一种小反刍兽疫转基因植物疫苗高效表达载体的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种基因工程【技术领域】中的重组载体构建，特别涉及一种重组的用于预防小反刍兽疫的植物高效表达载体的构建。本发明所述的表达载体，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因以及和该基因连接的重组质粒，共计五种，分别为：pBI121-F，121-C-F-M12-M34，121-C-FKDEL-M12-M34，121-C-G-F-M12-M34，121-C-G-FKDEL-M12-M34，其基因序列见序列表。
【专利说明】一种小反刍兽疫转基因植物疫苗高效表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因工程【技术领域】中的重组载体构建，特别涉及一种重组的用于 预防小反刍兽疫的植物高效表达载体的构建。
【背景技术】
[0002] 小反当兽疫（Peste des petits r μ minants，PPR)是一种由小反当兽疫病毒 (Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起的急性、接触性疫病，主要感染以山羊 和绵羊等小反刍动物。该疫病的发病率和死亡率可高达100%和50%。对于该疫病目前尚 无有效的治疗方法，因此要寻找有效的预防方法对该疫病进行预防。随着生物技术和基因 工程技术的发展，对PPRV的研究也更为深入。PPRV基因组为单股负链RNA，从RNA链的3' 端至5'端依次排列着N-P-M-F-H-L 6个基因，分别编码相应的6种结构蛋白。其中，F蛋 白是组成病毒囊膜表面的一种纤突，属于融合蛋白，在病毒诱导的细胞病理学方面发挥着 重要作用，是决定病毒感染成功与否的关键因素。Devireddy等发现纯PPRV的F蛋白具有 生物学活性并且容易引起病毒引导性溶血，细胞融合和开始感染，具有免疫原性，这是本发 明采用F蛋白基因作为目的基因的重要依据。
[0003] 转基因植物可食疫苗利用分子生物学技术，将病原微生物的抗原编码基因转入植 物，并在植物中表达出活性蛋白，人或动物食用含有该种抗原的转基因植物，会激发肠道免 疫系统，从而产生对病毒、寄生虫等病原菌的免疫能力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于：通过基因重组的方法将将F基因与植物表达载体PBI121连 接，并且在其两侧加入调控序列使其能在植物中高效的表达。最终实现预防小反刍兽疫的 目的。
[0005] 本发明提供一种植物表达载体，其特征在于，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因 以及和该基因连接的重组质粒，共计五种，分别为：
[0006] pBI121-F,
[0007] 121-C-F-M12-M34
[0008] 121-C-FKDEL-M12-M34
[0009] 121-C-G-F-M12-M34
[0010] I2I-C-G-FKDEL-Ml2-M34
[0011] 其基因序列见序列表。
[0012] 其中的F蛋白基因见序列表1。
[0013] 本发明通过对PBI121植物表达载体的Hind III酶切位点到EcoR I酶切位点处进 行改造得到的，改造所需的基因或调控序列包括GFP、MAR12、MAR34、CsVMV、F、FKDEL，其对 应的基因序列见序列表2-7。
[0014] 本发明添加相关基因及序列后共改造4条载体，其添加的基因和调控序列依次排 列顺序为：
[0015] MAR12-CsVMV-GFP-F-MAR34 ；
[0016] MAR12-CsVMV-GFP-FKDEL-MAR34 ；
[0017] MAR12-CsVMV-F-MAR34 ；
[0018] MAR12-CsVMV-FKDEL-MAR34〇
[0019] 本发明还提供本发明的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下：
[0020] 步骤1，用引物提取相关质粒并进行PCR扩增，
[0021] 步骤2,对PCR产物使用T/A克隆的方法连接到pUCM-T载体上，
[0022] 步骤3,植物表达载体的构建。
[0023] 优选的，所述方法，步骤如下：
[0024] 步骤1、基因扩增，
[0025] MAR序列：以pMD-MAR质粒为模板，分别使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、 MAR34-R进行克隆；
[0026] GFP序列：以pHL005为模板，以GFP-F、GFP-R为模板；
[0027] PPRV-F、F-KDEL 序列：以 PPRV-F 为模板，分别以 PPRV-F-F、PPRV-F-R和 PPRV-F-F、 PPRV-FKDEL-R 为模板；
[0028] CsVMV序列：以合成的CsVMV为模板，以CsVMV-F、CsVMV-R为模板；
[0029] 步骤2,将步骤1所得基因连接到pUCM-T载体上，所得质粒命名为：pGFP、pMAR12、 pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL。
[0030] 步骤3,植物表达载体的构建：
[0031] 1)、表达载体pBI121-CsVMV的构建
[0032] 2)、表达载体 pBI 12I-CsVMV-GFP 的构建
[0033] 3)、表达载体 pBI 121-CsVMV-GFP-Mar 12 的构建
[0034] 4)、中间表达载体pUCM-GUS-GFP的构建
[0035] 5)、中间表达载体的pUCM-GUS-GFP-MAR34的构建
[0036] 6)、中间表达载体 pUCM-F-GFP-MAR34 和 pUCM-FKDEL-GFP-MAR34 的构建
[0037] 7)、植物表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和 pBim-CsVMV-GFP-F-KD EL-MAR12-MAR34 构建
[0038] 8)、植物表达载体 pBI 121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和 pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建
[0039] 9)、植物表达载体pBI 121-F的构建
[0040] 向载体上连接上一个组件后就使用PCR验证的方法进行验证，验证所使用的引物 一条PBI121载体上的一段序列一条为所连入的组件上的一段序列。
[0041] 更优选的，所述方法，步骤如下：
[0042] 步骤1，基因扩增：
[0043] MAR序列：以pMD-MAR质粒为模板，分别使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、 MAR34-R进行克隆；PCR扩增条件：94°C预变性5min，94°C变性60s，55°C退火60s，72°C延伸 60s，35个循环后，72°C延伸5min，反应产物4°C保存。
[0044] GFP序列：以pHL005为模板，以GFP-F、GFP-R为模板；PCR扩增条件：94°C预变性 411^11，941：变性3〇8,581：退火458,721：延伸458,30个循环后，721：延伸71^11，反应产物 4°C保存。
[0045] PPRV-F、F-KDEL 序列：以 PPRV-F 为模板，分别以 PPRV-F-F、PPRV-F-R 和 PPRV-F-F、 PPRV-FKDEL-R 为模板；PCR 扩增条件：94°C预变性 2min，94°C变性 45s，55°C退火 40s，72°C 延伸90s，35个循环后，72°C延伸lOmin，反应产物4°C保存。
[0046] CsVMV序列：以合成的CsVMV为模板，以CsVMV-F、CsVMV-R为模板；PCR扩增条 件：94°C预变性4min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸40s，35个循环后，72°C延伸 lOmin，反应产物4°C保存。
[0047] 步骤2,步骤1所得序列连接到pUCM-T载体上，
[0048] 提取质粒命名为：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL。
[0049] 步骤3,植物表达载体的构建：
[0050] 1)、表达载体pBI 121-CsVMV的构建
[0051] 将表达载体pBI121上的启动子CaMV35S，替换成克隆载体pCsVMV上的CsVMV，来 提高载体在植物中的表达效率。
[0052] 2)、表达载体 pBI 12I-CsVMV-GFP 的构建
[0053] 3)、表达载体 pBI 121-CsVMV-GFP-Mar 12 的构建
[0054] 用 HindIII 分别单酶切质粒 pBim-CsVMV-GFP 和 pMAR12
[0055] 4)、中间表达载体pUCM-GUS-GFP的构建
[0056] 5)、中间表达载体的pUCM-GUS-GFP-MAR34的构建
[0057] 6)、中间表达载体 pUCM-F-GFP-MAR34 和 pUCM-FKDEL-GFP-MAR34 的构建
[0058] 7)、植物表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和 pBim-CsVMV-GFP-F-KD EL-MAR12-MAR34 构建
[0059] 8)、植物表达载体 pBI 121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和 pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建
[0060] 9)、植物表达载体pBI 121-F的构建
[0061] 最优选的，本发明的植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建，步骤如下：
[0062] (1)酶切：
[0063] 用 XbaI 和 EcoRI 分别双酶切质粒 pBI121-CsVMV-GFP_MAR12 和 PBI121-GFP-F-MAR34 和 pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34
[0064] 酶切体系：10yL 质粒，2.5yL10XM buffer，两种酶各 lyL，10.5yL ddH20,总反 应体积为25 μ L。37°C酶切2. 5h。
[0065] (2)琼脂糖凝胶电泳分别回收两片段pBI121-CsVMV-GFP-MAR12、 PBI121-GFP-F-MAR34 和 pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34 分别记为片段 A、B 和 C。
[0066] (3)连接：
[0067] 连接体系：4yL片段 A，4yL片段 B 或 C，lyL 10XT4DNA ligase buffer，lyL T4DNA连接酶。总反应体系为10yL，16°C连接过夜。
[0068] (4)转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证。
[0069] 最优选的，本发明的植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34和 pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建，步骤如下：
[0070] (1)酶切：
[0071] 用 BamHI 和 EcoRI 分别双酶切质粒 pBI121-CsVMV-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34 和 pBII2I-GFP-F-KDEL-MAR34
[0072] 酶切体系：1(^1^质粒，2.54 1^1父1(131^€61'，两种酶各14 1^10.54 1^(1(1!120，总反 应体积为25 μ L。37°C酶切3h。
[0073] (2)琼脂糖凝胶电泳分别回收两片段 pBI121-CsVMV-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34 和 PBI121-GFP-F-KDEL-MAR34 分别记为片段 A、B 和 C。
[0074] ⑶连接：
[0075] 连接体系：4 μ L片段 A，4 μ L片段 B 或 C，IyL IOX T4DNA ligase buffer，IyL T4DNA连接酶。总反应体系为10yL，16°C连接过夜。
[0076] (4)转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证。
[0077] 最优选的，本发明的植物表达载体PBI121-F的构建，步骤如下：
[0078] (1)酶切：
[0079] 酶SmaI和SacI双酶切pBI 121质粒
[0080] 酶切体系如下：10μ L 质粒，2· 5μ LlOXT buffer，2. 5μ L 1 % BSA，两种酶各 1 μ L，8 μ L CldH2O，总反应体积为 25 μ L。30。。酶切 3h。
[0081] 酶PvuII和BstxI分步双酶切pF
[0082] 酶切体系如下：10μ L 质粒，2· 5μ LlOXM buffer，PvuII 1 μ L，11. 5μ L ddH20,总 反应体积为25yL。37°C酶切4h。酶切完成后进行乙醇回收沉淀DNA，进行下一步酶切。
[0083] 酶切体系如下：10yL 乙醇回收 DNA，2.5yL10XH buffer，BstxI lyL，11.5yL ddH20,总反应体积为25 μ L。45°C酶切4h。
[0084] (2)将pBI121和pF的酶切产物琼脂糖凝胶电泳，分别回收两DNA片段，标记为片 段 A、B。
[0085] (3)连接
[0086] 连接体系：2.5yL片段A，5yL 片段 B，2.5yL 10XT4DNA ligase buffer，lyL T4 DNA ligase，14yL ddH20。总反应体系为 25yL，16°C连接过夜。
[0087] (4)转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR正反向验证，引物分别为 MAR12-PCR-IN的上游和F的下游，F的上游和MAR34-PCR-IN的下游。提取质粒酶切验证。
[0088] 为制备本发明的载体，需要用到以下元件进行PCR扩增：
[0089] PPRV-F :即F蛋白基因，由中国动物卫生与流行病学中心提供；
[0090]启动子CsVMV :由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
[0091] PHL005 :由中国科学院青岛生物能源与过程研究所提供；
[0092] pMD-MAR质粒为青岛农业大学遗传实验室保存。
[0093] 发明中PCR所用引物见下表：
[0094] 表1发明中PCR所用引物
[0095]
【权利要求】
1. 一种植物表达载体，其特征在于，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因以及和该基因 连接的重组质粒，共计五种，分别为： PBI121-F, 121-C-F-M12-M34 121-C-FKDEL-M12-M34 121-C-G-F-M12-M34 121-C-G-FKDEL-M12-M34 其基因序列见序列表。
2. 根据权利要求1所述的植物表达载体，其中的F蛋白基因见序列表1。
3. 根据权利要求1所述的植物表达载体，通过对pBI 121植物表达载体的Hind III酶切 位点到EcoR I酶切位点处进行改造得到的，改造所需的基因或调控序列包括GFP、MAR12、 MAR34、CsVMV、F、FKDEL，其对应的基因序列见序列表。
4. 根据权利要求3所述的植物表达载体，其中，添加相关基因及序列后共改造4条载 体，其添加的基因和调控序列依次排列顺序为： MAR12-CsVMV-GFP-F-MAR34 ； MAR12-CsVMV-GFP-FKDEL-MAR34 ； MAR12-CsVMV-F-MAR34 ； MAR12-CsVMV-FKDEL-MAR34〇
5. 权利要求1所述的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下： 步骤1，用引物提取相关质粒并进行PCR扩增， 步骤2,对PCR产物使用T/A克隆的方法连接到pUCM-T载体上， 步骤3,植物表达载体的构建。
6. 权利要求5所述的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下： 步骤1、基因扩增， MAR序列：以pMD-MAR质粒为模板，分别使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、 MAR34-R进行克隆； GFP序列：以pHL005为模板，以GFP-F、GFP-R为模板； PPRV-F、F-KDEL 序列：以 PPRV-F 为模板，分别以 PPRV-F-F、PPRV-F-R 和 PPRV-F-F、 PPRV-FKDEL-R 为模板； CsVMV序列：以合成的CsVMV为模板，以CsVMV-F、CsVMV-R为模板； 步骤2,将步骤1所得基因连接到pUCM-T载体上， 所得质粒命名为：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL， 步骤3,植物表达载体的构建： 1) 、表达载体pBI121-CsVMV的构建 2) 、表达载体pBI121-CsVMV-GFP的构建 3) 、表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-Marl2 的构建 4) 、中间表达载体pUCM-GUS-GFP的构建 5) 、中间表达载体的PUCM-GUS-GFP-MAR34的构建 6) 、中间表达载体 PUCM-F-GFP-MAR34 和 pUCM-FKDEL-GFP-MAR34 的构建 7) 、植物表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和 pBI 121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建 8) 、植物表达载体 pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和 pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建 9) 、植物表达载体PBI121-F的构建 向载体上连接上一个组件后就使用PCR验证的方法进行验证，验证所使用的引物一条 PBI121载体上的一段序列一条为所连入的组件上的一段序列。
7. 权利要求6所述的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下： 步骤1，基因扩增： MAR序列：以pMD-MAR质粒为模板，分别使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、 MAR34-R进行克隆；PCR扩增条件：94°C预变性5min，94°C变性60s，55°C退火60s，72°C延伸 60s，35个循环后，72°C延伸5min，反应产物4°C保存， GFP序列：以pHL005为模板，以GFP-F、GFP-R为模板；PCR扩增条件：94°C预变性4min， 94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸45s，30个循环后，72°C延伸7min，反应产物4°C保 存， PPRV-F、F-KDEL 序列：以 PPRV-F 为模板，分别以 PPRV-F-F、PPRV-F-R 和 PPRV-F-F、 PPRV-FKDEL-R 为模板；PCR 扩增条件：94°C预变性 2min，94°C变性 45s，55°C退火 40s，72°C 延伸90s，35个循环后，72°C延伸lOmin，反应产物4°C保存， CsVMV序列：以合成的CsVMV为模板，以CsVMV-F、CsVMV-R为模板；PCR扩增条件：94°C 预变性4min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸40s，35个循环后，72°C延伸lOmin，反 应产物4°C保存， 步骤2,步骤1所得序列连接到pUCM-T载体上， 提取质粒命名为：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL， 步骤3,植物表达载体的构建： 1) 、表达载体pBI121-CsVMV的构建 将表达载体PBI121上的启动子CaMV35S，替换成克隆载体pCsVMV上的CsVMV，来提高 载体在植物中的表达效率， 2) 、表达载体pBI121-CsVMV-GFP的构建 3) 、表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-Marl2 的构建 用 Hindlll 分别单酶切质粒 pBI121-CsVMV-GFP 和 pMAR12 4) 、中间表达载体pUCM-GUS-GFP的构建 5) 、中间表达载体的PUCM-GUS-GFP-MAR34的构建 6) 、中间表达载体 PUCM-F-GFP-MAR34 和 pUCM-FKDEL-GFP-MAR34 的构建 7) 、植物表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和 pBI 121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建 8) 、植物表达载体 pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和 pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建 9) 、植物表达载体PBI121-F的构建。
8. 权利要求7所述的植物表达载体的制备方法，其特征在于，植物表达载体 pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34 和 pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建，步骤如下： (1)酶切： 用 Xbal 和 EcoRI 分别双酶切质粒 pBI121-CsVMV-GFP-MAR12 和 PBI121-GFP-F-MAR34 和 pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34 酶切体系：1〇1^质粒，2.511110\]\1131^€61'，两种酶各1111，10.5111(1(11120，总反应体 积为 25ii L，37°C酶切 2. 5h， ⑵琼脂糖凝胶电泳分别回收两片段pBI121-CsVMV-GFP-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34 和 PBI121-GFP-F-KDEL-MAR34 分别记为片段 A、B 和 C， (3) 连接： 连接体系：4iiL 片段 A，4iiL 片段 B 或 C，liiL 10XT4DNA ligase buffer，liiL T4DNA 连接酶，总反应体系为10 U L，16°C连接过夜。 (4) 转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证。
9. 权利要求7所述的植物表达载体的制备方法，其特征在于，植物表达载体 pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34 和 pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34 构建，步骤如下： (1) 酶切： 用 BamHI 和 EcoRI 分别双酶切质粒 pBI121-CsVMV-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34 和 pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34 酶切体系：1〇1^质粒，2.51111\1(131^€61'，两种酶各1111，10.5111(1(11120，总反应体 积为 25ii L，37°C酶切 3h， (2) 琼脂糖凝胶电泳分别回收两片段pBI121-CsVMV-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34和 PBI121-GFP-F-KDEL-MAR34 分别记为片段 A、B 和 C， (3) 连接： 连接体系：4iiL 片段 A，4iiL 片段 B 或 C，liiL 10XT4DNA ligase buffer，liiL T4DNA 连接酶，总反应体系为10 U L，16°C连接过夜， (4) 转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证。
10. 权利要求7所述的植物表达载体的制备方法，其特征在于，植物表达载体pBI121-F 的构建，步骤如下： (1) 酶切： 酶Smal和SacI双酶切pBI121质粒 酶切体系如下：l〇uL质粒，2.5 iiLlOXT buffer，2.5 iiL 1%BSA，两种酶各 liiL， 8 ii L ddH20，总反应体积为25 ii L，30°C酶切3h， 酶PvuII和Bstxl分步双酶切pF 酶切体系如下：l〇 UL质粒，2.5 iiLlOXM buffer，PvuII liiL，11.5 iiL ddH20,总反应 体积为25y L，37°C酶切4h，酶切完成后进行乙醇回收沉淀DNA，进行下一步酶切， 酶切体系如下：l〇uL 乙醇回收DNA，2.5iiL10XH buffer，Bstxl liiL，11.5iiL ddH20,总反应体积为25 ii L，45°C酶切4h， (2) 将pBI121和pF的酶切产物琼脂糖凝胶电泳，分别回收两DNA片段，标记为片段A、 B, (3) 连接 连接体系：2.5111片段4,51^片段8,2.511110\140嫩11§386 131^€61'，1111140嫩 ligase，14 ii L ddH20,总反应体系为25 ii L，16°C连接过夜， (4) 转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR正反向验证，引物分别为MAR12-PCR-IN 的上游和F的下游，F的上游和MAR34-PCR-IN的下游，提取质粒酶切验证。
【文档编号】C12N15/82GK104498527SQ201410669120
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】杨国锋, 苏昆龙, 宋智斌, 王薇, 王惠, 孙娟, 武海杰, 谭子恒, 李永臻, 王芳 申请人:青岛农业大学