分泌犬p27单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种犬p27单克隆抗体的制备及其应用。本发明提供了一种保藏号为CGMCCNO.9457的小鼠杂交瘤细胞3G8，还提供了由保藏号为CGMCCNO.9457的小鼠杂交瘤细胞3G8产生的单克隆抗体。本发明所述的杂交瘤细胞3G8分泌的单克隆抗体具有良好反应活性，可应用于犬乳腺肿瘤组织中p27蛋白的检测，解决了目前的检测难题，为其在犬乳腺肿瘤以及其他疾病的深入研究奠定基础，为临床上相应的治疗及预后提供了有效手段。
CGMCCNo.9457
2014.07.15
【专利说明】分泌犬027单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分泌犬？27单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]￠27蛋白作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(161)611(16111: 1^111886
0(18),通过与各种细胞周期素-细胞周期素依赖性激酶(0701111-⑶10复合物作用发挥广谱的抑制0)1(的活性，调控细胞周期的进程，具有诱导细胞分化、促进凋亡、调节肿瘤耐药性等功能，其活性的改变与细胞凋亡的发生存在明显相关性。前期的研究结果表明，恶性肿瘤中？27表达量显著降低，证明1)27蛋白与肿瘤的发生与转移存在明显的相关性，它也被认为是具有潜在价值的独立预后因子。进一步对？27蛋白生物学功能的机制研究成为当前热点。
[0003]人类乳腺肿瘤以及其他的肿瘤细胞系过表达？27不仅诱导细胞周期阻滞和 ⑶1(的活性降低，还能有效的促进细胞凋亡发生。犬乳腺肿瘤是兽医临床上常见的疾病，其发病率呈逐年上升趋势，对犬的健康构成严重危害，寻求犬乳腺肿瘤诊断及预防的关键靶点是当前的研究热点。因生活及饮食习惯更和人类接近，相比于鼠，犬是更为理想的实验动物模型，对于犬肿瘤的研究不仅对兽医临床有重要价值，对于人医肿瘤临床的研究也同样具有重要意义。市面上销售的针对？27蛋白的抗体均为针对人源或者鼠源，没有针对犬源的，所以本发明制备犬27单克隆抗体，使人们能开展？27与犬乳腺肿瘤的相关研究具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种分泌犬？27单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株分泌的犬？27单克隆抗体能够应用于犬乳腺肿瘤病理组织样品中1)27蛋白的检测。
[0005]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
[0006]本发明所提供的杂交瘤细胞株为能够分泌犬]327单克隆抗体，该杂交瘤细胞株已于2014年7月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06100 ”，保藏号为9457。地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101。该杂交瘤细胞株的建立是利用原核表达技术，表达犬？27蛋白为抗原，免疫8八18八小鼠，利用淋巴胞杂交瘤技术建立的特异单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。用该杂交瘤细胞制备的单克隆抗体，经免疫组织化学染色证明，此单克隆抗体能有效的结合犬细胞内？27蛋白。间接实验表明:杂交瘤细胞培养液上清效价1:: 6400。本发明的特点如下:
[0007]1.本发明使用的免疫原是从经奶-？0？方法克隆的犬？27基因，利用原核表达技术制备的犬]327蛋白。
[0008]2.本发明所制备的单克隆抗体是针对犬种属1)27蛋白，具有种属特异性，免疫组化实验证明其有效的和犬肿瘤细胞中的p27蛋白结合，根据其结果可以对犬肿瘤患犬的诊断及治疗提供指导意义。
[0009]本发明筛选得到I株小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma) 3G8,已于2014年7月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)”，保藏号为CGMCCN0.9457。并对其进行生物学鉴定，以期进一步探讨p27的蛋白水平与犬乳腺肿瘤发生、发展的内在联系。本发明中的单克隆抗体具有良好的特异性，为其在肿瘤以及其他疾病发生反应中起到相应的作用关系及其功能的深入研究提供依据和奠定基础，为临床上相应的治疗及预后提供了有效手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为犬p27基因片段RT-PCR扩增结果
[0011]图2为重组犬p27蛋白的SDS-PAGE及纯化后的重组蛋白
[0012]图3为杂交瘤细胞形态
[0013]图4为杂交瘤细胞株染色体鉴定
[0014]图5为Western blot分析单克隆抗体特异性实验结果
[0015]图6为单克隆抗体的免疫组化分析结果
【具体实施方式】
[0016]实例1ρ27基因的克隆及测序
[0017]根据GenBank中canine p27的cDNA序列(ΝΜ_001002957)，利用引物设计软件oligo 6.24设计了一组特异性引物，同时在正向引物中引入EcoR I酶切位点，反向引物中引入Sal I酶切位点。正向引物为5-CGGAATTCATGGCAAACGTGCGAGTGTCTAACG-3，反向引物为5-CGGTCGACTTACGTTTGACGTCTTCTGAGGC-3。利用上述弓I物PCR扩增犬p27基因开放阅读框内位核苷酸，DNA纯化试剂盒纯化回收PCR产物，使其插入pET28 (a)载体，获得pET28 (a) -p27重组质粒。将该重组质粒按常规方法转入感受态细胞DH5ci，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序。上述所采用的PCR扩增，EcoR和Sal I双酶切，DNA回收，连接于转化等均为现有技术。
[0018]实例2免疫原的制备
[0019]分别将构建的重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)中，涂于Kan_抗性的固体LB平板上，37°C过夜培养。挑取阳性克隆接种于Kan-抗性的液体LB培养液中，37 (°C、250r/min摇床震荡过夜培养。将过夜活化的阳性克隆按照1: 100的比例接种于Kan-抗性的液体LB培养液中，摇床37°C，250r/min震荡培养至OD值达0.6左右时，加入ImM IPTG，置摇床中250r/min震荡，37°C培养，之后9000rpm离心收集菌体，弃掉上清并用PBS洗三次。按照原培养液1/100的比例，用PBS重悬菌体沉淀并进行超声破碎，4°C下12000g离心30min后，收集上清液。按照Novagen说明书方法将上清通过N1-NTA树脂进行重组蛋白纯化后_70°C保存。
[0020]实例3动物免疫程序
[0021]将纯化的His_p27蛋白按100 μ g/只的剂量与等量法国206VG白油佐剂混合，皮下途径接种6周龄雌性BALB/c小鼠，两周后肌肉途径第二次免疫，再经两周腹腔途径第三次免疫。两周后断尾采血，western blot检测血清(I: 1000)效价,对效价达到1: 1000以上的小鼠，经腹腔内注射加强免疫无佐剂等量抗原，3日后取小鼠脾细胞进行融合。
[0022]实例4杂交瘤细胞株的建立
[0023]I饲养层细胞的制备
[0024]I)细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，取I只清洁级雌性BALB/c小鼠摘除眼球放血处死。于75%酒精中浸泡5min，以下操作均在超净工作台中进行。
[0025]2)将小鼠腹部向上放置于平皿中，用镊子轻轻提起腹正中部皮肤，用眼科剪刀横向剪一小切口，切勿剪破腹膜，撕开腹部皮肤，使腹膜充分暴露。用镊子轻轻提起腹膜，用1mL无菌注射器吸取HAT完全培养液轻轻注入腹腔，注意切勿刺破脏器或肠道造成污染，轻轻按摩腹部两侧30秒左右，用注射器缓慢抽吸腹腔内微黄色液体，重复以上操作I次。抽吸时注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞注射器。
[0026]3)将取出的腹腔细胞加入到50mLHAT培养液中，充分吹散混匀后，分装于5块96孔培养板中，100 μ L/孔。置于37°C、5% CO2培养箱中培养。
[0027]2骨髓瘤细胞的准备
[0028]I)融合前I?2d，扩大培养骨髓瘤细胞，使其处于对数生长期，且生长状态良好。
[0029]2)融合当天，弃去培养液，并用无血清DMEM轻轻冲洗两次，用15mL DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上轻轻吹下。取少量骨髓瘤细胞悬液，用细胞计数板计数，准备融合。
[0030]3免疫脾细胞的准备
[0031]I)融合前，将加强免疫的小鼠眼球采血处死，制备阳性血清。浸泡于75%酒精5min后放于超净工作台。
[0032]2)将小鼠固定于鼠架上，无菌打开腹腔，分离结缔组织取出脾脏，将脾脏放入盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用无菌注射器吸取培养液轻轻吹出脾细胞，反复操作3?4次。
[0033]3)将脾细胞悬液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液约至30mL，混匀。对细胞悬液用细胞计数板计数，备用。
[0034]4脾细胞与骨髓瘤细胞融合
[0035]DHAT培养液，DMEM基础培养液及ImL 50% PEG于37°C水浴中预热，另备42°C预热的灭菌水500mL。
[0036]2)上述准备的对数生长期SP2/0细胞与免疫小鼠脾细胞按1: 5，加入50mL离心管中，轻轻颠倒混匀。26°C，100rpm离心1min,弃上清，重复洗涤一次(非常关键)，沣意管中DMEM要彻底倒干净。用手掌轻击离心管底部，使底部细胞松散均匀呈糊状。
[0037]3)融合过程在盛有42°C水的融合杯中进行，将ImL 37°C预热的PEG溶液逐滴加入到50mL离心管中，边加边缓慢转动离心管，并于Imin内加完，静置I?2min。
[0038]4)先慢后快地加入DMEM基础培养液终止反应，第Imin滴加ImL DMEM，第2min滴力口 lmLDMEM，第 3min 滴加 3mL DMEM，第 4min 滴加 1mL DMEM，第 5min 滴加 1mL DMEM0 静置2min。轻轻颠倒2次,静置7min。800rpm离心1min,弃去上清。用55mL HAT培养液轻轻重悬细胞，100 μ L/孔接种于已培养有饲养细胞的96孔培养板中，置37°C 5%的CO2培养箱中培养。
[0039]5) 5d后半量换液，8d后半量换液，待细胞长至孔底面积1/4?1/3时取上清进行筛选检测并更换为HT培养液。
[0040]5杂交瘤细胞的筛选
[0041]应用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清，筛选杂交瘤细胞克隆，将阳性克隆扩大培养，并及时进行细胞冻存与克隆纯化。
[0042]实例5单克隆抗体的鉴定
[0043]将杂交瘤细胞培养上清进行系列稀释，用间接ELISA法测定抗体效价。同时设定阴性、阳性对照。P/N比值大于2.1的MAb最大稀释度为其ELISA效价。
[0044]应用SBA Clonotyping? System/HRP 抗体亚类鉴定试剂盒(Southern B1tech 公司)鉴定单克隆抗体的亚类。具体方法:取已包被的间接ELISA板，以杂交瘤细胞上清为一抗，以 1: 2500 倍稀释的 HRP 标记的羊抗鼠 IgA, IgM, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、κ、λ 为二抗，TMB室温避光显色15min，读取OD45tol。
[0045]杂交瘤细胞染色体数鉴定:
[0046]1.取105个/mL细胞，加秋水仙素(终浓度0.2 μ g/mL)，继续培养4h ；
[0047]2.1000r/min离心5min,弃上清,加6?8mL 0.075mol/L KCl,立即用吸管将细胞团吹散打匀，室温下低渗处理25min ；
[0048]3.1000r/min离心5min,弃上清,沿管内壁加6?8mL新鲜配制的3:1甲醇冰乙酸固定液，立即用吸管将细胞团吹散打匀，静置固定30min，1000r/min离心5min，弃上清，同法固定I次；
[0049]4.用新鲜配制的1:1甲醇冰乙酸固定液进行第三次固定,20min后，1000r/min离心5min，弃上清，留0.2mL左右的细胞团和上清液；
[0050]5.加适量(约5倍于细胞体积)的1:1甲醇冰乙酸固定液，制成细胞悬液。滴片，自然干燥，Giemsa染色,镜检并计数染色体数目。
[0051]将重组蛋白的SDS-PAGE、转印、封闭等操作同2.2.5，以杂交瘤细胞培养液为一抗，羊抗鼠HRP-1gG(l: 2000)为二抗，DAB底物显色液中显色，观察结果。
[0052]实例6单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定
[0053]1、石蜡切片脱蜡至水。
[0054]2,3% H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。
[0055]3、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min X2 (如需抗原修复，可在此步后进行)。
[0056]4、微波抗原修复:将切片浸入抗原修复液中，加热煮沸5min后，放置5_10min ;重复1-2次。冷却后PBS洗5minX3次
[0057]5、5%正常山羊血清(5% BSA)封闭，室温孵育lOmin，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37°C孵育l_2h或4°C过夜。
[0058]6、PBS 冲洗，5minX3 次。
[0059]7、滴加适量的生物素标记二抗工作液，37°C孵育10_30min。
[0060]8、PBS 冲洗，5minX3 次。
[0061]9、滴加适量的碱性磷酸酶或辣根酶标记的链霉卵白素工作液，3 7 °C孵育10_30min。
[0062]10、PBS 冲洗，5minX 3 次。
[0063]11、显色剂显色3-15min，显微镜下控制染色(DAB或NBT/BCIP)
[0064]12、在自来水的充分冲洗后，苏木精轻度复染，脱水，透明，封片。
[0065]13、观察结果。
【权利要求】
1.一株分泌犬p27单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3G8，该杂交瘤细胞株已于2014年7月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)”，保藏号为 CGMCCN0.9457。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的犬P27单克隆抗体。
3.—种如权利要求2所述的单克隆抗体在检测犬乳腺肿瘤组织样品中p27蛋白的应用。
【文档编号】C12N5/20GK104328088SQ201410582165
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】刘云, 杨超, 包军, 姚薇, 李超斯, 童津津, 李情 申请人:东北农业大学