棉蚜螺虫乙酯抗性相关cyp6a2启动子及活性分析的制作方法
【专利摘要】棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子及活性分析属生物工程【技术领域】，本发明提供了获得的螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列如SEQ ID NO:1所示，其中-1bp至-489bp区为棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子的DNA序列，+1bp至+56bp区为棉蚜P450基因CYP6A2的5’非翻译区的DNA序列；一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体包含棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列；一种用真核细胞表达载体的表达包含棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列；本发明可用于真核基因的高效表达，用于获得低丰度基因研究，使其获得高水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。
【专利说明】棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子及活性分析
【技术领域】
[0001] 本发明属生物工程【技术领域】，涉及一段DNA序列，它可以作为启动子调控基因的 表达，具体涉及一种来源于棉蚜P450基因CYP6A2,并在细胞中高度表达的诱导型启动子序 列。
【背景技术】
[0002] 棉蚜（Aphis gossypii)是一种危害严重的世界性农业害虫，它通过取食和病毒传 播来危害农作物，并已对多种杀虫剂产生了抗药性。螺虫乙酯是有效防治抗性棉蚜的季酮 酸类杀虫剂。前期研究结果表明，棉蚜细胞色素P450基因CPY6A2表达量在螺虫乙酯抗性 棉蚜中高水平表达。这可能是棉蚜对螺虫乙酯产生代谢抗性的重要原因。这也显示出棉蚜 CYP6A2基因启动子极可能具有较高诱导活性。因此，对于新的高活性的棉蚜相关启动子的 克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录 因子的研究具有重要意义，将为深入研究害虫抗药性机制及新型抗虫新品种的研制奠定 基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供一种螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列，该启动子 序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于棉蚜P450基因CYPA2。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种用于真核细胞转染的CYP6A2启动子真核表达载 体，该载体指导高水平表达目的基因CYP6A2的启动子序列和5'非翻译区。
[0005] 本发明的第三个目的是提供一种所述真核细胞表达载体的表达，该载体的表达能 反映启动子活性的高低。
[0006] 为实现上述目的，本发明克隆了棉蚜P450基因CYP6A2的启动子区，并构建了真核 表达载体，所述载体包含带有CYP6A2基因的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载 体在Sf9细胞中表达，并检测到该启动子的高水平活性。
[0007] 本发明提供一种获得的棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列，所述启动子 序列如SEQ ID NO: 1所示，其中SEQ ID NO :1的-Ibp至-489bp区（见序列表）为棉蚜 CYP6A2启动子的DNA序列，在真核细胞中，本发明所述的启动子具有高水平活性。
[0008] 获得的棉酚螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列源自棉蚜P450基因CYP6A2。
[0009] SEQ ID N0:1的+Ibp至+56bp区（见序列表）为克隆得到的棉蚜P450基因CYP6A2 的5'非翻译区的DNA序列，本发明所述的棉蚜CYP6A2基因的5'非翻译区能在Sf9细胞中 通过增强目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。
[0010] 为实现另一个目的，本发明提供一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述 真核细胞表达载体包含棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列。
[0011] 上述用于Sf9细胞转染的真核表达载体是指能够在细胞中瞬时、高水平表达外源 基因的载体。例如PGL3载体、pGL4载体。
[0012] -种用真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含棉蚜螺虫乙酯抗性相关 CYP6A2启动子序列。
[0013]关于本发明所述的用于真核细胞的表达载体（PGL3)，所述的棉蚜CYP6A2基因的 启动子和5'非翻译区在表达载体中位于外源基因（Luc+)的前面。本发明提供通过插入本 发明所述的棉蚜CYP6A2基因的启动子和5'非翻译区至含有Luc+报告基因的载体中而构 建的PGL3-CYP6A2 (-489/+134)。但是，所述Luc+报告基因是外源基因，并预期可以用任意 其它有用的外源基因来代替。
[0014] 本发明提供来自棉蚜CYP6A2基因的启动子和5'非翻译区，根据本发明的启动子 和5'非翻译区使得能够在真核细胞中进行高水平的表达。
[0015] 本发明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表达，用于获得低丰度基因研究， 使其获得1?水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为棉蚜基因组电泳图
[0017]图 2 为 Genome walker PCR 电泳图
[0018] 图3为CYP6A2连T载酶切鉴定电泳图
[0019] 图4为CYP6A2连pGL3PCR鉴定电泳图
[0020] 图5为CYP6A2连pGL3酶切鉴定电泳图
[0021] 图6为pGL3-CYP6A2 (-489/+134)转染Sf9细胞后启动子活性检测示意图
[0022] 图 7 为 pGL3-CYP6A2 (-489/+134)表达载体示意图
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实 施本发明。尽管已经结合本发明的优选的【具体实施方式】来对本发明进行了描述，但是以下 描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。
[0024] 实施例1:棉蚜CYP6A2启动子的克隆
[0025] 依据棉蚜CYP6A2mRNA序列设计染色体步移引物GSPl (5-CCTCAGGTTCACCAGACTGTT GAACAG-3)和 GSP2 (5-GTACGCCAGTAACACCGACACAACAG-3)。提取棉蚜基因组 DNA (图 1)，并用 平切酶AfeI、EcoRV-HF、PvuII、SmaI、PmeI、StuI进行消化，纯化DNA并连接接头引物。按 照设计的特异性引物进行PCR扩增，并按照Genome walker (Clontech)PCR方法进行扩增， 扩增得到目的片段，经1 %琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为623bp的条带（图2)，并进 行回收。回收片段与PGEM-T载体连接得到重组质粒，提取质粒酶切验证（图3)，并测序。
[0026] 棉蚜CYP6A2启动子（启动子序列如SEQ ID NO: 1所示，其中SEQ ID NO: 1的-Ibp 至-489bp区为棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子的DNA核苷酸序列），在棉蚜CYP6A2 基因的5'区序列中得到鉴定。
[0027] 在本发明的启动子序列表中，转录起始位点的碱基用+1示出，ATG用红色标注。并 用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。
[0028] 启动子分析网站 http://www. gene-regulation. com/pub/programs/alibaba2/ index, html
[0029] 实施例2 :棉蚜CYP6A2启动子表达载体pGL3-CYP6A2 (-489/+134)的构建
[0030] 将在实施例1中所克隆的棉蚜CYP6A2启动子和5'非翻译区（见序列表）插入到 pGL3 载体中，从而构建 pGL3-CYP6A2 (-489/+134)载体。
[0031]更具体地说，利用引物（5-ACGCGTCCAATCGACTTTCGTTT-3， 5-CTCGAGGTACGCCAGTAACACCG-3)扩增，并将该启动子序列克隆到pGL3载体MluI和XhoI位 点上，构建成PGL3-CYP6A2 (-489/+134)，用于驱动Luc+的表达，经PCR鉴定（图4)和酶切 鉴定（图5)获得启动子与载体的重组质粒。
[0032] 实施例3:鉴定本发明所述的棉蚜CYP6A2启动子的活性
[0033] Sf9 细胞接种于 24 孔板中（4X IO5Cells/ 孔），用 Cellfectin II 试剂 (Invitrogen ;2 μ L/ 每孔）瞬时共转染 pGL3-CYP6A2 (-489/+134)建体（2 μ g/ 孔）和对照 报告基因质粒PhRL-TK (Promega ;0. 2 μ g/孔）。48小时后，收获细胞，将所得裂解物用于测 量萤光素酶活性（Promega)。如图6所示，pGL3-CYP6A2(-489/+134)所转染细胞具有很高 荧光素酶活性。
[0034] 实用性
[0035] 如上所述，本发明提供棉蚜CYP6A2基因启动子和5'非翻译区。
[0036] 本发明提供分别将棉蚜CYP6A2基因启动子和5'非翻译区插入至pGL3而获得的 真核细胞表达载体。
[0037] 经使用所述的真核细胞表达载体进行鉴定，本发明所述的棉蚜CYP6A2基因启动 子和5'非翻译区能够启动下游基因的表达。因此，表明本发明可用于提高真核基因的高效 表达，应用于获得低丰度基因研究，使其获得商水平、稳定表达。
[0038]
【权利要求】
1. 一种获得的棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列，其特征在于所述启动子序 列如SEQ ID NO: 1所示，其中SEQ ID NO :1的-lbp至-489bp区为棉蚜螺虫乙酯抗性相关 CYP6A2启动子的DNA序列，SEQ ID NO: 1的+lbp至+56bp区为棉蚜P450基因 CYP6A2的5' 非翻译区的DNA序列。
2. -种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，其特征在于所述真核细胞表达载体包含 权利要求1所述的棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列。
3. -种用真核细胞表达载体的表达，其特征在于所述真核细胞表达包含权利要求1所 述的棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列。
【文档编号】C12N15/113GK104357450SQ201410632626
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】潘怡欧, 尚庆利, 杨晨, 彭天飞, 席景会, 毕锐, 辛雪成 申请人:吉林大学