一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医药生物【技术领域】，尤其是一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用技术。本发明设计的试剂盒包括以下两种组成：PCR 反应缓冲液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液；或PCR 反应缓冲液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基因反应液。本发明的试剂盒采用多重荧光定量PCR 技术，能在同一PCR 反应管中同时检测多个靶标基因，为同时检测病原体及其耐药性基因提供有力技术支撑。其方法具有对样本需要量少、成本低、操作简便、灵敏度高，特异性好的特点，具有极大的社会和经济意义。
【专利说明】-种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及医药生物【技术领域】，尤其是一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒 及其应用，具体涉及一种沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体和耐药性基因的试剂盒及 其应用。
【背景技术】
[0003] 性传播疾病（STD)是一组全球性传染病，主要通过性接触传播，部分STD则可通 过非性接触传播，比如通过共用针头、哺乳甚至接触传播。
[0004] 目前STD在我国的发病率呈不断上升的趋势，其中由沙眼衣原体（化lamydia trachomatis, CT)、人型支原体（M. humenis, MH )和解脈支原体（Ureaplasma ureal^icum，UU) H种病原体引起的泌尿生殖道感染，已成为医院妇科、皮肤性病科、泌尿 生殖科的常见疾病，为我国重点防治的对象。
[0005] 沙眼衣原体（CT)是一类在细胞内寄生的微生物，革兰氏阴性。目前发现它有15 个血清型，不同的血清型能引起不同的疾病。沙眼衣原体可W引起沙眼、包涵体包膜炎、泌 尿生殖道感染、性病淋己肉芽肿等疾病。非淋菌性尿道炎（NGU)的40%?50%是由沙眼衣 原体感染引起的；为全国监测病种。
[0006] 解脈支原体（UU)是脈原体属中的一种，是人类泌尿生殖道常见的寄生菌之一，是 非淋球菌性尿道炎（NGU)的常见病原体之一。解脈支原体多寄生在男性尿道、阴茎包皮和 女性阴道。若上行感染，可引起男性前列腺炎或附睾炎、女性阴道炎、宫颈炎，并可感染胎儿 导致流产、早产及低体重胎儿，也能引起新生儿呼吸道和中枢神经系统的感染。
[0007] 人型支原体（MH)是支原体的一种，寄居于人的泌尿生殖道，是引起泌尿生殖道感 染，尤其是女性泌尿生殖道感染的常见病原之一，可引起女性盆腔炎、肾孟肾炎、阴道炎等 疾病。
[0008] 近年来由于支原体衣原体引起的生殖道感染等疾病逐年增加，加上不规范治疗和 盲目用药，耐药菌株不断增加，对各种抗菌药物的敏感性均显著降低，疗效也逐渐下降，抗 生素的耐药性问题日益突出。耐药菌的快速准确的检测，在合理使用抗生素及减少耐药性 发生和传播等方面有重要意义。其中四环素类耐药尤为严重。
[0009] 培养法 目前，临床上人型支原体（MH)、解脈支原体扣U)及沙眼衣原体（CT)及耐药性检测方法 主要是病原体的分离培养。但培养法检测耗时长，一般需经48-72小时才能得到结果；灵 敏度低，受采集、运送、保存等影响较大，容易出现假阴性结果；操作烦琐，导致各种操作的 结果判别标准难W统一，需要的技术和设备要求高。免疫学方法相比培养法有了长足的进 步，但是因为生殖道微生物之间存在的交叉反应使得该方法的特异性受到影响，容易出现 假阳性反应，给治疗带来误判的可能。病原体的多重实时英光定量PCR检测可W快速准确 的确定病原体种类及耐药性基因，可在临床上作为早期快速诊断的方法，给病原体的用药 选择及用药后监控，提供有力的技术支撑。目前临床上还没有相关同时检测病原体与耐药 性基因的产品。
[0010] 英光定量PCR检测技术融汇了 PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确 定量的优点，是目前临床检验中认同程度很高的一种检测技术，已广泛应用于科学研究和 临床检测。但多重英光定量PCR由于其技术难度在临床上的应用才刚刚开始。目前已上市 产品中绝大多数为单通道检测，只能进行单重PCR反应，一个PCR反应管一次反应只能检测 一种基因或病原体，不能特异地对多个祀标基因或病原体进行检测，且临床上没有相关方 法的支原体耐药性检测试剂。
【发明内容】
[0011] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂 盒及其应用。
[0012] 一、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；一种病原体核酸及耐药性基因 检测试剂盒，该试剂盒包括W下各组组分： PCR反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应 液； 所述的沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液包括W下组 分： 组分（1);由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两 条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 3所示，该探针的5'端标记有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团； 组分（2);由一对检测解脈支原体的引物和一条检测解脈支原体的探针组成；其中，两 条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探针的碱基序列为SEQID No. 6所示，该探针的5'端标记有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团； 组分（3);由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两 条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示；探针的碱基序列为SEQID No. 9所示，该探针的5'端标记有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团； 组分（4);由一对检测解脈支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脈 支原体四环素类药物的耐药性基因的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 12所示，该探针的5'端标记 有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团。
[0013] 二、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述试剂盒包括W下组分： PCR反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基 因反应液； 所述沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体多重反应液包含W下组分： 组分（1);由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两 条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 3所示，该探针的5'端标记有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团； 组分（2);由一对检测解脈支原体的引物和一条检测解脈支原体的探针组成；其中，两 条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探针的碱基序列为SEQID No. 6所示，该探针的5'端标记有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团； 组分（3);由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两 条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示；探针的碱基序列为SEQID No. 9所示，该探针的5'端标记有英光报告基团，3'端标记有英光浑灭基团； 所述耐药性基因反应液包含W下组分： 组分；由一对检测解脈支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脈支原 体四环素类药物的耐药性基因探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 10 和SEQ ID No. 11所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 12所示，该探针的5'端标记有英光 报告基团，3'端标记有英光浑灭基团。
[0014] H、根据本发明的另一个实施例，进一步包括该试剂盒还包括有组分；阳性对照一 和阴性对照。
[0015] 四、根据本发明的另一个实施例，进一步包括该试剂盒还包括有组分；阳性对照二 和阴性对照。
[0016] 五、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的英光报告基团选自FAM、VIC、 肥X、R0X、CY3或CY5英光报告基团，且沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体/耐药性基 因多重反应液中组分（1)、组分（2)、组分（3)和组分（4)中的英光报告基团各不相同。
[0017] 六、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的英光报告基团选自FAM、VIC、 肥X、R0X、CY3或CY5英光报告基团，且沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体多重反应液 中组分（1)、组分（2)和组分（3)的英光报告基团各不相同。
[0018] 走、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的英光浑灭基团选自皿Q1、 B册2、B册3、D油巧1和Tamra任意四种英光浑灭基团。
[0019] 八、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的PCR反应液包括10X缓冲液、 25mM MgC12、10mM dUTP 和 lOmM dNTPs。
[0020] 九、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的酶混合液包括化q酶和UNG 酶，所述的化q酶为热启动化q酶，所述的UNG酶为尿嚼巧-N-糖基化酶。
[0021] 十、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的阳性对照一包括W下组分： 组分（1);为含有部分沙眼衣原体（CT)的质粒pSoto址8基因片段，大小为16化P，此 基因片段核巧酸序列为SEQ ID No. 13 ; 组分（2);为含有部分解脈支原体扣U)16S核糖体RNA基因片段，大小为164bp，此基 因片段核巧酸序列为SEQ ID No. 14 ; 组分（3);为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为16化p，此基因片段核巧酸序列 为沈Q ID No. 15 ; 组分（4);为含有部分解脈支原体扣U)四环素耐药化916基因片段，大小为40化p，此 基因片段核巧酸序列为SEQ ID No. 16 十一、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的阳性对照二包括两种组合： 组合1包含W下组分： 组分（1);为含有部分沙眼衣原体（CT)的质粒pSoto址8基因片段，大小为16化P，此 基因片段核巧酸序列为SEQ ID No. 13 ; 组分（2);为含有部分解脈支原体扣U)16S核糖体RNA基因片段，大小为164bp，此基 因片段核巧酸序列为SEQ ID No. 14 ; 组分（3);为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为16化p，此基因片段核巧酸序列 为沈Q ID No. 15 ; 组合2包含W下组分： 为含有部分解脈支原体扣U)四环素耐药化916基因片段，大小为40化P，此基因片段核 巧酸序列为SEQ ID No. 16。
[0022] 十二、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的阴性对照为无菌水。
[0023] 十H、本发明还进一步包括该试剂盒在非淋球菌性尿道炎、W及不孕不育常见病 原体检测中的应用。
[0024] 本发明的有益效果是： (1)本发明的试剂盒能够同时检测出沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体和耐药性 基因，填补了现有英光定量PCR产品只能检测性病病原体不能检测耐药基因的空白。
[00巧](2)本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观、且可节约 成本等优点，在沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体和耐药性基因体外诊断领域具有极 大的应用前景。
[002引（2)本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR英光检测时间（从标本处理开始） 仅为2-3小时，PCR英光检测是全封闭操作，加入待测样本核酸提取物之后可W不再打开 管盖，减少了污染产生的机会。反应液中加入了 UNG酶，防止了扩增产物的污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0028] 图1是本发明试剂盒参考品检测的曲线图。
[0029] 图2是本发明试剂盒检测人型支原体（MH)灵敏度试验结果图。
[0030] 图3是本发明试剂盒检测解脈支原体（UU)的灵敏度试验结果图。
[0031] 图4是本发明试剂盒检测沙眼衣原体（CT)的灵敏度试验结果图。
[0032] 图5是本发明试剂盒检测四环素类类药物灵敏度试验结果图。
[0033] 图6是本发明试剂盒检测人型支原体（MH)的特异性试验结果图。
[0034] 图7是本发明试剂盒检测解脈支原体（UU)的特异性试验结果图。
[00巧]图8是本发明试剂盒检测沙眼衣原体（CT)的特异性试验结果图。
[0036] 图9是本发明试剂盒检测四环素类类药物的特异性试验结果图。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图1?9及实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0038] 实施例一 试剂盒包括W下组分： PCR反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应 液、阳性对照一、阴性对照； PCR 反应液包括 lOX 缓冲液、25mM MgC12、10mM 加TP 和 lOmM dNTPs ; 酶混合液包括化q酶和UNG酶，所述的化q酶为热启动化q酶，所述的UNG酶为尿嚼 巧-N-糖基化酶。
[0039] 沙眼衣原体/解脈支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液上游下游引物、 及探针的配比为；6:4:2 ;优选的上游引物为600nM，下游引物为400nM，探针为200nM。
[0040] 本实施例中使用的人型支原体、解脈支原体、沙眼衣原体及解脈支原体四环素耐 药基因的引物和探针的核巧酸序列可参见表1。
[0041] 表1本发明中人型支原体、解脈支原体、沙眼衣原体及解脈支原体四环素耐药基 因的引物和探针的核巧酸序列表
【权利要求】
1. 一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒包括以下各组组 分： PCR反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应 液； 所述的沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液包括以下组 分： 组分（1):由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两 条引物的喊基序列分别为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所不；探针的喊基序列为SEQID No. 3所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团； 组分（2):由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两 条引物的喊基序列分别为SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所不；探针的喊基序列为SEQID No. 6所示，该探针的5'端标记有突光报告基团，3'端标记有突光淬灭基团； 组分（3):由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两 条引物的喊基序列分别为SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8所不；探针的喊基序列为SEQID No. 9所不，该探针的5'端标记有突光报告基团，3'端标记有突光洋灭基团； 组分（4):由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲 支原体四环素类药物的耐药性基因的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQID No. 10和SEQIDNo. 11所示；探针的碱基序列为SEQIDNo. 12所示，该探针的5'端标记 有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
2. 根据权利要求1所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述 试剂盒包括以下组分： PCR反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基 因反应液； 所述沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液包含以下组分： 组分（1):由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两 条引物的喊基序列分别为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所不；探针的喊基序列为SEQID No. 3所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团； 组分（2):由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两 条引物的喊基序列分别为SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所不；探针的喊基序列为SEQID No. 6所示，该探针的5'端标记有突光报告基团，3'端标记有突光淬灭基团； 组分（3):由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两 条引物的喊基序列分别为SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8所不；探针的喊基序列为SEQID No. 9所不，该探针的5'端标记有突光报告基团，3'端标记有突光洋灭基团； 所述耐药性基因反应液包含以下组分： 组分：由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲支原 体四环素类药物的耐药性基因探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo. 10 和SEQIDNo. 11所示；探针的碱基序列为SEQIDNo. 12所示，该探针的5'端标记有突光 报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
3. 根据权利要求1 一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒还 包括有组分：阳性对照一和阴性对照。
4. 根据权利要求2 -种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒还 包括有组分：阳性对照二和阴性对照。
5. 根据权利要求1所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述 的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团，且沙眼衣原体/解脲 支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液中组分（1)、组分（2)、组分（3)和组分（4)中 的突光报告基团各不相同。
6. 根据权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述 的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团，且沙眼衣原体/解脲 支原体/人型支原体多重反应液中组分（1)、组分（2)和组分（3)的荧光报告基团各不相同。
7. 根据权利要求1或权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其 特征是，所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl和Tamra任意四种荧光淬灭 基团。
8. 根据权利要求1或权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其 特征是，所述的PCR反应液包括10X缓冲液、25mMMgC12、10mMdUTP和10mMdNTPs。
9. 根据权利要求1或权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其 特征是，所述的酶混合液包括Taq酶和UNG酶，所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述的UNG 酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
10. 根据权利要求3所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述 的阳性对照一包括以下组分： 组分（1):为含有部分沙眼衣原体（CT)的质粒pSotonE8基因片段，大小为166bp，此 基因片段核苷酸序列为SEQIDNo. 13 (具体序列见表2,以下涉及阳性对照核苷酸序列均 见表2); 组分（2):为含有部分解脲支原体（UU)16S核糖体RNA基因片段，大小为164bp，此基 因片段核苷酸序列为SEQIDNo. 14 ; 组分（3):为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列 为SEQIDNo. 15 ; 组分（4):为含有部分解脲支原体（UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此 基因片段核苷酸序列为SEQIDNo. 16。
11. 根据权利要求4所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述 的阳性对照二包括两种组合： 组合1包含以下组分： 组分（1):为含有部分沙眼衣原体（CT)的质粒pSotonE8基因片段，大小为166bp，此 基因片段核苷酸序列为SEQIDNo. 13 ; 组分（2):为含有部分解脲支原体（UU)16S核糖体RNA基因片段，大小为164bp，此基 因片段核苷酸序列为SEQIDNo. 14 ; 组分（3):为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列 为SEQIDNo. 15 ; 组合2包含以下组分： 为含有部分解脲支原体（UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核 苷酸序列为SEQIDNo. 16。
12. 根据权利要求1或权利要求2的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征 是，所述的阴性对照为无菌水。
13. 根据权利要求1~12所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒在非淋球菌 性尿道炎、以及不孕不育常见病原体检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104513854SQ201410591197
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】孔祥宾, 夏国庆, 丁燕芬, 朱啸悦 申请人:常州百代生物科技有限公司