一种三明治样多细胞片层的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种三明治样多细胞片层的制备方法，包括如下步骤：电纺液配制步骤，向三氟乙醇溶剂中加入壳聚糖和胶原，所述壳聚糖和胶原的质量比范围是1:4～4:1，搅拌得到电纺液；静电纺丝步骤，将所述电纺液高压静电纺丝得到壳聚糖-胶原电纺生物膜；细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤，将两个细胞片层分别附着在所述壳聚糖-胶原电纺生物膜两面生长，最终得到细胞-膜-细胞多细胞片层。本方法制备工艺简单可控，以电纺生物膜作为支撑膜，让两个细胞片层贴附在生物膜上生长，既增加了细胞的增殖空间，增加了两个细胞片层间营养物质的流通，又保证了细胞片层在转移过程中的完整性，从而给临床多细胞片层移植治疗提供了一个简便易行的操作方法。
【专利说明】—种三明治样多细胞片层的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学组织工程领域，尤其是关于一种多细胞片层的制备方法。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的发展，机体由于损伤和病变造成的组织缺损由组织工程的方法进行替代与再生已成为现代医学的热点。组织工程技术的基本要素包括有良好应答特性的组织细胞、起支撑作用的细胞外基质以及促进细胞和组织再生的生物活性因子。组织工程的最重要要素是种子细胞、支架，其关键技术是将种子细胞接种于塑形的可降解生物材料植入体内，生长以形成所需组织。传统组织工程修复缺损的方式一般有两种:一是细胞或细胞团直接注射或放置在缺损局部；二是将细胞接种于可降解的生物支架上，这种方法在组织工程中应用最广，然而，支架中心部位细胞量少，细胞存活率低是组织工程有待解决的难题。
[0003]由于现有组织工程方法的局限，日本科学家提出了一种全新的组织工程构建方法:细胞片层工程。在组织发生过程中，多种细胞层相互作用，相互协调，共同行使功能。如果在组织工程中也能通过细胞一层一层相互结合，共同作用，就可以克服单个细胞及支架的弊端，模拟正常组织的发生过程。经细胞片层技术收获细胞无需胰蛋白酶的消化作用便可自动从培养皿表面分离。收获的细胞是含有细胞外基质的一层完整的片状结构，含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白。因此，应用细胞片层技术构建的组织结构更接近于正常组织。
[0004]细胞片层技术虽然可以克服传统组织工程方法的种种不足，但该方法仍有些问题亟待解决。与其他组织工程方法一样，应用细胞片层技术进行组织重建时，种子细胞的获取比较困难；叠加的细胞片层超过一定厚度时，常导致内部细胞的坏死；应用细胞片层技术构建大的功能性组织结构仍是细胞片层技术面临的一大难题。支架技术和细胞片层技术的结合将有助于大块组织的重建。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种新的三明治样多细胞片层的制备方法。
[0006]本发明提供一种三明治样多细胞片层的制备方法，包括如下步骤:
[0007]电纺液配制步骤，向三氟乙醇溶剂中加入壳聚糖和胶原，所述壳聚糖和胶原的质量比范围是1:4?4:1,搅拌得到电纺液；
[0008]静电纺丝步骤，将所述电纺液高压静电纺丝得到壳聚糖-胶原电纺生物膜；
[0009]细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤，将两个细胞片层分别附着在所述壳聚糖-胶原电纺生物膜两面生长，最终得到细胞-膜-细胞多细胞片层。
[0010]制备三氟乙醇溶剂时，可以按1:1体积比配制好2，2，2-三氟乙醇和蒸馏水作为溶齐U，即溶剂可以为50%浓度的三氟乙醇。
[0011]所述壳聚糖为蟹壳壳聚糖，其脱乙酰度为98% ;胶原为I型鼠尾胶原，分子量在1-30万之间。
[0012]所述壳聚糖和胶原的质量比选自2:8、3:7、5:5、7:3和8:2。
[0013]所述壳聚糖和胶原的质量比为7:3。
[0014]所述电纺液的浓度为15%。该浓度是指壳聚糖和胶原在三氟乙醇溶剂中的浓度。
[0015]所述搅拌的速度是500?100rpm,所述搅拌的时间是2?5h。
[0016]所述静电纺丝步骤中，通过高压静电纺丝装置进行高压静电纺丝，所述高压静电纺丝装置包括高压电源、喷射装置和接收装置，所述高压电源提供的电压是8?15kv，所述喷射装置所需针头型号为5?9号，所述针头与接收装置的距离为9?15cm，所述喷射装置送液速度为0.5?1.5ml/h。高压静电纺丝装置可以包括溶液存储装置。静电纺丝的温度可以是25°C。
[0017]所述细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤中，将灭菌后的所述壳聚糖-胶原电纺生物膜置于在第一温敏培养皿表面已生长融合的第一细胞片层上；降低温敏培养表面的温度至20-25°C，10-30min后将所述第一细胞片层从边缘剥离；上下颠倒附着有所述第一细胞片层的壳聚糖-胶原电纺膜，并将其置于第二温敏培养皿的第二细胞片层上，形成的多细胞片层在温敏培养表面生长后，降低温敏培养表面的温度至20-25°C，10-30min后剥离得到所述细胞-膜-细胞多细胞片层。
[0018]细胞片层可以是单细胞片层，如脂肪干细胞片层。
[0019]降低温敏培养表面的温度至20°C，1min后剥离细胞片层。该剥离细胞片层包括剥离第一细胞片层和剥离整个多细胞片层。
[0020]形成的所述多细胞片层在温敏培养表面生长的时间为3天。
[0021]较佳的，电纺液的搅拌时间为4h,搅拌速度为500rpm。
[0022]较佳的，所述的喷射装置中所需针头型号为6号。
[0023]较佳的，所述针头与接收装置的距离为14cm。
[0024]较佳的，所述喷射装置送液速度为lml/h。
[0025]较佳的，进行高压静电纺丝的电压为12.5kv。
[0026]本发明的有益效果是:1)制备工艺简单可控；2)壳聚糖-胶原电纺生物膜孔隙率较高，空隙分布均匀，且能够根据需要进行调节；该生物膜的成分接近细胞外基质的主要固相成分，具有高度仿生性，生物相容性好，无细胞毒性，细胞很容易在电纺生物膜上粘附增殖；3)以电纺生物膜作为支撑膜，让两个细胞片层贴附在生物膜上生长，既增加了细胞的增殖空间，增加了两个细胞片层间营养物质的流通，又保证了细胞片层在转移过程中的完整性，从而给临床多细胞片层移植治疗提供了一个简便易行的操作方法。
【具体实施方式】
[0027]实施例1:
[0028]取0.12g壳聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶剂，磁力搅拌过程中逐渐加入0.48g胶原，搅拌2h至完全溶解，得到15%的混合纺丝液4ml。将混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速度为0.5ml/h，选用9号不锈钢针头并与9.5kv高压相连，用已接地的铝箔在距针尖9cm处接收纤维丝。8小时后铝箔上形成平均直径约170nm的无序纳米纤维薄膜，机械强度差，很脆易破。将制备好的电纺生物膜经UV照射15min除菌消毒。将灭菌后的生物膜置于在温敏培养皿表面已生长融合的脂肪干细胞片层上，降低培养表面的温度至25°C，30min后将整个细胞片层从边缘剥离，然后上下颠倒将附着在膜上的细胞片层置于另一温敏培养皿的细胞片层上，构建的细胞-膜-细胞多细胞片层在温敏培养表面生长5天后，降低培养表面的温度至25°C，30min后剥离整个三明治样多细胞片层。
[0029]实施例2:
[0030]取0.18g壳聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶剂，磁力搅拌过程中逐渐加入0.42g胶原，搅拌2h至完全溶解，得到15%的混合纺丝液4ml。将混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速度为0.5ml/h，选用8号不锈钢针头并与1kv高压相连，用已接地的铝箔在距针尖1cm处接收纤维丝。8小时后铝箔上形成平均直径约200nm的无序纳米纤维薄膜，机械强度差，很脆易破。将制备好的电纺生物膜经UV照射15min除菌消毒。将灭菌后的生物膜置于在温敏培养皿表面已生长融合的脂肪干细胞片层上，降低培养表面的温度至25°C，30min后将整个细胞片层从边缘剥离，然后上下颠倒将附着在膜上的细胞片层置于另一温敏培养皿的细胞片层上，构建的细胞-膜-细胞多细胞片层在温敏培养表面生长5天后，降低培养表面的温度至25°C，30min后剥离整个三明治样多细胞片层。
[0031]实施例3:
[0032]取0.3g壳聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶剂，磁力搅拌过程中逐渐加入0.3g胶原，搅拌3h至完全溶解，得到15%的混合纺丝液4ml。将混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速度为0.8ml/h,选用7号不锈钢针头并与I Ikv高压相连，用已接地的铝箔在距针尖12cm处接收纤维丝。5小时后铝箔上形成平均直径约300nm的无序纳米纤维薄膜。将制备好的电纺生物膜经UV照射15min除菌消毒。将灭菌后的生物膜置于在温敏培养皿表面已生长融合的脂肪干细胞片层上，降低培养表面的温度至22°C，20min后将整个细胞片层从边缘剥离，然后上下颠倒将附着在膜上的细胞片层置于另一温敏培养皿的细胞片层上，构建的细胞-膜-细胞多细胞片层在温敏培养表面生长4天后，降低培养表面的温度至22°C，20min后剥离整个三明治样多细胞片层。
[0033]实施例4:
[0034]取0.42g壳聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶剂，磁力搅拌过程中逐渐加入0.18g胶原，搅拌4h至完全溶解，得到15%的混合纺丝液4ml。将混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速度为lml/h，选用6号不锈钢针头并与12.5kv高压相连，用已接地的铝箔在距针尖14cm处接收纤维丝。4小时后铝箔上形成平均直径约450nm的无序纳米纤维薄膜。将制备好的电纺生物膜经UV照射15min除菌消毒。将灭菌后的生物膜置于在温敏培养皿表面已生长融合的脂肪干细胞片层上，降低培养表面的温度至20°C，1min后将整个细胞片层从边缘剥离，然后上下颠倒将附着在膜上的细胞片层置于另一温敏培养皿的细胞片层上，构建的细胞-膜-细胞多细胞片层在温敏培养表面生长3天后，降低培养表面的温度至20°C, 1min后剥离整个三明治样多细胞片层。
[0035]实施例5:
[0036]取0.48g壳聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶剂，磁力搅拌过程中逐渐加入0.12g胶原，搅拌5h至完全溶解，得到15%的混合纺丝液4ml。将混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速度为1.5ml/h，选用5号不锈钢针头并与14kv高压相连，用已接地的铝箔在距针尖15cm处接收纤维丝。2.5小时后铝箔上形成平均直径约700nm的无序纳米纤维薄膜。将制备好的电纺生物膜经UV照射15min除菌消毒。将灭菌后的生物膜置于在温敏培养皿表面已生长融合的脂肪干细胞片层上，降低培养表面的温度至20°C，1min后将整个细胞片层从边缘剥离，然后上下颠倒将附着在膜上的细胞片层置于另一温敏培养皿的细胞片层上，构建的细胞-膜-细胞多细胞片层在温敏培养表面生长3天后，降低培养表面的温度至20°C，1min后剥离整个三明治样多细胞片层。
[0037]本发明中，2，2，2-三氟乙醇能够使在常温中性条件下不溶于水的胶原和壳聚糖共溶于该溶剂。本发明制备的电纺生物膜不仅具有三维多孔结构，同时还具有大小形状可控的特点，孔隙率和纳米纤维的直径在一定范围内也能控制。人体组织大多数细胞外基质是由胶原、多聚糖和水等构成的网络，因此壳聚糖-胶原电纺生物膜具有细胞外基质高度仿生的性质。
[0038]本发明采用电纺生物膜作为支撑膜来构建多细胞片层。先在温敏培养表面接种脂肪干细胞贴壁生长，待脂肪干细胞在37°C生长至融合时，降温至20°C，培养表面由疏水性转变为亲水性，从而将贴壁的细胞连同细胞下层细胞外基质(ECM) —同释放出来。被完整保留的细胞下层ECM确保收获到的连续细胞层具有完整的细胞连接，以及细胞层与移植点之间的连接(无需纤维蛋白胶或缝合)。将脱离的单细胞片层由电纺生物膜作为载体，连同细胞片层一起转移到另一细胞片层上，构成细胞-膜-细胞的三明治样多细胞片层结构。
[0039]本发明利用壳聚糖-胶原电纺生物膜作为支撑膜，在转移单细胞片层的同时维持细胞片层的完整性，避免了现有的用塑料膜或PVDF膜转运中细胞片层的破碎。同时，壳聚糖-胶原电纺生物膜又提供给细胞一定的三维生长空间和营养物质在细胞片层间流通的通道，避免现有叠加的多细胞片层中间细胞坏死的现象。利用所制备的电纺生物膜作为支撑膜，增加了转移细胞片层的可操作性和简易性，提高了多细胞片层中间部分细胞存活率。该方法所构建的多细胞片层可用于同型或异型多细胞片层的移植，重构心肌、平滑肌、肝小叶等三维结构组织。
[0040]以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【权利要求】
1.一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 电纺液配制步骤，向三氟乙醇溶剂中加入壳聚糖和胶原，所述壳聚糖和胶原的质量比范围是1:4?4:1,搅拌得到电纺液； 静电纺丝步骤，将所述电纺液高压静电纺丝得到壳聚糖-胶原电纺生物膜； 细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤，将两个细胞片层分别附着在所述壳聚糖-胶原电纺生物膜两面生长，最终得到细胞-膜-细胞多细胞片层。
2.如权利要求1所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为蟹壳壳聚糖，其脱乙酰度为98% ;胶原为I型鼠尾胶原，分子量在1-30万之间。
3.如权利要求1或2所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖和胶原的质量比选自2:8、3:7、5:5、7:3和8:2。
4.如权利要求3所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖和胶原的质量比为7:3。
5.如权利要求3所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述电纺液的浓度为15%。
6.如权利要求1所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述搅拌的速度是500?lOOOrpm，所述搅拌的时间是2?5h。
7.如权利要求1所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝步骤中，通过高压静电纺丝装置进行高压静电纺丝，所述高压静电纺丝装置包括高压电源、喷射装置和接收装置，所述高压电源提供的电压是8?15kv，所述喷射装置所需针头型号为5?9号，所述针头与接收装置的距离为9?15cm，所述喷射装置送液速度为0.5?1.5ml/h。
8.如权利要求1所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，所述细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤中，将灭菌后的所述壳聚糖-胶原电纺生物膜置于在第一温敏培养皿表面已生长融合的第一细胞片层上；降低温敏培养表面的温度至20-25°C,10-30min后将所述第一细胞片层从边缘剥离；上下颠倒附着有所述第一细胞片层的壳聚糖-胶原电纺膜，并将其置于第二温敏培养皿的第二细胞片层上，形成的多细胞片层在温敏培养表面生长后，降低温敏培养表面的温度至20-25°C，10-30min后剥离得到所述细胞-膜-细胞多细胞片层。
9.如权利要求8所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，降低温敏培养表面的温度至20°C，1min后剥离细胞片层。
10.如权利要求8或9所述的一种三明治样多细胞片层的制备方法，其特征在于，形成的所述多细胞片层在温敏培养表面生长的时间为3天。
【文档编号】C12N5/0775GK104436299SQ201410632650
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】朱艳霞, 余小平 申请人:深圳市第二人民医院