一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用的制作方法

一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.5所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的重组融合蛋白可以有效抑制HBV的复制，清除感染肝脏的病毒，对于乙肝防治具有重大价值。
【专利说明】-种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组融合蛋白TAT-P53及其编码基因与应用，属于生物技术领 域。

【背景技术】
[0002] 目前全世界有3. 5亿人感染HBV，在中国约有9300万人慢性感染HBV，大约 15-40 %的感染人群可能发展为威胁生命的疾病例如肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌等，慢 性HBV感染严重危害人们身体健康。现有用于慢性乙肝患者的治疗方法包括a-干扰素 (IFN-Ci)和核苷或核苷类似物（如拉咪呋啶、阿德福韦和恩替卡韦）。干扰素-a是第一 个获得临床治疗乙肝病毒感染的药物，作为重要的一线药物，聚乙二醇干扰素-a单一治 疗能有效治疗25-40 %的慢性乙型肝炎患者，其与核苷酸类似物联合使用能产生更大的持 续抗病毒疗效和使HBeAg阳性患者中病毒e抗原转阴，但干扰素-a治疗副作用明显，停药 后容易反弹，部分患者对干扰素-a反应不敏感，疗效差。核苷类似物疗程长，停药后病毒 易反弹，而且引起突变、增加耐药性。在中国，肝细胞癌多数由慢性乙肝感染引发，而且目前 临床没有有效的药物治疗。因此，迫切需要开发新的乙肝和肝癌治疗性药物以补充或替代 现有的抗病毒治疗方案。
[0003] 人免疫缺陷病毒 HIV- I 的转录活化因子（Trans-activating transcriptional activator，TAT)，是最先被发现并证实的具穿膜功能的多肽分子。而其做为穿膜肽，在体内 或者离体实验中也被广泛的应用。TAT可以携带多种蛋白质，一般来讲，外源性蛋白不能进 入胞浆，但是如果将TAT与其相连，可以快速有效的被细胞摄入。
[0004] p53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17pl3. 1，编码393个氨基酸组成的 53kD的核内磷酸化蛋白，被称为p53蛋白。p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细 胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。肝癌患者有一定 比例的P53蛋白过表达，p53基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关。有越来越多的文 献表明，P53能抑制癌细胞生长和恶性转化，调节乙型肝炎病毒的复制。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用。
[0006] 本发明提供一种蛋白，为如下（1)或（2)所示：
[0007] (I)SEQ ID No. 5 所示的蛋白；
[0008] (2)将SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
[0009] 所述蛋白在N端与C端还可以带有His标签。
[0010] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0011] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
[0012] I) SEQ ID No. 4中自5'末端起第10位至第1224位核苷酸所示的DNA分子；
[0013] 2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0014] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。
[0015] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0016] 一种制备上述蛋白的方法也属于本发明的保护范围，是将上述任一所述的编码基 因导入原核细胞中进行表达。
[0017] 上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将 所述编码基因插入pET28a(+)的多克隆位点得到的，具体是将SEQ ID No. 4所示的DNA分 子插入pET28a⑴的BamHI和XhoI位点间得到的；
[0018] 所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述表达之后还包括将细胞破碎、收集沉淀、将沉淀溶解 取上清和/或将上清进行纯化的步骤。
[0020] 上述任一所述的方法中，所述破碎为超声破碎；
[0021] 所述将沉淀溶解取上清的方法为：将所述收集沉淀得到的沉淀用8M的尿素溶液 溶解，得到蛋白溶液；将蛋白溶液的pH值调至9. 8-10. 2,离心取上清，记作上清1 ;将上清1 的PH值调至7. 6-7. 8,离心取上清，即得；
[0022] 所述pH值调至9. 8-10. 2时所用的溶液具体为NaOH的水溶液；
[0023] 所述pH调至7. 6-7. 8时所用的溶液具体为HCl水溶液；
[0024] 所述pH值调至9. 8-10. 2时所述pH具体为10. 0 ;
[0025] 所述pH值调至7. 6-7. 8时所述pH具体为7. 7 ;
[0026] 所述将上清进行纯化为镍离子亲和层析纯化，步骤如下：
[0027] a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱至少3个柱体积；
[0028] b、将所述沉淀溶解取上清得到的上清加入镍离子柱；
[0029] c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；
[0030] d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去未结合的蛋白；
[0031] 所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl,尿素和咪 唑，所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液 中的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪 唑溶液中的浓度为60mM，pH为7. 7 ;
[0032] e、用300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，即得；
[0033] 所述300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO 4, NaCl,尿素和 咪唑，所述Na2HPO4在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶 液中的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM 咪唑溶液中的浓度为300mM，pH为7. 7 ;
[0034] 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl，尿素和咪 唑，所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液 中的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿 素溶液中的浓度为20mM，pH为7. 7。
[0035] 上述任一所述的方法中，所述将上清进行纯化之后还包括将纯化后的目的蛋白透 析浓缩、去除内毒素和/或除菌的步骤；
[0036] 所述透析的具体条件为：在4°C条件下，用pH8. 0的IM Tris-HCl缓冲液进行透 析；
[0037] 所述除菌具体为0? 22uM滤膜除菌。
[0038] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备抑制HBV蛋白的表达、HBV mRNA转录 和/或HBV复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0039] 所述蛋白具体为HBV表面抗原和/或HBV e抗原；
[0040] 所述mRNA具体为转录合成前基因组RNA和/或总RNA ;
[0041] 或，
[0042] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备抑制和/或清除HBV的产品中的应用 也属于本发明的保护范围；
[0043] 或，
[0044] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备预防和/或治疗HBV引起的疾病的产 品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0045] 所述疾病具体为肝炎、肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌。
[0046] 本发明提供的重组融合蛋白可以有效抑制HBV的复制，清除感染肝脏的病毒，对 于乙肝防治具有重大价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0047] 图1为重组融合蛋白TAT-p53的电泳结果。
[0048] 图2为HBV复制中间体的检测。

【具体实施方式】
[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。
[0052] ATCC即美国模式培养物集存库（American type culture collection)的简写，网 址为 http: //www. atcc. org/。
[0053] HBV表面抗原（HBsAg)检测试剂盒和HBV e抗原检测试剂盒均购自上海科华生物 工程股份有限公司，批准文号分别为国药准字S10910113和国药准字S10910112。
[0054] 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自中山大学达安基因股 份有限公司，产品号为Cat. #DA-B051。
[0055] 全血/组织基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，产品目录号 为 DP304。
[0056] Southern blot 试剂盒购自 GE，产品目录号为 RPN3680, RPN3681，RPN3690， RPN3691, RPN3692。
[0057] 转染试剂 Lipofectamine 2000 购自 invitrogen，产品目录号为 11668019。
[0058] 人肝癌细胞 HepG2. 2. 1. 5 在文献"Mary Ann Sells, Mei-Ling Chen, George Acs. Production of hepatiti s B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.Proc.Nati. Acad. Sci. 1987;84:1005-1009.，'中公开过， 公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0059] Huh-7 购自 ATCC，ATCC 编号为 PTA-4583。
[0060] HBV DNA 质粒（pHBVL 3)在文献"Hong Tang，Alan McLachlan*. Transcriptional regulation of hepati tis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proc. Nati. Acad. Sci. 2001 ;98 (4) : 1841-1846. " 中公开 过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0061] pET28a(+)购自武汉华美生物工程有限公司，产品目录号为CSB-PL200040。
[0062] 大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技（北京）有限公司，产品目录号为 CB105-02。
[0063] HBV转基因鼠购自中国人民解放军第四五八（458)医院。
[0064] 实施例1、重组融合蛋白TAT-p53的制备
[0065] 一、pET28a-TAT_p53 载体的构建
[0066] l、TAT_p53引物的设计与合成
[0067] TAT-p53-up: 5 ' -ATCGGATCCTATGCGCGTGCGGCGGCGCGTCAGGCGCGTGCGATGGAGGAGCCGC AGTCAG-3'（SEQ ID No. 1)
[0068] (下划线所示序列为BamHI酶切识别位点）
[0069] TAT-D53-dn: 5 ' -ACACTCGAGTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTC-3 ' (SEQ ID No. 2)
[0070](下划线所示序列为XhoI酶切识别位点）
[0071] 2、以SEQ ID No. 3所示的DNA分子为模板，TAT-p53-up和TAT-p53-dn为引物进 行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No. 4所示。SEQ ID No. 4中自5'末端起第10 位至第1224位核苷酸所示的序列为TAT-p53的编码基因序列，TAT-p53蛋白的氨基酸序列 如 SEQ ID No. 5 所示。
[0072] 3、BamHI和XhoI双酶切SEQ ID No. 4所示的DNA分子，得到基因片段；BamHI和 XhoI双酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒， 将其命名为pET28a-TAT-p53,将pET28a-TAT-p53送测序，结果正确。
[0073] 二、原核表达TAT-p53重组融合蛋白
[0074] 利用大肠杆菌表达TAT-p53重组融合蛋白，具体方法如下：
[0075] 1、将重组质粒pET28a-TAT_p53转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，从平板上挑 取单菌落接入含1〇〇11^/1^卡那霉素的2\￥1'培养基（胰蛋白胨16§，酵母提取物1(^，氯化 钠5g，加水定容至IOOOmL)活化，得活化液；取活化液接入2 X YT培养基，37°C培养至0D_ 值为0. 6-1. 0,然后加入IPTG使其终浓度为lmmol/L，37°C诱导4h，收集菌体。
[0076] 2、菌体用 1/10 培养体积的超声缓冲液（20mM Na2HPO4, 0? IM NaCl, 3. 5M Urea,余 量为水，pH7. 7)重悬，冰浴条件下超声破碎（200W，破碎3s停7s，99次3个循环），然后 4°C 10000转/min离心15min，去上清，收集沉淀。
[0077] 3、用干净的玻璃棒轻轻刮去表层暗黄色的杂质，得到蛋白沉淀。
[0078] 三、TAT-p53重组融合蛋白的纯化
[0079] 1、将步骤二收集的蛋白沉淀用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液。
[0080] 8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl，尿素和咪唑， 所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的 浓度为〇. 5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶 液中的浓度为20mM，pH7. 7。
[0081] 2、加入IM NaOH的水溶液将上述蛋白溶液的pH值调至10. 0(10. 0±0. 2均可），温 度25 °C (25 ±5 °C均可）下搅拌混匀10分钟。
[0082] 3、4°C 12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清1。
[0083] 4、在上清1中加入体积百分含量10 %的HCl水溶液将上清的pH值调回至 7. 7(7. 7±0. 1 均可）。
[0084] 5、4°C 12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清2。
[0085] 6、利用镍离子柱亲和层析法纯化上清2,步骤如下：
[0086] a、用8M的尿素溶液至少3个柱体积（具体约3-5个柱体积）预平衡镍离子柱； [0087] 8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl,尿素和咪唑， 所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的 浓度为〇. 5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶 液中的浓度为20mM，pH7. 7。
[0088] b、将上清2缓慢加入镍离子柱；
[0089] c、用8M的尿素溶液至少5个柱体积（约5-10个柱体积）冲洗镍离子柱，洗去杂 蛋白；
[0090] d、用60mM咪唑溶液至少5个柱体积（约5-10个柱体积）冲洗镍离子柱，洗去未 结合的蛋白；
[0091] 60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl,尿素和咪唑， 所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的 浓度为〇. 5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪唑溶 液中的浓度为60mM，pH7. 7。
[0092] e、用300mM咪唑溶液（约3个柱体积）洗脱目的蛋白。
[0093] 300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl,尿素和咪唑， 所述Na2HPO4在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶液中 的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM咪 唑溶液中的浓度为300mM，pH7. 7。
[0094] 7、将目的蛋白溶液置于4°C、IM Tris-HCl (pH8. 0)缓冲液中透析浓缩，得到浓缩的 蛋白。
[0095] 8、浓缩的蛋白经过TritonX-114萃取法除内毒素，0. 22uM滤膜除菌。
[0096] 9、将步骤8得到的蛋白经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，只有单一的目的条 带，结果如图1所示。采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80°C。
[0097] 该目的蛋白在N端与C端带有His标签，下述实施例中简称为TAT-p53重组融合 蛋白。
[0098] 实施例2、对照蛋白TAT-GST的合成
[0099] 一、pET28a-TAT_GST 载体的构建
[0100] UTAT-GST引物的设计与合成
[0101] TAT-GST-UP:
[0102] 5, -ATCGGATCCTATGCGCGTGCGGCGGCGCGTCAGGCGCGTGCGATGTCCCCTATACTA-3' (SEQ ID No.6)
[0103] (下划线所示序列为BamHI酶切识别位点）
[0104] TAT-GST-down: 5 ' -ACACTCGAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTCGAGT-3 ' (SEQ ID No. 7)
[0105] (下划线所示序列为XhoI酶切识别位点）
[0106] 2、以 SEQ ID No. 8 所示的 DNA 分子为模板，TAT-GST-up 和 TAT-GST-down 为引物进 行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No. 9所示。SEQ ID No. 9中自5'末端起第10 位至第777位为TAT-GST的编码基因序列，TAT-GST蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo. 10所 /Jn 〇
[0107] 3、BamHI和Xho I双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；BamHI和Xho I双酶切 pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为 pET28a-TAT-GST，将 pET28a-TAT-GST 送测序，结果正确。
[0108] 二、原核表达TAT-GST重组融合蛋白
[0109] 具体步骤同实施例1中步骤二，仅将pET28a-TAT-p53替换为pET28a-TAT-GST。
[0110] 三、TAT-GST重组融合蛋白的纯化
[0111] 具体步骤同实施例1中步骤三。
[0112] 实施例3、人肝癌细胞Huh-7中TAT-p53重组融合蛋白抑制HBV能力的检测
[0113] 转染前一天将同等量的Huh-7接种到6孔板用含体积百分含量10% FBS的DMEM培 养基培养，细胞汇合度达到90%左右进行转染，转染前一个小时将培养基换成opti-MEM， 将pHBVl. 3复制性质粒采用Lipofectamine 2000转染Huh-7细胞。转染后4-6小时用 PBS洗细胞三次，并换成2ml含有体积百分含量10%的FBS的DMEM培养基，同时加入终浓 度为30ug/mL的重组融合蛋白TAT-p53作为实验组，或加入终浓度为30ug/mL的对照蛋白 TAT-GST作为对照组，继续培养，在加入蛋白后的72h检测各组上清中的HBsAg、HBeAg，上清 DNA拷贝数以及胞内pgRNA、总RNA表达水平和胞内HBV复制中间体。每个组设3个重复， 实验重复2次。采用t检验计算显著性差异，P〈0. 05作为差异显著。
[0114] -、HBV表面抗原（HBsAg)、e抗原（HBeAg)的检测
[0115] 在加入蛋白后72h收集各组细胞的上清，按照HBV表面抗原（HBsAg)检测试剂 盒和HBV e抗原检测试剂盒说明书检测各组上清中的HBV表面抗原（HBsAg)和e抗原 (HBeAg)。
[0116] 结果表明，与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53显著降低了细胞培养上清中HBV表 面抗原（HBsAg)和e抗原（HBeAg)的水平。与对照组相比，实验组的HBV表面抗原（HBsAg)、 e抗原（HBeAg)的水平分别下降了 63%和41% (P〈0. 01)。
[0117] 二、细胞上清DNA拷贝数检测
[0118] 使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行DNA拷贝数的绝 对定量，按照试剂盒说明书进行操作。
[0119] 在加入蛋白后的72h后收集各组的200ul培养液，室温12000rpm，2min离心去除 细胞碎片，加入IOmM的MgCl 2, 10〇n/ml的DNase I，37°C消化3小时，再加入lg/100ml的 SDS，0. 5mg/ml的蛋白酶K，55°C消化2个小时，再加入等体积的苯酚进行1:1抽提，乙醇沉 淀过夜，高速离心，晾干，50ul H2O溶解，RT-PCR定量检测，把没有经过蛋白酶K消化的样品 作为阴性对照（阴性对照是为了确定DNase I完全把外源质粒消化干净，后续所得的DNA 全为细胞内的），确定转染的质粒消化干净，不会干扰RT-PCR定量检测结果。
[0120] HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法：将已知浓度的质粒pHBVl. 3依次进行 1000倍稀释，进行RT-PCR定量检测。
[0121] 上述实验重复三次，结果取平均值。
[0122] RT-PCR定量检测引物如下：
[0123] forward :5' -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3' ；（SEQ ID No. 11)
[0124] reverse :5, -TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3，。（SEQ ID No. 12)
[0125] 结果表明，与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处理的细胞上清中HBV DNA拷贝数 下降了 93% (P〈0. 01)。
[0126] 三、mRNA 检测
[0127] 在加入蛋白后的72h，在各组中分别加入Iml的Trizol试剂，裂解5min，吸入到 1.5ml的EP管中，加入200ul无RNA酶污染的氯仿，混匀15s，4°C 13000rpm离心15min， 吸取上清转移到一个新的I. 5mlEP管中，加入500ul异丙醇室温沉淀10min，4°C 13000rpm 离心lOmin，倒掉上清，用DEPC水配制的体积百分含量为75 %的乙醇水溶液洗涤沉淀一 次，晾干，50ul DEPC水溶解，得到各组的mRNA，并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板， 以pgRNA forward和pgRNA reverse为引物进行RT-PCR，定量检测转录合成前基因组 RNA (pregenomicRNA，pgRNA)水平，或，以 total RNA forward和 total RNA reverse 为引物 进行RT-PCR，定量检测总RNA水平，同时以GAPDH为内参基因，以GAPDH forward和GAPDH reverse为其检测引物。
[0128] pgRNA forward :5, -TCTTGCCTTACTTTTGGAAG-3, ；（SEQ ID No. 13)
[0129] pgRNA reverse :5, -AGTTCTTCTTCTAGGGGACC-3, ；（SEQ ID No. 14)
[0130] total RNA forward :5' -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3' ；（SEQ ID No. 15)
[0131] total RNA reverse :5, -TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3, ；（SEQ ID No. 16)
[0132] GAPDH forward :5，-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3, ；（SEQ ID No. 17)
[0133] GAPDH reverse :5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3, ；（SEQ ID No. 18)
[0134] 结果表明，与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处理的细胞中HBV pgRNA和总RNA 水平分别下降了 63 %和59% (P〈0. 01)。
[0135] 四、Southern blot检测胞内HBV复制中间体
[0136] 在加入蛋白后的72h，将各组细胞收集到I. 5ml离心管中，采用全血/组织基因组 提取试剂盒提取各组细胞内的总DNA，并用紫外分光光度计0D260和0D280测定DNA浓度和 纯度，1 %琼脂糖凝胶电泳，采用Southern blot试剂盒检测各组的HBV复制中间体，检测方 法按照试剂盒说明书。
[0137] 结果如图2所示，图2中，TAT-p53代表实验组，TAT-GST代表对照组。
[0138] 图2表明，与实验组相比，对照组的HBV复制中间体条带（rc-ds-ss DNA)灰度较 深，HBV复制中间体浓度高。
[0139] 以上结果表明，TAT-p53能显著抑制HBV蛋白的表达、mRNA转录和病毒复制。
[0140] 实施例4、人肝癌细胞H印G2. 2. I. 5中TAT-p53重组融合蛋白抑制HBV能力的检测
[0141] 按照实施例3的方法检测人肝癌细胞H印G2. 2. 1. 5中TAT-p53重组融合蛋白抑制 HBV能力，其中将人肝癌细胞Huh-7替换为人肝癌细胞H印G2. 2. 1. 5,并且不经过pHBVl. 3 复制性质粒转染的步骤（因为H印G2. 2. 1.5内含有HBV整合基因组，所以不需要转染步 骤。）
[0142] 检测结果如下：与对照组相比，TAT-p53显著降低了细胞培养上清中HBV表面抗原 (HBsAg)和e抗原（HBeAg)的水平，与对照组相比，实验组的HBV表面抗原（HBsAg)、e抗原 (HBeAg)的水平分别下降了 51%和31% (P〈0. 01)。与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处 理的细胞上清中HBV DNA拷贝数下降了 83% (P〈0. 01)。与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53 处理的细胞中HBV pgRNA和总RNA水平分别下降了 56%和49% (P〈0. 01)。与实验组相比， 对照组的HBV复制中间体条带灰度较深，HBV复制中间体浓度高。
[0143] 以上结果表明，TAT-p53能显著抑制HBV蛋白表达、mRNA转录和病毒复制。
[0144] 实施例5、重组融合蛋白TAT-p53在HBV转基因鼠中抑制HBV能力的检测
[0145] 将6-8周龄的体重相近的HBV转基因鼠随机分成2组，每组5只，各组的处理方法 如下：
[0146] 第一组（TAT-p53组）：每只小鼠按照10ug/g小鼠体重的剂量给药TAT-p53,将蛋 白溶解于〇. 3ml的PBS中，尾静脉注射，每隔三天注射一次，持续两周。
[0147] 第二组（阴性对照TAT-GST组）：每只小鼠按照lOug/g小鼠体重的剂量给药 TAT-GST，将蛋白溶解于0. 3ml的PBS中，尾静脉注射，每隔三天注射一次，持续两周。
[0148] 自尾静脉注射蛋白结束，每隔3天检测一次小鼠血清中HBV表面抗原（HBsAg)表 达水平以及HBV DNA拷贝数。
[0149] 一、小鼠血清中HBsAg的检测
[0150] 小鼠血清中的HBsAg检测采用HBV表面抗原（HBsAg)检测试剂盒检测，操作步骤 按照说明书进行。
[0151] 结果表明，与阴性对照TAT-GST组相比，TAT-p53组的HBsAg在尾静脉注射蛋白结 束第9天明显下降。在尾静脉注射蛋白结束的第15天，TAT-p53组平均HBsAg值为0. 37ug/ ml，阴性对照TAT-GST组为0. 55ug/ml，相对于阴性对照TAT-GST组，TAT-p53组的HBsAg 下降了 33% (P〈0. 05)，在尾静脉注射蛋白结束的第15天，相对于阴性对照TAT-GST组， TAT-p53组小鼠血清中HBsAg的表达水平下降最明显。
[0152] 二、小鼠血清中HBV DNA拷贝数的检测
[0153] 在尾静脉注射蛋白结束的第15天，使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 (PCR-荧光探针法）对各组小鼠的200ul血清进行HBV DNA拷贝数的绝对定量，操作步骤按 照说明书进行，各组重复三次实验，结果取平均值。
[0154] HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法如实施例3中步骤二所示。
[0155] 结果表明，在尾静脉注射蛋白结束的第15天，阴性对照TAT-GST组小鼠血清中 HBV DNA拷贝数的平均值为105_4个拷贝，TAT-p53组的平均值为103_ 1个拷贝，与阴性对照 TAT-GST组相比，TAT-p53组的HBV DNA拷贝数降低约200倍（p〈0. 01)。
[0156] 三、小鼠肝脏中HBV DNA拷贝数的检测
[0157] 采用全血/组织基因组提取试剂盒提取各组小鼠的肝脏组织中的DNA，以total RNA forward 和 total RNA reverse 为引物，进行 RT-PCR 定量检测。
[0158] 结果表明，在尾静脉注射蛋白结束的第15天，阴性对照TAT-GST组小鼠肝脏中HBV DNA拷贝数平均值为IO 6 3个拷贝，TAT-p53组的平均值为IO3 4个拷贝，与阴性对照TAT-GST 组相比，TAT-p53组的HBV DNA拷贝数降低了 794倍（p〈0. 01)。
[0159] 以上结果表明，TAT-p53能在体内显著抑制HBV的蛋白表达和病毒复制。
【权利要求】
1. 一种蛋白，为如下⑴或⑵所示： (1) 5￡〇10此.5所示的蛋白； (2) 将SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种： 1. SEQ ID No. 4中自5'末端起第10位至第1224位核苷酸所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5. -种制备权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入原 核细胞中进行表达。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入 的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入pET28a(+)的多克隆位点得到的，具体是将 SEQ ID No. 4所示的DNA分子插入pET28a(+)的BamHI和Xhol位点间得到的； 所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21 (DE3)。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述表达之后还包括将细胞破碎、收 集沉淀、将沉淀溶解取上清和/或将上清进行纯化的步骤。
8. 根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述破碎为超声破碎； 所述将沉淀溶解取上清的方法为：将所述收集沉淀得到的沉淀用8M的尿素溶液溶解， 得到蛋白溶液；将蛋白溶液的pH值调至9. 8-10. 2,离心取上清，记作上清1 ;将上清1的pH 值调至7. 6-7. 8,离心取上清，即得； 所述将上清进行纯化的方法为镍离子亲和层析纯化，步骤如下： a、 用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱至少3个柱体积； b、 将所述沉淀溶解取上清得到的上清加入镍离子柱； c、 用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白； d、 用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去未结合的蛋白； 所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HP04, NaCl，尿素和咪唑， 所述Na2HP04在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的 浓度为〇. 5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪唑溶 液中的浓度为60mM，pH为7. 7 ; e、 用300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，即得； 所述300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HP04, NaCl，尿素和咪唑， 所述Na2HP04在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶液中 的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM咪 唑溶液中的浓度为300mM，pH为7. 7 ; 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HP04, NaCl，尿素和咪唑， 所述Na2HP04在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的 浓度为〇. 5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶 液中的浓度为20mM，pH为7. 7。
9. 根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述将上清进行纯化之后还包括 将纯化后的目的蛋白透析浓缩、去除内毒素和/或除菌的步骤。
10. 权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的编码基因在制备抑制HBV蛋白的表 达、HBV mRNA转录和/或HBV复制的产品中的应用； 或， 权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的编码基因在制备抑制和/或清除HBV 的产品中的应用； 或， 权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的编码基因在制备预防和/或治疗HBV 引起的疾病的产品中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104356240SQ201410610545
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】孟颂东, 初骁宇, 陈立钊 申请人:中国科学院微生物研究所