一种噬菌蛭弧菌微生态制剂的生产方法
【专利摘要】本发明属于养殖【技术领域】，本发明公开了一种噬菌蛭弧菌微生态制剂的生产方法，包括如下步骤：1)宿主菌悬液的制备；2)缓释颗粒的制备；3)培养液的制备；4)种子的制备；5)蛭弧菌制剂的制备。本发明采用宿主菌的缓释技术，克服了目前噬菌蛭弧菌制剂保质期短、菌含量不稳定的缺陷，提高了噬菌蛭弧菌制剂对水产动物病害防治与水质改良的效果。
【专利说明】-种趟菌蜡弧菌微生态制剂的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于养殖【技术领域】，具体涉及一种瞻菌幢弧菌微生态制剂的生产方法。
【背景技术】
[0002] 瞻菌幢弧菌是一类专口 W捕食细菌为生的寄生性细菌，能够在较短的时间内裂解 水体中的弧菌、假单胞菌、气单胞菌等，可将致病菌数量限制在较低水平，同时又可W有效 地控制养殖水体的COD、硫化物和氨氮的含量，并且可W提高养殖体肠道吸收和免疫水平。 幢弧菌活菌制剂不仅可W作为一种饲料添加剂来使用，而且可W作为一种水质改良剂直接 泼洒养殖水体来使用。因此，利用它作为养殖水环境中的天然生物净化因子和"活性抗生 素"，具有广阔的发展前景，对开拓水产动物病害生物防治新途径具有重要的意义。
[0003] 目前，一些厂家生产的幢弧菌制剂保存时间较短。有研究显示幢弧菌保藏的效价 很不稳定，室温保藏36天后，幢弧菌的浓度由原来的IO 8P化/mL降低到IOp化/mL。此外，由 于幢弧菌其有强烈的内源性呼吸作用，在低温下容易死亡，因而对幢弧菌的保藏显得比较 困难。加强幢弧菌长效稳定保藏方法的研究，对实现幢弧菌在水产动物生物防病应用上的 推广具有重要的理论意义。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的是提供一种瞻菌幢弧菌微生态制剂及其生产方法，采用宿主菌的缓 释技术，解决了瞻菌幢弧菌在工业化生产过程中保质期短、裂解活性降低等问题，提高了瞻 菌幢弧菌制剂对水产动物病害防治与水质改良的效果。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案包括W下步骤：
[0006] 1.巧王困息液的制备
[0007] 将培养好的大肠杆菌经高压灭菌后用管式高速离也机离也并收集菌体，用磯酸盐 缓冲液稀释至浓度为1〇11?l〇"c化/mL的宿主菌息液，置于4C下保存备用。
[0008] 2.缓释颗粒的制备
[0009] 将宿主菌息液加水稀释0. 5?5倍，然后加入1 %?15 %的凝胶剂，充分混合溶 解，滴入交联剂中，交联20min?12h，清洗备用。
[0010] 3.培养液的制备
[0011] 将抑6. 0?8. 5的磯酸盐缓冲液用水稀释10?200倍，然后加入10?lOOmg/L 的 CaCl2, W及 10 ?lOOmg/L 的 MgCla。
[0012] 4.种子的制备
[0013] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤1制备的宿主菌息液2%?20%，再接入幢弧菌，在 18 ?35°C、180巧111 培养 18 ?60h。
[0014] 5.幢弧菌制剂的制备
[0015] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤2制备的宿主颗粒5?20粒，再接入步骤4制备的幢 弧菌种子1%。?10%。，即制成IO 7?IO9P化/mL的幢弧菌制剂。
[0016] 步骤I所述宿主菌是采用115°C高压灭菌30min，然后用管式高速离也机1000化pm 离也，用磯酸盐缓冲液稀释成浓度为1〇11?10"C化/血的宿主菌息液；
[0017] 步骤2所述缓释颗粒的制备是将宿主菌息液加水稀释0. 5?5倍，然后加入1 %? 15%的凝胶剂，充分混合溶解，滴入交联剂中，交联20min?12h，清洗备用。
[0018] 步骤2所述缓释颗粒的制备所使用的凝胶剂可W是5%?15%聚己帰醇，采用冻 融法进行颗粒的固化；步骤2所述缓释颗粒的制备所使用的凝胶剂也可W是1%?6%海 藻酸盐，交联剂是1 %?8%化Cl,;步骤2所述缓释颗粒的制备所使用的凝胶剂还可W是 2%?10%明胶与1 %?6%海藻酸盐混合液，交联剂是1 %?8%化Cls。
[0019] 步骤3所述所有的磯酸盐缓冲溶液抑为6. 0?8. 5,稀释倍数为10?200倍，化Cl 浓度为0?30%。，CaCla浓度为10?lOOmg/L，MgCla浓度为10?lOOmg/L。
[0020] 步骤4所述幢弧菌种子是在磯酸盐缓冲液中加入宿主菌息液2%?20%，再接入 幢弧菌，在18?35°C、180巧m培养18?60h。
[0021] 步骤5所述幢弧菌制剂的制备是在磯酸盐缓冲液中加入步骤2制备的宿主颗粒 5?20粒，再接入步骤4制备的幢弧菌种子1 %。?10%。，即制成IO7?IO9P化/mL的幢弧菌 制剂。
[0022] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0023] (1)本发明所述的生产方法中采用的宿主菌是经过灭活后的对环境无害的革兰氏 阴性细菌。
[0024] (2)本发明采用宿主菌缓释技术，不仅大大延长了幢弧菌的保质期，提高了产品的 活性，增强了其使用效果，同时还减少了宿主菌的用量，降低了生产成本。该方法生产的液 体幢弧菌制剂，经H个月室温储存后幢弧菌活菌数仍能达LOXlO 6P化/mL W上。
[0025] (3)本发明生产的幢弧菌缓释颗粒在保证其有效成分缓慢释放的同时能保持颗粒 的长期稳定而不被溶解。
【具体实施方式】 [0026] ：下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明的实施方 式不限于此。
[0027] 实施例1 ;用聚己帰醇对宿主菌进行固定，具体过程如下：
[0028] (1)宿主菌息液的制备
[0029] 将培养好的大肠杆菌经115°C高压灭菌30min，然后用管式高速离也机IOO(K)^m 离也，并收集菌体，用磯酸盐缓冲液稀释至浓度为IQi 2C化/血的宿主菌息液，置于4C下保 存备用；
[0030] (2)缓释颗粒的制备
[0031] 将宿主菌息液加水稀释2倍，然后加入10%的聚己帰醇，充分混合溶解，加入1倍 体积的植物油充分揽拌，形成球状体，在-2(TC定型固化她，清洗备用。
[00础 做培养液的制备
[003引将抑7. 4的磯酸盐缓冲液用水稀释100倍，然后加入40mg/L的化化和40mg/L的 MgCla。
[0034] (4)种子的制备
[00巧]在磯酸盐缓冲液中加入步骤（1)制备的宿主菌息液10%，再接入幢弧菌，在28? 301：、180巧111培养2她。
[0036] (5)幢弧菌制剂的制备
[0037] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤（2)制备的宿主颗粒20粒，再接入步骤（4)制备的幢 弧菌种子10%。，即制成IO 8P化/mL的幢弧菌制剂。
[0038] 实施例2 ;用海藻酸轴对宿主菌进行固定，具体过程如下：
[0039] (1)宿主菌息液的制备
[0040] 将培养好的大肠杆菌经115°C高压灭菌30min，然后用管式高速离也机1000化pm 离也，并收集菌体，用磯酸盐缓冲液稀释至浓度为IQi 2C化/血的宿主菌息液，置于4°C下保 存备用；
[0041] (2)缓释颗粒的制备
[0042] 将宿主菌息液加水稀释1倍，加入2%的海藻酸轴，充分混合溶解，然后滴入3% 的化(?中，交联30min，清洗备用。
[004引 做培养液的制备
[0044] 将抑7. 2的磯酸盐缓冲液用水稀释20倍，然后加入20mg/L的化化和20mg/L的 MgCla。
[0045] (4)种子的制备
[0046] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤（1)制备的宿主菌息液5%，再接入幢弧菌，在28? 30°C、180巧m 培养 32h。
[0047] (5)幢弧菌制剂的制备
[0048] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤（2)制备的宿主颗粒15粒，再接入步骤（4)制备的幢 弧困种子1%。，即制成10 7p化/mL的幢弧困制剂。
[0049] 实施例3 ;用明胶及海藻酸轴对宿主菌进行固定，具体过程如下：
[0050] (1)宿主菌息液的制备
[0051] 将培养好的大肠杆菌经115°C高压灭菌30min，然后用管式高速离也机1000化pm 离也，并收集菌体，用磯酸盐缓冲液稀释至浓度为IQi 2C化/血的宿主菌息液，置于4°C下保 存备用；
[0052] (2)缓释颗粒的制备
[0053] 将宿主菌息液加水稀释1倍，并加入7%的明胶和3%的海藻酸轴，充分混合溶解， 然后滴入4%的化Cl2中，交联60min，清洗备用。
[0054] 做培养液的制备
[00对将抑7. 2的磯酸盐缓冲液用水稀释10倍，然后加入60mg/L的化化和60mg/L的 MgClao
[005引 （4)种子的制备
[0057] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤（1)制备的宿主菌息液15%，再接入幢弧菌，在28? 301：、180巧111培养2她。
[005引 （5)幢弧菌制剂的制备
[0059] 在磯酸盐缓冲液中加入步骤（2)制备的宿主颗粒8粒，再接入步骤（4)制备的幢 弧菌种子10%。，即制成IO 8P化/mL的幢弧菌制剂。
[0060] 上述实施例1?3幢弧菌制剂制备完成后，分装于IL的无菌瓶中密封；购买市售 产品，作为"市售产品对照1用不加缓释颗粒的试验组作为"阳性对照1" ;H组样品同时 室温保存（市售产品W其生产日期为起点计算其保存周期），定时采用自来水琼脂双层平 板法检测活菌数，检测结果见表1;
[0061] 表1幢弧菌稳定性检测结果（P化/血）
[0062]
【权利要求】
1. 一种噬菌蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 宿主菌悬液的制备 将培养好的大肠杆菌经高压灭菌后用管式高速离心机离心并收集菌体，用磷酸盐缓冲 液稀释至浓度为1011?1013cfu/mL的宿主菌悬液，置于4°C下保存备用。 (2) 缓释颗粒的制备 将宿主菌悬液加水稀释0. 5?5倍，然后加入1 %?15%的凝胶剂，充分混合溶解，滴 入交联剂中，交联20min?12h，清洗备用。 (3) 培养液的制备 将pH6. 0?8. 5的磷酸盐缓冲液用水稀释10?200倍，然后加入10?100mg/L的 CaCl2，以及 10 ?100mg/L 的 MgCl2。 (4) 种子的制备 在磷酸盐缓冲液中加入步骤（1)制备的宿主菌悬液2%?20%，再接入蛭弧菌，在 18 ?35°C、180rpm 培养 18 ?60h。 (5) 蛭弧菌制剂的制备 在磷酸盐缓冲液中加入步骤（2)制备的宿主颗粒5?20粒，再接入步骤（4)制备的蛭 弧菌种子1%。?10%。，即制成107?109pfu/mL的蛭弧菌制剂。
2. 根据权利要求1所述的一种蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于：步骤（1) 所述培养好的大肠杆菌经115°C高压灭菌30min，然后用管式高速离心机lOOOOrpm离心，用 磷酸盐缓冲液稀释成浓度为1011?1013cfu/mL的宿主菌悬液。
3. 根据权利要求1所述的一种蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于：步骤（2) 所述缓释颗粒的制备是将宿主菌悬液加水稀释〇. 5?5倍，然后加入1%?15%的凝胶剂， 充分混合溶解，滴入交联剂中，交联20min?12h，清洗备用。
4. 根据权利要求1所述的一种蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于：步骤（2) 所述缓释颗粒的制备所使用的凝胶剂可以是5%?15%聚乙烯醇，采用冻融法进行颗粒的 固化；步骤（2)所述缓释颗粒的制备所使用的凝胶剂也可以是1%?6%海藻酸盐，交联剂 是1%?8% CaCl2 ;步骤（2)所述缓释颗粒的制备所使用的凝胶剂还可以是2%?10%明 胶与1 %?6 %海藻酸盐混合液，交联剂是1 %?8 % CaCl2。
5. 根据权利要求1所述的一种蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于：步骤（3) 所述所有的磷酸盐缓冲溶液pH为6. 0?8. 5,稀释倍数为10?200倍，NaCl浓度为0? 30%〇，CaCl2 浓度为 10 ?100mg/L，MgCl2 浓度为 10 ?100mg/L。
6. 根据权利要求1所述的一种蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于：步骤（4) 所述蛭弧菌种子是在磷酸盐缓冲液中加入宿主菌悬液2 %?20%，再接入蛭弧菌，在18? 35°C、180rpm 培养 18 ?60h。
7. 根据权利要求1所述的一种蛭弧菌微生态制剂的生产方法，其特征在于：步骤（5) 所述蛭弧菌制剂的制备是在磷酸盐缓冲液中加入步骤（2)制备的宿主颗粒5?20粒，再接 入步骤⑷制备的蛭弧菌种子1%。?10%。，即制成1〇7?109pfu/mL的蛭弧菌制剂。
【文档编号】C12N1/20GK104357354SQ201410610577
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月1日 优先权日:2014年11月1日
【发明者】江文涛, 马加军, 储玉龙 申请人:广州利洋水产科技股份有限公司