶液组成；B液为209Γ80%甲 醇的l(T50mM TEA和20(T800 mM六氟异丙醇溶液组成；洗脱方式是在60min内A液从 1009Γ0%，B液从09Γ100%的顺序梯度浓度进行洗脱。
2. 根据权利要求1中检测纯度的方法,柱温为50°C。
3. 根据权利要求1中的检测纯度的方法，柱流速为0. 5ml/min。
4. 根据权利要求1中的检测纯度的方法，，该方法是： 1) 上Xbridge OST C18柱的反相层析色谱柱； 2) 输入参数，检测波长245nm ;流速0. 5ml/min ;柱温50°C 3) 用A、B液两种流动相进行梯度洗脱； 4) 用A液平衡色谱柱，待基线平稳后准备上样； 5) 上样，取20 u 1样，注入上样阀，将阀门扳下； 6) 进行分离，鉴定； 7) 打印结果，并分析，可得到峰数，峰高，面积百分比，保留时间等参数； 其中：A液为30 mM TEA和400 mM六氟异丙醇溶液组成；B液为40%甲醇的30mM TEA 和400 mM六氟异丙醇溶液组成；洗脱方式是在60min内A液从1009Γ0%，B液从09Γ100% 的顺序梯度浓度进行洗脱。
5. 反相层析色谱柱对CpG 0DN序列纯度进行检测的方法在CpG 0DN序列纯度检测中的 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104195235SQ201410391955
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】杨喆, 马波, 王丽丽, 徐娅妮, 李镭, 何丽芳, 李伟, 代云波, 柴俊东, 钱雯, 唐业峰, 赵志宏 申请人:云南沃森生物技术股份有限公司