一种文心兰病毒检测引物及方法
【专利摘要】本发明根据建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物；并同时公开了利用该三对特异性引物同时对文心兰叶片中的建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄花叶病毒进行检测的方法。本发明建立了一种通过一次反应就能同时检测出3种文心兰病毒即建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄花叶病毒的检测方法，具有检测效率高、所需成本低的特点，且即使样本中3种文心兰病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高的检测灵敏度。
【专利说明】-种文心兰病毒检测引物及方法 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及生物学领域的一种植物病毒检测引物及方法，具体涉及一种文心兰病 毒检测引物及方法。 【【背景技术】】
[0002] 建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV)、齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，0RSV)和菜豆黄花叶病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害文 心兰的三种主要病毒。
[0003] 文心兰（Oncidium)花形优美，花期长，是目前极具竞争力和发展潜力的一种高经 济价值的花卉。但病毒病的危害严重影响其观赏和利用价值，使植株表现出花叶、坏死、畸 形、花瓣变色、花穗短小以及花期缩短等症状，使其品质严重下降，已成为制约文心兰产业 发展的主要限制因素。目前国际上还没有防治植物病毒病的有效药剂，因此，有针对性地进 行隔离检疫、销毁病株，或培育无毒种苗等，是防控病毒病的重要措施。而这些都需要对种 苗及植株进行病毒检测，建立快速有效地检测方法显得尤为重要。
[0004] 目前，文心兰病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术（即ELISA方 法），但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一 定程度的假阳性反应、检测灵敏性相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于 PCR技术的病毒检测技术正在迅速发展，但单重PCR检测技术，一个反应只能检测一种病 毒，若应用于田间多种病毒复合侵染的文心兰病毒的检测，则存在着耗时、耗力、费用高的 问题；有鉴于此，近年来，国内外研究者逐步将多重RT-PCR技术运用到植物病毒检测，与单 重PCR检测方法相比，多重PCR检测技术具有在一个mRT-PCR反应中可同时检测多种病毒， 操作更为简单，缩短了检测时间与降低了实验成本等优点。但是，目前尚未发现采用多重 PCR检测技术同时检测文心兰叶片中的CyMV、ORSV和BYMV的相关文献报道。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种文心兰病毒检测引物，并同时揭露了利 用所述检测引物检测文心兰三种相应病毒的检测方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种文心兰病毒检测引物，其 具体包括如下三个引物对：
[0007] 建兰花叶病毒引物对：正向引物5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5'-CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ；
[0008] 齿兰环斑病毒引物对：正向引物5' -CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'，反向引物 5'-GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3' ；
[0009] 菜豆黄花叶病毒引物对：正向引物5' -AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向引物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
[0010] 进一步地，所述建兰花叶病毒引物对对建兰花叶病毒PCR扩增出571bp的产物；所 述齿兰环斑病毒引物对对齿兰环斑病毒PCR扩增出325bp的产物；所述菜豆黄花叶病毒引 物对对菜豆黄花叶病毒PCR扩增出212bp的产物。
[0011] 进一步地，利用上述三个引物对对文心兰病毒进行检测，其检测方法如下：根据建 兰花叶病毒、齿兰环斑病毒及菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别 设计合成出如权利要求1中所述建兰花叶病毒引物对、齿兰环斑病毒引物对、菜豆黄花叶 病毒引物对；然后建立mRT-PCR检测体系，并利用建兰花叶病毒引物对对文心兰叶片中的 建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒引物对对文心兰叶片中的齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒引 物对对文心兰叶片中的菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR反应，最后将反应产物进行1 %琼脂 糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
[0012] 进一步地，所述mRT-PCR反应的反应体系和反应程序如下：
[0013] 反应体系：反应体系的总体积为25 μ L，含有0· 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、2. 5 μ L的 IOXTaq 酶 buffer、2 μ L2. 5mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 模板、0· 2 μ L 浓度为 10 μ mol/L 的建兰 花叶病毒正向引物、〇. 2yL浓度为lOymol/L的建兰花叶病毒反向引物、0.8yL浓度为 10 μ mol/L的齿兰环斑病毒引物正向引物、0· 8 μ L浓度为10 μ mol/L的齿兰环斑病毒反向 引物、0· 8 μ L浓度为10 μ mol/L的菜豆黄花叶病毒正向引物、0· 8 μ L浓度为10 μ mol/L的 菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸水；
[0014] 反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性30s，48-60°C退火30s，72°C延伸45s，循环 35次；72°C延伸IOmin ;4°C终止反应。
[0015] 需要说明的是，反应体系中，每对引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等。
[0016] 本发明的有益效果在于：
[0017] 针对建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的 核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物，并利用该三对特异性引物同时对文 心兰叶片中的建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR反应，建立了 一种通过一次反应就能同时检测出3种文心兰病毒即建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆 黄花叶病毒的检测方法，不仅具有检测效率高、所需成本低的特点，且即使样本中3种文心 兰病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，即本发明检测方法具有很高的检测灵敏度。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0018] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0019] 图1为本发明中实施例一的1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0020] 图2为本发明中实施例二的1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0021] 图3为本发明中实施例三的1 %琼脂糖凝胶电泳图。 【【具体实施方式】】
[0022] 本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制 本发明的范围，这些实施例仅用于说明本发明的实施方法。
[0023] 实施例一
[0024] 本发明一种文心兰病毒的检测方法，根据建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄 花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的保守核苷酸序列分别设计合成了建兰花叶病毒引物 对、齿兰环斑病毒引物对及菜豆黄花叶病毒引物对，然后建立mRT-PCR检测体系，并利用建 兰花叶病毒引物对对文心兰叶片中的建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒引物对对文心兰叶片中 的齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒引物对对文心兰叶片中的菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR 反应，最后将反应产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
[0025] 其中，各引物对具体为：（1)建兰花叶病毒引物对（如SEQ ID NO :1、2所示）：正 向引物 5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5' -CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ；（2)齿 兰环斑病毒引物对（如SEQ ID N0:3、4所示）：正向引物5'-CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'， 反向引物5'-GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3' ；（3)菜豆黄花叶病毒引物对（如 SEQ ID N0:5、6 所示）：正向弓丨物 5'-AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向弓丨物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
[0026] 另外， 申请人:为方便描述，以下可将建兰花叶病毒简称为CyMV，齿兰环斑病毒简称 为0RSV，菜豆黄花叶病毒简称为BYMV。且本发明文心兰病毒检测方法的具体操作步骤如 下：
[0027] 步骤100 :根据建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳 蛋白基因核苷酸序列，并应用Primer5. 0引物设计软件设计出三对特异性引物（即所述建 兰花叶病毒引物对、齿兰环斑病毒引物对及菜豆黄花叶病毒引物对），再用DNAman软件对 所设计的三对特异性引物进行校正，证实三对引物间不存在自身匹配和竞争性扩增，以确 保上述三种病毒能扩增出差异明显的特异性片段，且由上海生工生物工程有限公司合成上 述三对特异性引物。
[0028] 步骤200 :RNA提取：将同时被CyMV、0RSV和BYMV三种病毒复合侵染的文心兰叶片 〇. 2g、健康叶片0. 2g分别进行RNA提取，并以健康叶片为阴性对照。RNA提取采用Trizol 法：0. 2g文心兰带病毒叶片或健康叶片放入研钵中，加入液氮研磨成粉状；接着将粉状叶 片置于第一离心管中，再加入ImL Trizol并剧烈震荡20?30S，然后将第一离心管置于室 温下静置5min以使叶片充分裂解，接着将第一离心管于IOOOOrpm下离心5min，将上清液移 至第二离心管中；往第二离心管中加入200uL氯仿，并振荡混匀，于室温下放置3min，接着 在4°C、IOOOOrpm下离心15min，然后吸取上层水相至第三离心管中；往第三离心管中加入 0. 5mL异丙醇混匀，并于室温下放置lOmin，接着将第三离心管于4°C、IOOOOrpm条件下离心 lOmin，并弃去上清液，则RNA沉于管底；之后加 lmL75 %乙醇（DEPC处理水配制）于第三离 心管中并温和振荡第三离心管，得到悬浮液，再于4°C、IOOOOrpm条件下离心5min，并弃去 上清液，然后将第三离心管置于冰上晾干lOmin，最后用30uL DEPC处理水溶解RNA样品。
[0029] 步骤300 :反转录cDNA :将经步骤200处理所得的RNA反转录成cDNA，具体内容为： 将反应管置于冰上，加入 IuL Primer 01igo(dt)、luL dNTP 混合物（10mmol/L)、4uL DEPC 处理水、4uL RNA样品至反应管中，轻轻混匀再进行稍微离心，接着将反应管置于65°C水浴 中加热5min后，立即将反应管置于冰上5min，接着将反应管稍微离心后再将反应管置于冰 上，并加入4uL5 X反转录酶缓冲液、0. 5uL20U/uL的RNAase抑制剂、luL200U/uL反转录酶、 4. 5uL DEPC处理水至反应管中，然后将反应管置于42°C水浴中加热60min,再将反应管置 于70°C下热击IOmin,最后终止反应。
[0030] 步骤400 :PCR扩增：以经步骤300处理所得的cDNA为模板，并以步骤100中获得 的三对引物为引物对同时进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
[0031] 为了进行对比，本实施例同时进行了单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应，其 中，单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应的反应程序一致而反应体系不同。PCR扩增反应 的反应体系和反应程序具体内容如下：
[0032] 单重PCR反应体系：反应体系的总体积为25 μ L，包括0. 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、 2· 5μ L 的 IOXTaq 酶 buffer、2y L2. 5mmol/L 的 dNTPs、l μ L 模板、1 μ LlOymol/LCyMV 或 ORSV或BYMV的正向引物、1 μ LlOy mol/L CyMV或ORSV或BYMV的反向引物，其余成分为灭 菌双蒸水。
[0033] 多重PCR反应体系：反应体系的总体积为25 μ L，含有0. 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、 2. 5μ 10 X Taq SI buffer, 2 μ L2. 5mmol/L ^ dNTPsU μ L 2 μ L IOymol/ L的建兰花叶病毒正向引物、0. 2 μ L浓度为10 μ mol/L的建兰花叶病毒反向引物、0. 8 μ L浓 度为10 μ mol/L的齿兰环斑病毒引物正向引物、0· 8 μ L浓度为10 μ mol/L的齿兰环斑病毒 反向引物、〇· 8 μ L浓度为10 μ mol/L的菜豆黄花叶病毒正向引物、0· 8 μ L浓度为10 μ mol/ L的菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸水。
[0034] PCR反应程序：94°C预变性5min、94°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸45s，循环 35次；72°C延伸IOmin ;4°C终止反应。
[0035] 步骤500 :取5 μ L PCR产物以1 %琼脂糖凝胶（荧光染料）为电泳支持介质，在 0. 5 X TBE和130V电压下电泳35min，然后在0. 5 μ g/mL溴化乙锭染色液中染色8min，用紫 外透射仪观察，具体实验结果见图1。
[0036] 本实施例1 %琼脂糖凝胶电泳实验结果如图1所示，CyMV引物对的单重PCR扩增 反应结果如图1中的标识1所示，ORSV引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识2 所示，BYMV引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识3所示，由CyMV引物对、ORSV 引物对、BYMV引物对的三对引物参与的多重PCR扩增反应结果如图1中的标识4所示，健 康叶片的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识5所示。由图1可知，CyMV引物对的单重 PCR扩增反应得到扩增片段长度为571bp的条带，ORSV引物对的单重PCR扩增反应得到扩 增片段长度为325bp的条带，BYMV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为212bp 的条带，由CyMV引物对、ORSV引物对、BYMV引物对三对引物参与的多重PCR扩增反应，可同 时得到扩增片段长度571bp、325bp和212bp的三条明亮清晰的条带，可见，本发明可以一次 性同时检测出球根鸢尾的CyMV、0RSV、BYMV三种病毒，且特异性好、检测效率高。
[0037] 实施例二
[0038] 将实施例一步骤400中的多重PCR反应体系得到的PCR扩增产物经割胶回收，然 后分别与PMD18-T simple vector进行体外连接，再挑取阳性克隆，最后提取质粒测序，以 检查CyMV、ORSV和BYMV三种病毒的扩增结果。
[0039] 且测序结果为：CyMV、0RSV和BYMV的扩增产物分别是由571、325和212个核苷酸 组成的序列，其中所述CyMV扩增产物序列如SEQ ID NO :7所示，所述ORSV扩增产物序列如 SEQ ID NO :8所示，所述BYMV扩增产物序列如SEQ ID NO :9所示。用NCBI分析同源性结果 表明，所得的扩增产物序列SEQ ID NO :7与参考序列即CyMV的外壳蛋白基因序列的同源率 达到99%，序列SEQ ID NO :8与参考序列ORSV的外壳蛋白基因序列的同源率达到100%，序 列SEQ ID NO :9与参考序列BYMV的外壳蛋白基因序列的同源率达到100%。由此可见，所 得的扩增产物 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 和 SEQ ID NO :9 序列分别为 CyMV、ORSV 和 BYMV 的外壳蛋白基因的部分序列，从而证明了本发明检测方法结果的可靠性。
[0040] 此外，为了考察本发明球根鸢尾病毒的检测方法的灵敏度， 申请人:对实施例一 步骤200中的RNA样品进行10'10'10'10'1〇4-系列的梯度稀释，然后经过多重 mRT-PCR扩增反应，再进行1 %琼脂糖凝胶电泳实验，具体结果如图2所示。由图2可知， CyMV、0RSV和BYMV三种病毒在样品浓度稀释100倍后均仍能扩增出特异条带，由此可见本 发明具有很高的灵敏度。
[0041] 实施例三
[0042] 多重mRT-PCR同时检测CyMV、ORSV和BYMV的应用：
[0043] 步骤1 :取样地点为福建省农科院花卉研究中心种质资源圃。随机选取8个大田 中有带毒症状的文心兰叶片样品，且8个文心兰叶片样品均为0. 2g ;接着对各样品进行RNA 提取（操作同实施例一的步骤200)，并将RNA反转录成cDNA (操作同实施例一的步骤300)。
[0044] 步骤2 :以处理所得的cDNA为模板，并以本发明所述的三对引物为引物对同时进 行单重与多重mRT-PCR扩增反应，且具体步骤同实施例一的步骤400。
[0045] 步骤3 :取5μ L PCR产物以1 %琼脂糖凝胶（荧光染料）为电泳支持介质，在 0· 5 X TBE和120V电压下电泳40min，然后在0· 5 μ g/mL溴化乙锭染色液中染色lOmin，用紫 外透射仪观察，具体实验结果见图3。
[0046] 本实施例的1 %琼脂糖凝胶电泳实验如图3所示，利用本实施例mRT-PCR体系对8 个文心兰叶片样品进行检测时，样品1、6、7、8携带CyMV病毒，样品5携带CyMV、BYMV两种 病毒，样品2、3、4携带CyMV、0RSV、BYMV3种病毒，得到扩增片段长度571bp、325bp和216bp 的三条明亮清晰的条带，与单重PCR检测结果一致，可见本发明检测方法特异性好、检测效 率高。
[0047] 本发明针对CyMV、ORSV和BYMV三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，分别设 计合成了三对相应的特异性引物，并利用该三对特异性引物同时对文心兰叶片中的CyMV、 ORSV和BYMV进行mRT-PCR反应，建立了一种新的PCR反应体系和反应程序，使mRT-PCR反 应得到了大小差异明显，长度分别为571bp、325bp和212bp的三条CyMV、0RSV和BYMV的扩 增片段序列；本发明实现了一次反应就能同时检测出3种文心兰病毒即CyMV、0RSV和BYMV 的目标，因而本发明检测效率高，本发明所用试剂为分子生物学常用试剂，所需成本低，且 即使样本中3种文心兰病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高的 检测灵敏度。
【权利要求】
1. 一种文心兰病毒检测引物，其特征在于：具体包括如下三个引物对： 建兰花叶病毒引物对：正向引物5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5'-CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ； 齿兰环斑病毒引物对：正向引物5' -CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'，反向引物 5' -GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3'； 菜豆黄花叶病毒引物对：正向引物5' -AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向引物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
2. 根据权利要求1所述一文心兰病毒检测引物，其特征在于：所述建兰花叶病毒引物 对对建兰花叶病毒PCR扩增出571bp的产物；所述齿兰环斑病毒引物对对齿兰环斑病毒 PCR扩增出325bp的产物；所述菜豆黄花叶病毒引物对对菜豆黄花叶病毒PCR扩增出212bp 的产物。
3. -种文心兰病毒检测方法，其特征在于：根据建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒及菜豆 黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出如权利要求1中所述 建兰花叶病毒引物对、齿兰环斑病毒引物对、菜豆黄花叶病毒引物对；然后建立mRT-PCR检 测体系，并利用建兰花叶病毒引物对对文心兰叶片中的建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒引物 对对文心兰叶片中的齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒引物对对文心兰叶片中的菜豆黄花叶 病毒进行mRT-PCR反应，最后将反应产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
4. 根据权利要求3所述一种文心兰病毒检测方法，其特征在于：所述mRT-PCR反应的 反应体系和反应程序如下： 反应体系：反应体系的总体积为25iiL，含有0. 15iiL 5U/iiL的Taq酶、2. 5iiL的 10父了&9酶1311打61'、21112.5臟〇1/1的（1阶1^、11114莫板、0.2111浓度为1011111〇1/1的建 兰花叶病毒正向引物、〇. 2 y L浓度为10 y mol/L的建兰花叶病毒反向引物、0. 8 y L浓度为 10 ii mol/L的齿兰环斑病毒引物正向引物、0? 8 ii L浓度为10 ii mol/L的齿兰环斑病毒反向 引物、0? 8 y L浓度为10 y mol/L的菜豆黄花叶病毒正向引物、0? 8 y L浓度为10 y mol/L的 菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸水； 反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性30s，48-60°C退火30s，72°C延伸45s，循环35 次；72°C延伸10min ;4°C终止反应。
【文档编号】C12N15/11GK104372108SQ201410591218
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】黄敏玲, 樊荣辉, 钟淮钦, 叶秀仙, 罗远华, 吴建设, 林兵 申请人:福建省农业科学院作物研究所