山羊脂联素基因真核表达载体的构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种山羊脂联素蛋白真核表达载体的构建和应用。所述的山羊脂联素基因编码区的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。将山羊脂联素基因的完整编码区片段经过双酶切，连接到同样经过双酶切pEGFP-N1载体中，这样可以构建山羊脂联素蛋白真核表达载体。该真核表达载体构建方法简单可行，可以高效的增强山羊脂联素蛋白的表达，并且都包含绿色荧光蛋白，可以检测山羊脂联素蛋白真核细胞中的表达和定位。本发明提供的真核表达载体也可以应用于研究脂联素蛋白在山羊脂肪沉积过程中的作用。
【专利说明】山羊脂联素基因真核表达载体的构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种山羊脂联素基因真核表达载体的构建方法及其在山羊脂肪沉积方面的应用。
【背景技术】
[0002]动物体内脂肪组织既是重要的储能器官，又是重要的内分泌器官。脂肪组织能分泌多种脂肪因子，如脂联素(Adiponectin, AdipoQ)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosisfactor α , TNF α )、瘦素(Leptin, LEP)> 白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、抵抗素(Resistin,RETN)等。AdipoQ在血液中有很高的浓度(5?30 μ g/mL),达到血衆总蛋白的
0.01%?0.05%。AdipoQ在多中生理功能中都起着重要的作用，能增强II型糖尿病患者的胰岛素敏感性，用于治疗II型糖尿病；调控糖脂代谢，抑制糖原的水解，促进血液中游离脂肪酸的氧化及葡糖糖的吸收；抑制粒细胞、单核巨噬细胞集落形成及巨噬细胞的吞噬活力，起到抗炎症作用；抑制血管内膜增厚及平滑肌细胞增殖，起到抗动脉粥样化作用等。AdipoQ通过血液循环到达全身各个器官，以不同形式与相应的受体结合，在整个机体中都起着重要作用。
[0003]研究发现在动物模拟试验中改变脂联素的含量或者用重组脂联素体外处理细胞和肌肉都能调控葡萄糖和脂肪酸的代谢，其通过促进葡萄糖运载体4 (GLUT4)向细胞膜转移来增加葡萄糖的吸收，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)及过氧化物酶体增殖激活受体(PPARα )通路来增加脂肪酸的吸收和氧化,但这中作用可由Leptin引起的AdipoRl/2水平降低而减弱AdipoQ能改善高糖诱发的胰岛素抵抗，并且降低血清中的甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，抑制脂蛋白酯酶活性及胰岛素调控的葡萄糖产生[2]，另外发现AdipoRl和AdipoR2的表达量与胰岛素敏感性呈正相关[3]。高血糖症个体骨骼肌中AdipoRl的表达量降低50%，从而抑制了 gAd调控的葡萄糖转运体4 (GLUT4)转位，降低对葡糖糖、脂肪酸的吸收及氧化；但增强了全长型AdipoQ的糖、脂代谢功能[4]。
[0004]Wu等[5]利用地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和胰岛素联合诱导剂处理绵羊SMSCs，结果表明SMSCs能沉积脂肪并分化为类脂肪细胞。Teboul等[6]研究发现脂肪酸能使C2C12细胞沉积脂肪并分化为类脂肪细胞，同时检测到相关脂肪酸合成基因的表达量显著升高。研究还发现高浓度葡萄糖能通过SREBP-1c通路调控肌管中脂肪酸的从头合成，并在mRNA和蛋白水平均检测到SREBP-lc、ACC和FAS等脂肪酸合成基因表达量有显著性升高并分化为脂肪细胞等，表明SMSCs是具有多分化潜能的肌源性干细胞m。AdipoQ作为一种重要的脂肪因子，在肌肉中的糖脂代谢调节等发面起着重要作用。因此可以通过AdipoQ来调控肌肉中脂肪酸的合成，增加肌内脂肪含量，从而改善山羊肌肉品质。
[0005][I]Yamauchi Tj Kamon Jj Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptorsthat mediate antidiabetic metabolic effects [J].Nature, 2003，423(6941):762-769. [2]CombsTPj Pajvani UBj Berg AHj et al.A transgenic mouse with adelet1n in the collagenous domain of adiponectin displays elevated circulatingadiponectin and improved insulin sensitivity[J].Endocrinology, 2004，145(1):367-383.[3]CivitareseAEj Ukropcova B，Carling S，et al.Role of adiponectin inhuman skeletal muscle b1energetics[J].Cell metabolism, 2006，4(1): 75-87.[4]Fang X， Palanivel R， Zhou X， et al.Hyperglycemia- andhyperinsulinemia-1nduced alterat1n of adiponectin receptor express1n andadiponectin effects in L6 myoblasts [J].J Mol Endocrinol, 2005， 35(3):465-476.[5]Wu Hj Ren Y，Li S，et al.1n vitro culture and induced differentiat1nof sheep skeletal muscle satellite cells[J].Cell B1l Intj 2012，36(6):579-587.[6]Teboul Lj Gaillard D， Staccini L， et al.Thiazolidined1nes and fattyacids convert myogenic cells into adipose-like cells [J].J B1l Chemj 1995，270(47): 28183-28187.[7]Guillet-Deniau I， Pichard A-Lj Kone A， et al.Glucose induces de novolipogenesis in rat muscle satellite cells through a sterol-regulatory-element-binding-protein-lc-dependent pathway[J].J Cell Scij 2004， 117(10): 1937-1944。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种山羊脂联素基因真核表达载体的构建方法及其在山羊脂肪沉积方面的应用。
[0007]本发明通过以下技术实现:根据pEGFP-Nl载体的多克隆位点和山羊脂联素基因的编码区序列，设计带有保护性碱基、末端分别带有Hind III和BamH I限制性内切酶酶切位点的引物，扩增产物包含山羊脂联素基因的编码区序列。将其构建入pEGFP-Nl载体的Hind III和BamH I两个酶切位点之间。得到山羊脂联素基因不同绿色荧光蛋白融合表达载体 pEGFP-Nl-AD。
[0008]本发明的效果是:利用一对引物进行PCR扩增可以克隆山羊脂联素基因的完整编码区，该真核表达载体构建方法简单可行，可以高效的增强山羊脂联素蛋白的表达，并且都包含绿色荧光蛋白，是研究山羊脂联素蛋白功能的重要技术。
[0009]更详细的技术方案请参见《【具体实施方式】》中的实施例。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的山羊脂联素基因的核苷酸序列。
[0011]图1是山羊脂联素基因的绿色荧光蛋白融合的真核表达载体pEGFP-Nl-AD的结构图。
[0012]图2是山羊脂联素蛋白的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-Nl-AD通过瞬时转染导入山羊骨骼肌卫星细胞后脂肪酸合成及成脂分化相关基因AdipoRl、C/EBP a和PPAR γ )表达量的变化。
[0013]【具体实施方式】:
实施例1:(一)山羊脂联素基因编码区序列的克隆
1.总RNA的提取
(I)将适量液氮倒入研钵中预冷，待温度降低后将组织放入研钵中，再加适当液氮并将组织样研磨成粉末状，然后取粉末样品100 mg于1.5 mL的EP管中，加入I mL预冷的Trizol试剂，震荡混匀，室温静置5 min。
[0014](2)加入氯仿200 μ L，旋涡仪上振荡15 sec混匀，室温静置5 min，然后在4°C条件下 12，000X g 离心 15 min。
[0015](3)将上层水相约500 μ L转移至另一新1.5 mL的EP管，加入等体积的预冷异丙醇，轻轻颠倒数次混匀，置于室温静置10 min，然后在4°C条件下12，OOOXg离心10 min。
[0016](4)移除上清，加入4°C预冷的75 % DEPC酒精I mL，冰上静置5 min，然后4°C条件下7，500 X g离心5 min ；
(5)移除上清，用移液枪吸取多余的液体，室温干燥沉淀。
[0017](6)根据RNA的沉淀的量加入适量的DEPC水溶解RNA，并保存于_80°C超低温冰箱。
[0018]2.cDNA 的合成
利用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit进行cDNA第一条链的合成。第一步除去基因组 DNA:取上述提取的 RNA I μ g，5 XgDNA Eraser Buffer 2 μ L, gDNA Eraser Iμ Ld^WRnase Free dH20至10 μ L,轻轻混勻后瞬时离心,42°C条件下反应2 min。第二步为cDNA的合成:在原体系中加入5 XPrimerScript Buffer 2试剂4 μ L, PrimeScriptRT Enzyme Mix I I μ L, RT Primer Mix I μ L,补 RNase Free dH20 至 20 μ L,混勻后瞬时离心,37°C条件下反应15 min,然后升温至85°C反应5 sec灭活合成酶。合成的cDNA于-20°C保存。
[0019]3.RT-PCR扩增山羊脂联素基因
利用源自脂肪组织的cDNA为模板进行相关基因的克隆。反应体系为:cDNA模板2 μ L，上下游引物各 0.8 μ L (20 PM), 2 XMaster Mix Taq 酶 10 μ L，加灭菌 ddH20 至 20 μ L。
[0020]4.脂联素基因的克隆
(I)根据PMD 19-Τ载体使用说明，向1.5 mL离心管加入0.5 μ? PMD 19-T Vector,4.5μ L的PCR回收产物，5 μ L Solut1n I，轻轻混匀，并置于16°C条件下水浴连接5 h。
[0021](2)将感受态细胞从超低温冰箱中取出后置于冰上慢慢融化，吸取30 μ L感受态细胞与上述连接液混合，轻轻混匀，然后冰浴30 min。
[0022](3) 42°C条件下水浴热激转化45 sec，然后冰上放置I?2 min。
[0023](4)向上述混合液中加入37°C预热的不含抗生素的LB液体培养基800 μ L，置于37°C恒温摇床(200 r/min)上培养45 min，复苏感受态细胞。
[0024](5)室温下4，OOOXg离心10 min，移除650 μ L上清，将剩下的培养基与沉淀吹打混勻，均勻的涂布在含抗生素的LB固体培养基平板上。先正置于37°C培养箱中培养I h,待混合菌液被固体培养基吸收后倒置培养12?16 ho
[0025]脂联素基因的鉴定及测序待菌落形成后，挑选单个菌落，接种于含有抗生素LB液体培养基中，置于37°C恒温摇床(200 r/min)上培养6?8 h，待观测到培养基中形成云雾状后方可进行菌液检测。将菌液混匀，吸取菌液I μ L作为DNA模板，并进行PCR扩增，1.5%琼脂糖检测是否为目的条带。检测后将含目的条带的菌液送至上海生工生物技术有限公司测序。
[0026]实施例2:(—)山羊脂联素蛋白真核表达载体的构建 1.载体构建
(I)利用Primer Premier 5.0软件分析山羊脂联素基因⑶S区序列，找到不能酶切该基因CDS区的限制性内切酶，并根据pEGFP-Nl载体所含酶切位点信息确定限制性内切酶Hind III和BamH I。根据酶切位点序列和⑶S区序列信息设计引物扩增山羊脂联素基因CDS 区，正向引物(Fl):5’ (5，-CCAAGCTTATGCTGCTGCTGGGAGCTCT-3’)和反向引物(Rl):3’(5’ -CGGGATCCCATTCGATGTTATGGTAGAGAA-3’)。
[0027](2)根据操作说明，酶切pEGFP-Nl载体和山羊脂联素基因PCR产物。胶回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶过夜连接。
[0028](3)将载体转化到感受态细胞中。
[0029](4)挑选单个菌落，液体培养基扩大繁殖，PCR检测含目的基因条带后，将菌液送至上海生工生物技术有限公司测序。
[0030]利用含酶切位点的弓丨物进行PCR扩增山羊脂联素基因⑶S序列，胶回收PCR产物。限制性内切酶Hind III和BamH I酶切PCR产物和pEGFP-Nl真核表达载体，酶切后凝胶电泳分离后胶回收产物，然后通过T4连接酶将山羊脂联素基因⑶S区连入pEGFP-Nl载体，转入感受态细胞中扩繁后测序，得到正确的重组载体，载体长度为5420 bp，结构如图1。
[0031]实施例3:(—)脂联素基因对山羊脂肪沉积的作用
1.细胞培养和瞬时转染
(I)SMSCs以5 X 1VmL密度接种到六孔板中，生长培养基培养，置于37°C，5% CO2条件下培养。
[0032](2)待细胞增殖至贴满平皿底部80%左右时，将培养基更换为无抗生素培养基1.5mL。
[0033](3)根据转染试验说明，分别将10 μ L脂质体和4 μ g质粒室温孵育在250 μ L低血清、无抗生素培养基中5 min，然后将二者混合，室温孵育20 min，加入到以上细胞培养基中，轻轻晃动混匀培养基。
[0034](4)转染6 h后移除原培养基，利用PBS漂洗细胞3次，更换新鲜生长培养基，继续培养24?36 ho
[0035](5)利用荧光显微镜检测转染后细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达量及亚细胞定位结果表明:将SMSCs培养至铺满培养皿底80%?90%时进行瞬时转染，转染24 h后荧光显微镜检测到绿色荧光，表明重组载体成功的在SMSCs中表达。AdipoQ转染组与pEGFP-Nl空白对照组荧光比较发现，AdipoQ转染组绿色荧光只在细胞质中表达，在细胞核中未检测到。
[0036]2.AdipoQ对脂肪代谢相关基因的表达调控
收集对照组、转染组细胞各3孔，提取总RNA，检测合格后反转录合成cDNA。利用qPCR检测AdipoRl、AdipoR2和脂肪酸合成及成脂分化相关基因ACT、FAS, C/EBP a、SREBP-1和PPARy的相对表达量，同样利用2一的方法分析各个基因的相对表达量。
[0037]qPCR检测SMSCs中过表达AdipoQ基因后脂肪酸合成及成脂分化相关基因表达量有显著性变化(试验样品重复数为3)，AdipoR2、ACC、FAS和SREBP-1基因表达量显著升高，分别升高1.85、4.55、4.88和4.25倍，如图2 ;而AdipoRl、C/ΕΒΡ α和PPAR Y的表达量无明显变化，表明AdipoQ基因能上调AdipoR2、ACC、FAS和SREBP-1基因的表达，如图2。
【权利要求】
1.一种克隆山羊脂联素基因编码区序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所述。
2.山羊脂联素基因真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQID NO:1所述的山羊脂联素基因的核苷酸序列和pEGFP-Nl载体构建而成，其中利用带有保护性碱基、末端分别带有Hind III和BamH I限制性内切酶酶切位点的引物进行PCR扩增，PCR反应的正、反向引物DNA序列如下所示: 正向引物(Fl): 5- CCAAGCTTATGCTGCTGCTGGGAGCTCT -3 ； 反向引物(R1 ):5- CGGGATCCCATTCGATGTTATGGTAGAGAA -3。
3.制备如权利要求2所述的真核重组质粒的方法，按照以下步骤: (1)以山羊脂肪组织的cDNA为模板，PCR扩增山羊脂联素基因的编码区； (2)用HindIII和BamH I限制性内切酶分别对纯化后的山羊脂联素基因的编码区和pEGFP-Nl质粒进行双酶切，用连接酶T4 DNA Ligase进行酶连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂布加有Kan抗生素的平板，筛选阳性克隆。
4.依据权利3所述方法获得的山羊脂联素基因真核表达载体，在山羊脂联素蛋白亚细胞定位以及研究山羊脂肪沉积过程中作用的应用。
【文档编号】C12N15/85GK104388435SQ201410581934
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】王林杰, 张红平, 薛科, 李利, 仲涛, 王艳 申请人:四川农业大学