玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法，特点LAMP的两对引物如下MCDV-F3、MCDV--B3、MCDV-FIP、MCDV-BIP，其RT-LAMP反应体系如下：2μLFIP溶液，2μLBIP溶液，0.25μLF3溶液，0.25μLB3溶液，12.5μL2×反应缓冲液，1μL Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶混合液，1μL钙黄绿素，2.5μLRNA模板，无RNA酶的水补至25μL，检测方法包括总RNA的提取；RT-LAMP引物的设计和合成；配制RT-LAMP反应体系；RT-LAMP目视检测，优点是灵敏度高，特异性强且简便快速。
【专利说明】玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试 剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及玉米褪绿矮缩病毒的检测技术，尤其是涉及玉米褪绿矮缩病毒的环介 导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 玉米裡绿矮缩病毒（Maize chlorotic dwarf virus，MCDV)属伴生病毒科水稻矮 化病毒属（Waikavirus)，主要寄主是玉米、高粱等禾本科植物，其引发的病害可导致玉米产 量下降、品质降低。1968年美国首次报道该病毒，该病毒主要分布于美国的墨西哥州、俄 亥俄州、印第安纳州及密苏里州等地区，在我国还未有发生的报道。该病毒不能种传，仅能 通过介体昆虫小禾叶蝉、索诺拉叶蝉传播，若虫和成虫带毒时间达48小时，由于在我国其 自然寄主有大量种植，近些年又从美国大量进口玉米，因此该病毒传入我国的可能性较大， 2007年该病毒被列为我国进境植物检疫性有害生物。目前，检测MCDV主要方法有：侵染力 测定法、血清学方法、电子显微镜计数等，这些方法的弊端在于耗时长，依赖昂贵的检测设 备。
[0003] 近年来开发的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和 一个具有链置换特性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)，在等温条件下高效扩增靶基因， 灵敏度和特异性高。该方法已广泛应用于病毒、类病毒、细菌、真菌及转基因的检测。而迄 今尚无应用该技术检测玉米褪绿矮缩病毒的报道。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高，特异性强且简便快速的玉米褪 绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组，LAMP的两对引物序列如 下： 外侧上游引物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ; 外侧下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ; 内侧上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
[0005] 2、一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒包括2X 反应缓冲液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均为20 μ mol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶 液，钙黄绿素荧光染料，所述的2X反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引 物溶液、所述的内侧下游引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、 所述的钙黄绿素荧光染料体积比为12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列为外侧上游引 物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ;外侧下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ;内 侧上游引物 MCDV-FIP : GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ;内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
[0006] 所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4)2 S04、0. 2% 的 Tween20、I. 6 M 的甜菜碱和每种 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ μ L。
[0007] 3、一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： (1) 总RNA的提取 将玉米待测样本使用RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取，具体操作见试剂 盒说明书； (2) RT-LAMP引物的设计和合成 从GenBank调出玉米褪绿矮缩病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40软件进行 比对分析，找出MCDV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExpIorer V4设计了特异性引物，其序列如下 ： 外侧上游引物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ; 外侧下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ; 内侧上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC ； (3) 配制RT-LAMP反应体系 浓度为20 ymol/L内侧上游引物溶液和内侧下游引物溶液各2 yL，浓度为20 μπιο?/ L外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液各0. 25 μ L，12. 5 μ L 2Χ反应缓冲液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液I. 0 μ L，钙黄绿素荧光染料I. 0 μ?， 样品总RNA2. 5 yL，无 RNase的水补至25 yL; (4) MCDV的RT-LAMP目视检测 将上述反应体系进行扩增反应，反应条件为：60°C 60 min，95°C 2 min;RT-LAMP扩增 结束后，在正常光照条件下，通过裸眼观察反应管中颜色的变化来准确判定结果，若扩增产 物呈黄绿色，则样品感染玉米褪绿矮缩病毒。
[0008] 所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、L 6 M 的甜菜碱和每种 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ μ L。
[0009] 原理说明：钙黄绿素是一种螯合剂，反应前与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态， LAMP扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿 色荧光，通过观察荧光的有无可判断是否有扩增。
[0010] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了玉米褪绿矮缩病毒的环 介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法，根据玉米褪绿矮缩病毒（MCDV)外壳蛋 白基因序列的保守区设计RT-LAMP特异性引物，该引物组具有特异性强，灵敏度高达200 fg，比普通RT-PCR高出10倍，而反应时间明显缩短，整个检测1小时内可完成，提高了扩增 效率，这与引物本身的质量(如长度、GC含量)、退火温度、反应体系中金属离子的浓度、酶的 活性等因素直接有关。通过在反应体系中预先加入螯合剂--I丐黄绿素，可实现肉眼观察 判定结果，整个检测过程不需要复杂仪器设备，只需维持恒温的水浴锅或金属浴就可完成， 克服了以往检测方法需要依赖昂贵仪器、检测周期长等不足，尤其适合设备资源配置简单 的口岸实验室开展现场快速筛查，具有较强的推广价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为RT-LAMP方法检测玉米褪绿矮缩病毒的反应时间与浊度的关系图； 图2为玉米褪绿矮缩病毒的RT-LAMP特异性试验结果； 图3为玉米褪绿矮缩病毒的RT-LAMP灵敏度试验结果； 图4为玉米褪绿矮缩病毒的RT-PCR相对灵敏度试验结果，注：M: DL2000 ; 1-6 : 2 ng,200 pg，20 pg，，2 pg，200 fg，20 fg 总 RNA;7:水。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0013] 具体实施例1 玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组，包括LAMP的两对引物序列： 外侧上游引物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ; 外侧下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ; 内侧上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
[0014] 具体实施例2 一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒包括2X反应缓 冲液（配方如下：40mM 的 ρΗ8·8 的 Tris-HCl、20mM 的 KCl、16mM 的 MgS04、20mM 的（NH4)2 S04、 0. 2%的Tween20、I. 6 M的甜菜碱和每种2. 8mM的dNTPs)，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录 聚合酶组成的聚合酶混合液(聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度 均为8 U/μ L)，浓度为20 μ mol/L的内侧上游引物溶液、浓度为20 μ mol/L的内侧下游 引物溶液、浓度为20 μ mol/L的外侧上游引物溶液和浓度为20 μ mol/L的外侧下游引物 溶液，钙黄绿素荧光染料，2X反应缓冲液、聚合酶混合液、内侧上游引物溶液、内侧下游引 物溶液、外侧上游引物溶液、外侧下游引物溶液、钙黄绿素荧光染料体积比为12. 5 :1 :2 :2 : 0. 25 :0. 25 :1，引物序列为外侧上游引物MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ;外侧下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGITTCC ;内侧上游引物 MCDV-FIP : GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGA CGGAACCCGCAGCGCC ;内侧下游引物 MCDV-BIP :GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACAC AAAC。
[0015] 具体实施例3 玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测方法的建立 1、实验材料 (1) 样品来源玉米褪绿矮缩病毒（Maize chlorotic dwarf virus,MCDV)阳性质控物 购自德国DSMZ公司，样品状态为新鲜叶片经液氮处理，磨成粉末状； (2) 分子生物学试剂 RNeasy Plant Mini Kit 购自 Qiagen 公司，TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)购自大连宝生物公司，钙黄绿素荧光染料、RNA Amplification Kit购 自EIKEN CHEMICAL CO.，LTD. ;RT-LAMP引物及RT-PCR引物由英潍捷基(上海）贸易有限 公司合成； (3) 主要仪器 LA-320C 实时池度仪（Loopamp? Realtime Turbidimeter LA-320C)。
[0016] 2、检测方法 (1) 总RNA的提取 分别对阳性质控样品进行植物总RNA提取，具体操作见试剂盒说明书。用核酸蛋白分 析仪测OD26tl及OD28tl，计算核酸的浓度和纯度； (2) RT-LAMP引物的设计和合成 从GenBank调出玉米褪绿矮缩病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40软件进行 比对分析，找出MCDV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExpIorer V4设计了特异性引物。如表1所示， 表1玉米褪绿矮缩病毒RT-LAMP检测引物
【权利要求】
1. 一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于LAMP的两对引 物序列如下： 外侧上游引物 MCDV-F3 :CCCGITCTAITGCAGTCAA; 外侧下游引物 MCDV-B3 :GTITCTCCTGTCAATGITTCC ; 内侧上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
2. -种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒 包括2 X反应缓冲液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度 均为20 ymol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游 引物溶液，钙黄绿素荧光染料，所述的2X反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧 上游引物溶液、所述的内侧下游引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物 溶液、所述的钙黄绿素荧光染料体积比为12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列为外侧上 游引物 MCDV-F3 :CCCGITCTAITGCAGTCAA ;外侧下游引物 MCDV-B3 :GTITCTCCTGTCAATGITTCC ; 内侧上游引物 MCDV-FIP : GGITCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ;内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
3. 根据权利要求2所述的一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其 特征在于所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、1. 6 M 的甜菜碱和每种 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ y L。
4. 一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 总RNA的提取 将玉米待测样本使用RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取； (2) RT-LAMP引物的设计和合成 从GenBank调出玉米褪绿矮缩病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40软件进行 比对分析，找出MCDV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计了特异性引物，其序列如下： 外侧上游引物 MCDV-F3 :CCCGITCTAITGCAGTCAA ; 外侧下游引物 MCDV-B3 :GTITCTCCTGTCAATGITTCC ; 内侧上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 内侧下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC ； (3) 配制RT-LAMP反应体系 浓度为20 iimol/L内侧上游引物溶液和内侧下游引物溶液各2 iiL，浓度为20 iimol/ L外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液各0. 25 y L，12. 5 y L 2X反应缓冲液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液1. 0 y L，钙黄绿素荧光染料1. 0 ML， 样品总RNA2. 5 iiL，无RNase的水补至25 iiL; (4) MCDV的RT-LAMP目视检测 将上述反应体系进行扩增反应，反应条件为：60°C 60 min，95°C 2 min;RT-LAMP扩增 结束后，在正常光照条件下，通过裸眼观察反应管中颜色的变化来准确判定结果，若扩增产 物呈黄绿色，则样品感染玉米褪绿矮缩病毒。
5.根据权利要求4所述的一种玉米褪绿矮缩病毒的环介导等温扩增检测方法，其特征 在于所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgS04、 20mM的（NH4) 2 S04、0. 2%的Tween20、1. 6 M的甜菜碱和每种2. 8mM的dNTPs，所述的聚合酶 混合液中DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ y L。
【文档编号】C12Q1/68GK104372109SQ201410632416
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】徐颖, 刘永丰, 蔡曹盛, 黄世杰, 郑炜, 徐亚飞 申请人:中华人民共和国北仑出入境检验检疫局