日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法，包括以下步骤：用血吸虫尾蚴分别感染小鼠；对感染后的小鼠在SPF级动物房饲养；分别收集单性和双性感染的日本血吸虫雌虫；分别对该雌虫做solexa分析与iTRAQ分析；通过对比这四个发育阶段核糖体蛋白表达谱和基因表达谱，得到雌虫在不同发育阶段，核糖体蛋白在蛋白和基因两个水平的表达特点。与现有技术相比，本发明通过Solexa和iTRAQ组合分析雌雄血吸虫合抱前后雌虫核糖体基因表达谱和蛋白表达谱，并结合real-time PCR和western技术验证，可有效确定雌虫发育调控中关键核糖体蛋白。该蛋白的鉴定将为通过影响虫体核糖体功能为目的，以干预宿主体内虫体发育并维持宿主伴随免疫保护力的防治措施的研发提供关键依据。
【专利说明】日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生命医学科学领域，尤其是涉及一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核 糖体蛋白的鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 血吸虫感染人体后，性成熟所导致的大量虫卵的产生和释放是造成血吸虫病的根 本原因。另外，现有药物治愈血吸虫病后，患者仍可因接触疫水而再次感染，不具有免疫保 护力。研究表明，活虫在人体内可刺激人体产生抵御再次感染的免疫保护力，但是，活雌虫 本身会因性成熟产卵而致病。因此，目前急需建立一种方法能调节感染者体内血吸虫发育， 即使感染者长时间保持免疫力，但又不致于患病。研究发现，核糖体不仅是蛋白合成细胞 器，同时又是蛋白表达调控者。尤其，在血吸虫性成熟发育过程中，个性化核糖体装配在雌 虫性成熟发育中发挥重要作用。分析和鉴定关键核糖体蛋白将为研发新的防治措施奠定基 础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种日本血吸虫雌 虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法，通过Solexa和iTRAQ分析雌雄血吸虫合抱前后基 因表达谱和蛋白表达谱，并结合real-timePCR和western技术验证，可有效确定雌虫发育 调控中关键核糖体蛋白。该蛋白的鉴定将为通过影响虫体核糖体功能为目的，以干预宿主 体内虫体发育并维持宿主伴随免疫保护力的防治措施的研发提供关键依据。
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0005] -种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法，包括以下步骤：
[0006] (1)用血吸虫尾蚴感染小鼠：包括单螺释放单性尾蚴进行单性感染与多螺释放混 合尾蚴进行的双性感染两种方式；
[0007] (2)对感染后的小鼠在SPF级动物房饲养，饲养包括两个阶段四个时期，即单性感 染18天和23天以及双性感染18天和23天；
[0008] (3)收集培养后小鼠体内的日本血吸虫：若单只小鼠仅获得雌虫，作为单性雌虫 样本，若单只小鼠获得两性虫体，分离雌虫，作为双性雌虫样本；
[0009] (4)将步骤（3)所得雌虫转移到Trizol试剂中，做SOlexa分析：分别分析不同雌 虫样本基因表达谱，分析和比较不同样本核糖体基因表达差异；
[0010] (5)将步骤（3)所得雌虫转移到生理盐水中，做iTRAQ分析：分别分析不同雌虫样 本核糖体蛋白表达谱，分析和比较不同样本核糖体蛋白表达差异；
[0011] (6)通过对比不同发育阶段核糖体蛋白表达谱和基因表达谱，得到雌虫在不同发 育阶段，核糖体蛋白在蛋白和基因两个水平的表达特点。
[0012] 在步骤（4)做solexa分析后，用Real-timePCR方法验证solexa技术分析质量。
[0013] 在步骤（5)做iTRAQ分析后，对其中高表达的蛋白进行Westernblot验证。
[0014] 步骤（1)中对小鼠进行感染时，利用单螺释放单性尾蚴的特点，按一螺释放的尾 蚴感染一只小鼠，或者用不同螺释放的血吸虫尾蚴组合后感染小鼠。
[0015] 对感染后的小鼠在SPF级动物房饲养18天时，血吸虫为合抱前未发育的状态，培 养至23天时，为合抱后性成熟的状态，取这两个时间点的小鼠进行分析。
[0016] 收集培养后小鼠体内的日本血吸虫的方法为：用无菌预冷生理盐水从小鼠主动脉 灌注，冲出血吸虫，然后将血吸虫在无菌生理盐水中洗3次。
[0017] 做solexa分析之前，在解剖镜下，用注射器针头挑取并转移新鲜雌虫到含有 IOOOulTrizol试剂的EPP管中，-80°C保存备用，或者直接匀浆取RNA。
[0018] 做iTRAQ分析之前，在解剖镜下，用注射器针头挑取并转移新鲜雌虫到含有 IOOOul生理盐水的EPP管中，液氮中保存备用。
[0019] 由于不同发育阶段的雌虫可表达不同核糖体蛋白，装配构成不同的核糖体，即个 性化核糖体，以完成不同发育阶段的特殊需求和功能。基于此分析，可获得发育阶段特异性 表达的核糖体蛋白，这为针对性地选取不同核糖体蛋白进行旨在干预核糖体功能的深入研 究提供了条件。因此，本发明方法的建立将核糖体装配、虫体发育阶段以及阶段特异性蛋白 表达联系起来，通过Solexa和iTRAQ分析雌雄血吸虫合抱前后基因表达谱和蛋白表达谱， 并结合real-timePCR和western技术验证，可有效确定雌虫发育调控中关键核糖体蛋白。 该蛋白的鉴定将为通过影响虫体核糖体功能为目的，以干预宿主体内虫体发育并维持宿主 伴随免疫保护力的防治措施的研发提供关键依据，为相近物种的相似研究和应用提供了依 据。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为日本血吸虫单性和双性感染发育18天（合抱前未发育）和23天（合抱后 性成熟）时核糖体基因表达谱比较；
[0021] 核糖体代谢通路中基因差异表达情况：A. 23SSI(单性感染23天）和18SSI(单性 感染18天）；B. 18SSI和18DSI(双性感染18天）；C. 23DSI(双性感染23天）和18DSI; D. 23DSI和23SSI.上箭头：基因上调表达；下箭头：基因下调表达。
[0022] Solexa分析不同样品中核糖体蛋白差异表达情况：E. 18SSI和18SSI;F. 18SSI和 23SSI;G. 23SSI和 23DSI;H. 18DSI和 23DSI;
[0023]图 2 为RealtimePCR分析三个核糖体蛋白（CAX72575. 1，CAX77721. 1， CAX78924. 1)在日本血吸虫单性和双性感染发育18天（合抱前未发育）和23天（合抱后 性成熟）时的表达差异；
[0024] 图3为日本血吸虫双性感染后发育18天和23天以及单性感染发育23天时核糖 体蛋白RPL8和RPLll的westernblot分析结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026] 实施例
[0027] 用Solexa技术分析基因表达谱，方法见下：
[0028](1)利用单螺释放单性尾蚴的特点，按一螺释放的尾蚴感染一只小鼠，获得单性虫 的原则。
[0029] (2)用至少50只螺分别感染50只小鼠，继之，用不同螺释放的尾蚴组合，再感染至 少20只小鼠。在SPF级动物房饲养18天和23天。若单只小鼠仅获得雌虫，可作为单性雌 虫样本；若单只小鼠获得两性虫体，分离雌虫，作为双性雌虫样本。
[0030] (3)分别于第18天和23天收集雌虫。首先用无菌预冷生理盐水从小鼠主动脉灌 注，冲出18天或23天血吸虫，在无菌生理盐水中洗3次。
[0031] (4)在解剖镜下，用注射器针头挑取并转移新鲜雌虫：转移到含有IOOOulTrizol 试剂的EPP管中，-80度保存备用，或者直接匀浆取RNA(方法见Trizol使用说明书）。做 solexa分析用。华大基因公司协助完成样本基因表达谱分析。
[0032] 通过solexa技术分别分析不同雌虫样本基因表达谱，分析和比较不同样本核糖 体基因表达差异。见图1(E、F、G和H)。Solexa分析后的基因表达谱揭示，合抱后雌虫核糖 体蛋白基因差异表达特征明显。提示，合抱后的雌虫可能基于核糖体蛋白差异表达而装配 个性化的核糖体。
[0033] 同时，用Real-timePCR方法验证solexa技术分析质量。其中，以下列三核糖体 蛋白基因为标准（见表1)，作为Solexa分析的质控。
[0034]表1.核糖体蛋白基因及引物序列
[0035]
【权利要求】
1. 一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 用血吸虫尾蚴感染小鼠：包括单螺释放的血吸虫单性尾蚴进行的单性感染与多螺 释放的混合尾蚴进行的双性感染两种方式； (2) 对感染后的小鼠在SPF级动物房饲养，饲养包括两个阶段四个时期，即单性感染18 天和23天以及双性感染18天和23天； (3) 收集培养后小鼠体内的日本血吸虫：若单只小鼠仅获得雌虫，作为单性雌虫样本， 若单只小鼠获得两性虫体，分离雌虫，作为双性雌虫样本； (4) 将步骤（3)所得雌虫转移到Trizol试剂中，做solexa分析：分别分析不同雌虫样 本基因表达谱，分析和比较不同样本核糖体基因表达差异； (5) 将步骤（3)所得雌虫保存在生理盐水中，做iTRAQ分析：分别分析不同雌虫样本核 糖体蛋白表达谱，分析和比较不同样本核糖体蛋白表达差异； (6) 通过对比不同发育阶段核糖体蛋白表达谱和基因表达谱，得到雌虫在不同发育阶 段，核糖体蛋白在蛋白和基因两个水平的表达特点。
2. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，在步骤（4)做solexa分析后，用Real-time PCR方法验证solexa技术分析质 量。
3. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，在步骤（5)做iTRAQ分析后，对其中高表达的蛋白进行Western blot验证。
4. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，步骤（1)中对小鼠进行感染时，利用单螺释放单性尾蚴的特点，按一螺释放的 尾蚴感染一只小鼠，或者用不同螺释放的尾蚴组合后感染小鼠。
5. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，对感染后的小鼠在SPF级动物房饲养18天时，血吸虫为合抱前未发育的状态， 培养至23天时，为合抱后性成熟的状态，取这两个时间点的小鼠进行分析。
6. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，收集培养后小鼠体内的日本血吸虫的方法为：用无菌预冷生理盐水从小鼠主 动脉灌注，冲出血吸虫，然后将血吸虫在无菌生理盐水中洗3次。
7. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，做solexa分析之前，在解剖镜下，用注射器针头挑取并转移新鲜雌虫到含有 lOOOul Trizol试剂的EPP管中，-80°C保存备用，或者直接匀浆取RNA。
8. 根据权利要求1所述的一种日本血吸虫雌虫发育调控关键核糖体蛋白的鉴定方法， 其特征在于，做iTRAQ分析之前，在解剖镜下，用注射器针头挑取并转移新鲜雌虫到含有 lOOOul生理盐水的EPP管中，液氮中保存备用。
【文档编号】C12Q1/68GK104357559SQ201410582375
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】孙军, 王素文 申请人:同济大学