一种水稻诱导抗病基因OsAAA1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种水稻诱导抗病基因OsAAA1，所述基因受水杨酸和稻瘟病菌的双诱导，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。上述水稻诱导抗病基因OsAAA1编码的水稻抗病蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明所提供的上述水稻诱导抗病基因OsAAA1能够应用于培育抗稻瘟病和白叶枯病的水稻品种。具体的应用方式为：根据所提供的水稻诱导抗病基因OsAAA1，构建超量表达载体；利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入受体品种；在水杨酸诱导下，该品种对稻瘟病菌和白叶枯病菌均表现出抗菌性。
【专利说明】-种水稻诱导抗病基因 OsAAAI及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种受水杨酸和稻瘟病菌的双诱导的水稻诱导抗病基因 OsAAAl，该 基因用于水稻抗稻瘟病和白叶枯病分子育种，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物、动物饲料以及生物能源之一。稻瘟病、白叶枯病和 纹枯病是水稻生产上最严重的三大病害。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，培育 和合理利用抗病品系是控制这些病害最经济有效和对环境友好的手段。但是，由主效抗病 基因介导的抗性，往往由于病原菌群体的多样性及易变性，导致抗病品系推广3-5年后抗 性丧失。而由抗病信号分子诱导的系统获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR) 介导的抗性，具有对真菌、细菌、病毒等多种病原菌广谱持久的抗性优点，受到了育种学家 广泛的重视。因此，发掘和开发具有广谱持久抗性的基因资源，对抗病育种计划具有重要的 应用价值。
[0003] AAA-ATPase 基因家族（ATPase associated with various cellular activities)在真核和原核生物中广泛存在。对人、老鼠及酵母等的AAA-ATPase研究结 果发现，该蛋白参与膜融合、细胞分裂周期调控、细胞内蛋白的运输和调控以及细胞凋亡 等一系列生理活动。由于AAA-ATPase的表达水平与消化系统恶性肿瘤的临床病理特征 之间密切相关，因此研究人类AAA-ATPase的功能及作用机理受到极大的重视，对于植物 AAA-ATPase的功能和作用机理研究相对较少，而关于水稻AAA-ATPase基因家族成员参与 抗病反应的研究鲜见报道。
[0004] AAA-ATPase基因家族蛋白具有保守的Walker A和Walker B结构域，以及特 异的同源次生区域（second region of homology, SRH) (Carter et al. 2008, Robert et al.2009)。参与蛋白降解、蛋白折叠、膜运输、细胞骨架调节和表达调控等多种生 理活动（Cho et al. 2008, McKenney et al. 2010, Meyer et al. 2012)。含纟颜酪肤蛋白 (valosin-containing protein，VCP)是第一个被鉴定的AAA蛋白，是一种广泛存在的膜结 合糖蛋白，主要作为类似分子伴侣的作用在内质网相关的蛋白降解及细胞周期调控中起重 要作用（Wojtasz et al. 2009, Stapf et al. 2011，Charisse and Jonathan 2012, Cao et al. 2012)。哺乳类动物的p97/VCP和酵母p97/Cdc48是研究最广泛的AAA-ATPase基因家 族成员，在其他生物中该基因也具有高度的保守性。P97/VCP是分子伴侣AAA-ATPase基因 家族成员之一，在胞内行使与内质网膜相关联的降解、膜融合、转录因子激活等重要功能， 而这些功能的行使都与泛素化修饰有关（Franz et al. 2011，Park et al. 2008, KocabAk et al. 2010, Kim et al. 2011, Meyer et al. 2012) 〇
[0005] 相对动物AAA-ATPase基因家族的研究，有关植物AAA-ATPase基因功能研究相对 较少，主要集中在模式植物拟南芥。研究表明拟南芥AAA-ATPase家族成员RPT2a为26S蛋 白酶体的一个亚基，该基因功能丧失，降低26S蛋白酶体的活性，从而导致拟南芥的茎细胞 增大和细胞数量减少（Kurepa et al. 2009)。Lee et al. (2011)发现在拟南芥rpt2a和 rpt2b双突变体中雌雄配子的传输受阻，表明26S蛋白酶体亚基RPT2对配子体和孢子体 的发育是必需的。Chung et al. (2011)以拟南芥CC-NBS-LRR抗性（resistance, R)蛋白 Uni-ID的CC和CC-NBS结构域分别作为诱饵，通过酵母双杂交鉴定到一个26S蛋白酶体 AAA-ATPase基因家族成员RPT2a直接参与Uni-ID诱导的防卫信号途径。Jin et al. (2010) 在拟南芥中超量表达AREBl，转基因植物的抗旱性增强，导致分子伴侣AAA-ATPase基因 AlAl表达上调。说明AAA-ATPase基因参与了 ABA信号途径。Chandran et al. (2009)发现 拟南芥分子伴侣AAA-ATPase基因⑶C48的一个互作蛋白PUX2受白粉病菌诱导差异表达， 进一步研究发现pux2突变体对白粉病菌表现明显的抗性。Sugimoto et al. (2004)利用 差异显示的方法，在烟草N基因介导的抗病反应早期鉴定到一个AAA-ATPase基因 NtAAAl， 该基因负调控抗病反应，受茉莉酸和乙烯诱导，是SA信号途径的负调控因子。Sano et al. (2007)进一步以NtAAAl作为诱饵，通过酵母双杂交筛选到一个编码GTPase的互作蛋白 NtARF。组成型超量表达NtARF，转基因烟草表现自发的模拟病斑，并增强对TMV的抗性。 [0006] 然而，在单子叶模式植物水稻中，AAA-ATPase基因的研究非常有限。Han et al. (2008)以根形态相关蛋白OsRAAl为诱饵，通过酵母双杂交筛选到一个互作蛋白26S蛋 白酶体亚基0sRPT4 (AAA-ATPase基因家族成员），0sRPT4与OsRAAl的C末端互作，进一步 证明了 AAA-ATPase基因参与由OsRAAl介导的根发育。
[0007] 上述研究表明，AAA-ATPase作为一个互作蛋白参与各种生理活动。但是，有关 AAA-ATPase基因参与水稻抗病反应的研究鲜见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种受水杨酸和稻瘟病菌的双诱导的水稻诱导抗病基因 OsAAAl，该 基因解决了【背景技术】中的不足，该基因能够用于培育抗稻瘟病和白叶枯病的水稻品系。
[0009] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
[0010] 一种水稻诱导抗病基因 OsAAAl，所述基因受水杨酸和稻瘟病菌的双诱导，该基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 一种由上述水稻诱导抗病基因 OsAAAl编码的水稻抗病蛋白，该蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] -种包含有上述水稻诱导抗病基因 OsAAAl的超量表达载体。
[0013] 本发明所提供的上述水稻诱导抗病基因 OsAAAl在培育抗稻瘟病和白叶枯病的水 稻品系中的应用。
[0014] 具体的应用方式如下：
[0015] (1)、根据所提供的水稻诱导抗病基因 OsAAAl，构建超量表达载体；
[0016] (2)、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入受体品系；
[0017] (3)、该品系对稻瘟病菌和白叶枯病菌均表现出抗病性。
[0018] 本申请在前期的研究中，通过基因芯片发现水稻6个AAA-ATPase基因家族成员 (OsAAA-ATPase 1-6)在稻瘟病抗病反应中的表达存在差异。进一步分别通过植物激素 ABA，ACC，BTH(SA功能类似物），CK，IAA，JA和GA，以及稻瘟病菌诱导表达分析，发现其中一 个成员OsAAAl，明显仅受BTH和稻瘟病菌上调表达，而在SA缺失突变体（转NahG水稻）中 OsAAA-ATPase-I却不再受稻瘟病菌诱导，说明OsAAAl正调控SA信号途径。此外，本申请的 研究表明，超表达OsAAAl后增强了水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性，表明该基因正调控抗 病反应。这一结果与已报道的烟草NtAAAl基因功能截然不同（Sugimoto et al. 2004, Sano et al. 2007)。本申请通过克隆得到了 OsAAAl基因（全长1850 bp，完整ORF为1563 bp， 编码520个氨基酸），序列分析表明，该基因与已报道的AAA-ATPase基因家族成员的同源物 很低，是一个新成员。
[0019] 在前期研究的基础上，本申请对OsAAA-ATPase-I进行植物激素和稻瘟病菌的诱 导表达分析，发现该基因受水杨酸（salicylic acid, SA)和稻癌病菌双诱导。超量表达该 基因后，明显增强对稻瘟病和白叶枯病的抗性。由此说明OsAAA-ATPase-I对抗病育种具有 重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是OsAAA-ATPase-I基因受稻瘟病菌诱导上调表达示意图；
[0021] 图2是OsAAA-ATPase-I基因依赖SA诱导上调表达示意图；
[0022] 图3为所培育的抗病品系对稻瘟病和白叶枯病表现抗病性的示意图；
[0023] 图4为所培育的抗病品系对稻瘟病的抗病性的示意图
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图及具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围 并不局限于以下实施例。
[0025] 本发明实施例中所用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规 技术；所用的仪器设备、试剂等，除非特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公 共途径获得。
[0026] 本发明实施例提供一种水稻诱导抗病基因 OsAAAl，所述基因受水杨酸和稻瘟病菌 的双诱导，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。上述水稻诱导抗病基因 OsAAAl编码 的水稻抗病蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0027] 实施例I OsAAA-ATPase-I基因受稻瘟病菌诱导上调表达
[0028] 在水稻品系日本晴幼苗4-5叶期，利用对日本晴亲和（Compatible)和不亲和 (Incompatible)的稻癌病菌株race007和racel02接种，同时设置Mock对照，分别采集接 种前和接种后2、3、4、5和6 d不同时间点的幼叶，利用qRT-PCR技术分析OsAAAl的表达变 化情况。结果见图1，由图1可以看出该基因受稻瘟病菌强烈诱导上调表达。
[0029] 实施例2 OsAAAl基因依赖SA诱导上调表达
[0030] 在日本晴幼苗3-4叶期，分别用植物激素 ABA、ACC、BTH (SA的功能类似物）、 CK、IAA、JA和GA分别按一定浓度处理根系，并设Mock对照，处理24 h后采集叶片，利用 qRT-PCR分析OsAAA-ATPase-I的响应情况。结果见图2,结果表明该基因受水杨酸诱导。为 了进一步证明该基因对SA的响应，利用稳定遗传的水杨酸分解酶NahG转基因株系NahG#3 和NahG#6,接种稻瘟病菌株race007,同时设置Mock对照，分别采集接种前和接种后2和4 d不同时间点的幼叶进行表达分析，结果见图2表明，在SA缺陷植株中，接种稻瘟病菌后该 基因不表达，进一步说明该基因的表达依赖于SA的诱导。
[0031] 实施例3 OsAAAl基因超量表达，对稻瘟病和白叶枯病均表现明显的抗性
[0032] 构建OsAAAl全长基因超量表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化转入日本晴受 体品系，对TO和Tl代进行了表达分析，对表达上调的株系接种亲和的稻瘟病菌和白叶枯病 菌，均表现明显的抗病反应，结果如图3和图4所示。
【权利要求】
1. 一种水稻诱导抗病基因OsAAAl，其特征在于：所述基因受水杨酸和稻瘟病菌的双诱 导，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -种由权利要求1所述的水稻诱导基因OsAAAl编码的水稻蛋白，其特征在于：该蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. -种包含有权利要求1所述水稻诱导抗病基因OsAAAl的超量表达载体。
4. 权利要求1所述的水稻诱导抗病基因OsAAAl在培育抗稻瘟病和白叶枯病的水稻品 种中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于包括以下步骤： (1) 、根据权利要求1所提供的水稻诱导抗病基因OsAAAl，构建超量表达载体； (2) 、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入受体品种； (3) 、该品种对稻瘟病菌和白叶枯病菌均表现出抗菌性。
【文档编号】C12N15/82GK104388436SQ201410591365
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】刘新琼, 姜昌杰, 王春台, 程钢, 刘学群 申请人:中南民族大学