水稻耐旱基因GTγ-2的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻耐旱基因GTγ-2，属植物基因工程【技术领域】；其特征在于GTγ-2基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示；GTγ-2基因的编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；该基因属于GT转录因子超基因家族γ亚族；含有1个SANT domain；受ABA和干旱诱导表达；该基因在水稻叶片中表达量较高，在根、茎组织表达量低；ubi启动子驱动GTγ-2基因的转基因水稻，其耐旱能力显著增强；该基因来源于水稻，转该基因的水稻，降低了食品安全忧患；该基因对水稻和其他植物的耐旱性遗传改良，具有很好的应用前景。
【专利说明】水稻耐旱基因GTy-2
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及水稻耐旱基因GTy-2,属植物基因工程【技术领域】。
【背景技术】：
[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界约有50%的人口以其为主食。环境的 不断恶化，引起了全球水资源的严重匮乏与分布不平衡，全球气温的升高，降雨量的减少与 分布不均，导致了频繁的干旱发生。据统计，全球每年有1900-2300万公顷的水稻遭遇干 旱。而在我国，过去60年，有37%的地区变得更加干旱。干旱是水稻生产的主要限制因子 之一；因此，发掘耐旱基因，并应用于水稻的遗传改良，以期提高水稻的抗旱性，是保证水稻 高产、稳产的有效途径之一。
[0003] GT Y _2基因是一个水稻耐旱基因，在转GT Y _2基因的水稻，其耐旱性得到很大的 提高，干旱处理10天成活率在80%以上，而对照全部死亡。该基因应用于水稻的遗传改良， 将会极大地提高水稻的耐旱性。然而，目前该基因的耐旱性功能，尚未见报道。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于提供水稻耐旱GT Y -2基因，并提供GT Y -2基因在水稻耐旱性 遗传改良中的应用。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] 1、水稻GT Y -2基因的获得
[0007] GT转录因子家族有GTa、GTP、GTy三个亚族，前人的研究表明，GTy亚族的 基因，参与植物的非生物胁迫（耐旱、耐盐等）。水稻GTy亚族共有4个基因，分别为 0s02g33770、0sl2g06640、0sllg06410 和 0s01g21590。4 周大小的水稻 Nipponbare，分别 进行了 〇、3、5天的干旱处理。提取各处理的叶片总RNA，并反转录合成cDNA第一链。根据 上述4个基因的cDNA序列，合成引物，使用Real-time PCR检测上述4个基因在各处理的 表达。结果发现，0sl2g06640在干旱处理下表达量大幅提高，说明该基因受干旱胁迫诱导 表达，可能参与干旱胁迫响应，故我们将该基因命名为GTy-2。使用ABA处理Nipponbare 1周大小的幼苗，结果发现GT Y _2基因受ABA诱导提高表达。ABA是植物干旱胁迫响应的 重要信号途径，GT Y _2基因既受干旱诱导表达，同时又受ABA诱导。根据以上结果，我们将 GT Y _2基因作为水稻耐旱性候选基因。
[0008] 2、水稻Nipponbare叶片总RNA的提取
[0009] 取水稻叶片0. lg于液氮中研磨，转入2. 0ml离心管中。加1. 0ml Trizol提取液，涡 旋振荡15-20秒。4°C 12000rpm 5分钟。取上清于另一无RNase2. 0ml离心管，加入200iil 氯仿：异醇（24:1)，涡旋振荡15-20秒。4°C 12000rpm 5分钟。将上清转至另一无RNase 2. 0ml离心管中。加2/3体积异丙醇，混匀，12000rpm 10分钟。去上清，加入lml 70%乙 醇，12000印1115分钟。去70%乙醇，加入50111无1?似86(1(11120，溶解沉淀的1?隱。测定所 提取的RNA含量，保存于-80°C冰箱。
[0010] 3、cDNA第一链的合成
[0011] cDNA 合成反应体系如下：10 X 反转录酶 buffer 2 ii 1，10mM dNTPs 1 ii 1，Random primers 2 y 1，RNase 抑制剂 0? 1 y 1，反转录酶 0? 5 y 1，RNA 5 y g,加无 RNase ddH20 至总 体积20 ill。反应程序如下：25°C 10分钟，37°C 2小时，85°C 5分钟，4°C保存。cDNA第一 链合成后，用ddH20稀释5倍，于-20°C冰箱保存。
[0012] 4、GTy_2基因的克隆
[0013] 使用 RT-PCR 技术，克隆GTy-2 基因。RT-PCR 反应体系：10Xbuffer 2iil，10mM dNTPs 1u 1, lOmM left primer 1u 1, lOmM right primer 1u 1, phusion DNA polymerase 0. 2u 1, cDNA template 1 u 1, ddH20 13. 8 u l〇 left primer:5, CACCATGTCTATCCTCCTTTGG CTATCCC3'，right primer:5' TCATGGATGATTAGCATTGCCCTTT 3'。反应程序：95°C 3 分钟； 95°C 40秒，55°C 1分钟，72°C 1分钟，35循环；72°C 5分钟；4°C保存。RT-PCR产物于1 %琼 脂糖凝胶电泳、检测，并切割目标条带，使用凝胶回收试剂盒回收。
[0014] 5、转化载体的构建
[0015] 将上述的回收产物，使用pENT-D试剂盒，将回收的条带克隆到pENT-D载体中。反 应体系：PCR 产物 4. 5 ii 1 (40-50ng)，diluted salt 1 y 1，pENT-DO. 5 y 1。反应产物混匀、 离心，25°C放置lh。然后用电击法转化DH10B大肠杆菌感受态细胞。转化后的大肠杆菌于 37°C培养1小时，然后均匀涂抹于100mg/L km LB平板，37°C培养20小时。挑选单克隆，检 测、测序，获得阳性克隆。选取阳性克隆，提取质粒DNA，并与pCAMBIAubil300载体进行重 组，将GT Y -2基因重组到pCAMBIAubil300载体中。重组反应体系：pENT-D-GT Y -22 iil，p CAMBIAubil3002iil，Clonsell 1 iil，25°C 1小时。然后将重组产物，电击法转化大肠杆菌 DH10B感受态细胞，然后均匀涂抹于100mg/L Amp LB平板，37°C培养20小时。然后挑选单 克隆，提取质粒DNA，用NotI、AscI双酶切检测，选阳性克隆用于水稻的转基因。
[0016] 对所克隆的GTy-2基因进行DNA测序，其GTy-2基因的DNA序列如SEQ ID N0:1 所不；GTy-2基因的编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所不。
[0017] 6、转GTy-2基因水稻植株的获得
[0018] 将pCAMBIAubil300-GTy-2载体导入农杆菌菌株中，侵染水稻自交系Kittaka的 成熟胚愈伤组织，通过共培养、恢复培养和筛选培养（筛选培养基中潮霉素浓度为l〇mg/ L)，得到抗性愈伤组织。然后经过分化、生根等培养，得到再生植株。再生植株移栽于营养 钵中，种植于温室。取成活植株的叶片，提取DNA，使用PCR技术对再生植株进行检测，得到 阳性转GTy-2基因植株。
[0019] 7、转基因植株耐旱性试验
[0020] 转GT Y -2水稻种植于营养钵，每钵种植6植株，重复3次，以自交系Kittaka作为 对照，于温室分别正常生长至4周。然后，4周大小的植株，分别进行干旱处理。干旱8d天， 观察表型，结果发现转GT Y _2的水稻叶片仍然呈绿色，而对照Kittaka叶片已经枯萎。结果 表明，GT Y _2基因的过表达，可以显著提高水稻的耐旱能力。经过3次重复实验，转GT Y _2 基因的水稻均表现出很强的耐旱性。因此，实验结果证明GT Y _2基因可以显著提高水稻的 耐旱能力，是提高水稻耐旱性的新基因。
[0021] 本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
[0022] l、ubi启动子驱动GTY _2基因，过表达的转基因株系显著提高了水稻的耐旱性， 耐旱效果明显，在干旱地区或干旱的环境中，该基因可以明显提高水稻的耐旱性，保证水稻 的高产、稳产。
[0023] 2、该基因来源于水稻，因此转GT Y _2基因的水稻减少了对食品安全性的担忧。
[0024] 3、对该基因的深入研究，可以揭示水稻耐旱性形成的分子机制，也为水稻和其他 植物的耐旱性遗传改良提供了新的基因资源。
【具体实施方式】：
[0025] 把GTy-2基因克隆到pCAMBIAubi 1300转化载体上，导入农杆菌中。然后通过 农杆菌法介导法将该基因转化到水稻受体细胞中，通过组织培养等技术手段获得转基因植 株。在干旱条件下，GTy-2基因可以明显提高水稻的耐旱能力，保证了水稻的高产、稳产。
[0026]
【权利要求】
1.水稻耐旱基因 GTy-2,其特征在于GTy-2基因的DNA序列如SEQ ID N0:1所示； GTy-2基因的编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所不。
【文档编号】C12N15/29GK104450737SQ201410665156
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】杜何为, 黄敏 申请人:长江大学