一种提高异亮氨酸产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高异亮氨酸产量的方法，本发明通过紫外诱变育种选育出一株甲硫氨酸与赖氨酸双重缺陷型异亮氨酸产生菌菌株 B.flavum KM1，该菌株的出发菌株为 B.flavum i10505（Met-+Ethr+α-ABr+AECr）；通过在异亮氨酸产生菌 B.flavum KM1的种子培养基中和发酵培养基中添加VB12，提高了种子活力，缩短了发酵周期，从而提高了L-异亮氨酸产量。
【专利说明】一种提高异亮氨酸产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及L-异亮氨酸产生菌的发酵过程控制，应用于发酵法生产L-异亮氨酸。
【背景技术】
[0002]异亮氨酸又称“异白氨酸”，系统命名为“ α -氨基甲基戊酸”，疏水性支链氨基酸。因在α位和β位具有两个不对称碳原子，因而存在D、L、D别、L别四种旋光异构体，自然界中存在的仅为L-异亮氨酸，其余三种均无营养价值。L-异亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。具有促进体内蛋白质、酶和肽类激素合成的功能，在肌肉蛋白质代谢中极为重要，主要用于治疗神经障碍、食欲减退和贫血，有增强身体免疫力的功能。由于存在四种旋光异构体，因此很难采用化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，廉价制造纯度高的L-异亮氨酸，只有采用发酵法。
[0003]L-异亮氨酸工业化生产的关键是发酵，发酵水平的高低是决定产品成本的主要因素。提高L-异亮氨酸的产量，不仅要一株适合工业化生产的优良高产菌株，而且需要与该菌株相匹配的最佳发酵工艺条件和控制手段。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是要解决L-异亮氨酸工业化生产中，发酵水平的低、生产成本高的问题，而提供一种提高异亮氨酸产量的方法，本发明通过紫外诱变育种选育出一株异亮氨酸产生菌汉/7ara?KMl,通过添加VB12对L-异亮氨酸产生菌黄色短杆菌RrevibacteriumfIavunMiX (Met>Lys> Ethr+ a -AB1^AEClr)的种子培养条件和发酵过程进行优化,从而进一步提高L-异亮氨酸的产量。
[0005]VB12即钴胺素，分子中含钴和咕啉，咕啉第六个配位可结合其他基团，产生各种钴胺素，包括与氢结合的氢钴胺素、与甲基结合的甲基钴胺素、与5’-脱氧腺苷结合的辅酶B12等。甲基钴胺素可作为甲基载体，接受甲基四氢叶酸提供的甲基，用于合成甲硫氨酸。一些依赖辅酶B12的酶类催化1，2迁移分子重排反应，即相邻碳原子上氢原子与某一基团的易位反应。例如在丙酸代谢中，催化甲基丙二酰辅酶A转变为琥珀酰辅酶A的变位酶就以辅酶B12为辅助因子。此外，VB12还参与脱氧核酸(DNA)的合成，碳水化合物及蛋白质的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。
[0006]本发明之方法是:
通过紫外诱变育种选育出一株L-异亮氨酸产生菌汉/7an?KMl，该菌株的出发菌株为黄色短杆菌汉 flavum i 10505 (Met_+Ethr+ a -ABr+AECr )。
[0007]通过添加VB12对KMl菌株的种子培养条件和发酵过程进行优化。
[0008]所述黄色短杆菌汉10505菌株来源于吉林大学生物与农业工程学院发酵工程实验室。
[0009]所述的L-异亮氨酸产生菌汉/7an?KMl，应用于发酵法生产L-异亮氨酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是诱变选育出的产酸较优的L-异亮氨酸产生菌，其中il0505是出发菌株； 图2是KMl菌株的生长曲线，添加VB12与无添加VB12的对比；
图3是种子培养基中VB12添加量对汉fIavummi菌株产酸的影响曲线图。
[0011]图4是发酵培养基中VB12添加量对汉fIavummi菌株产酸的影响曲线图。
【具体实施方式】
[0012]本发明通过紫外诱变育种选育出一株甲硫氨酸与赖氨酸双重缺陷型异亮氨酸产生菌菌株汉fIavummi，该菌株的出发菌株为汉flavum i 10505 (Met>Ethr+ a -ABr+AECr )。
[0013]通过在异亮氨酸产生菌汉fIavummi的种子培养基中和发酵培养基中添加VB12,提高种子活力，缩短发酵周期，从而提高L-异亮氨酸产量。
[0014]本发明是以黄色短杆菌汉10505为出发菌株，黄色短杆菌B.fIavumilQ^菌株来源于吉林大学生物与农业工程学院发酵工程实验室。
[0015]本发明的具体步骤如下:
(I)紫外诱变育种:
a.紫外诱变
以黄色短杆菌& fiBVirniimm为出发菌株，取对数期的种子制备菌悬液，进行显微镜计数控制菌体浓度约为IX 18个/mL。取制备好的菌悬液，采用15W紫外灯，照射距离30cm，测定不同照射时间的杀菌率，绘制致死率曲线。选择合适的诱变条件进行紫外诱变。
[0016]b.营养缺陷性突变菌株的筛选
中间培养:取诱变处理后的菌液100 PL涂布CM平板，31°C培养48 h。CM培养基(g/L):酵母粉5，蛋白胨10，牛肉膏10，玉米浆20mL，琼脂15。
[0017]淘汰野生型:用灭菌牙签挑取单菌落，一一对应接种于CM平板和丽平板，31°C培养48 h。选出仅在CM平板上生长的菌株。丽培养基(g/L):葡萄糖20，硫酸铵10，KH2PO4.3Η20 LMgSO4.7Η20 0.4，FeSO4.7Η20 0.0 I, MnSO4.H2O 0.01, VH 0.lmg, VB1 0.lmg,
琼脂20。
[0018]营养缺陷型鉴定:将选出的菌株对应接于含Met+Lys+Ala、Met+Lys、Met+Ala、Lys+Ala的补充培养基中，31°C培养48 h，确定缺陷型。
[0019]摇瓶初筛和复筛:选出双缺或三缺的菌株进行初步的产酸测定，从中选出产L-异亮氨酸的菌株，进行进一步的研究。将选出的菌株进行摇瓶分批发酵，从中选出产酸性能较高的菌株。产酸结果如图1所示，图1中各菌株的缺陷型是:il0505 (Met-) ；AM1(Ala-+Met-) ；AM2 (Ala_+Met_) ;KM1 (Met-+Lys-) ；KM2 (Met-+Lys_)。种子培养基(g/L):葡萄糖 35，硫酸铵 3，KH2PO4.3H20 1.5，MgSO4.7H20 0.4，FeSO4.7H20 0.01，MnSO4.H2O0.01，玉米浆15mL，豆饼水解液15 mL，VH 0.Smg7VB1 2.5mg，尿素2(分消)。发酵培养基(g/L):葡萄糖 80，硫酸铵 15，KH2PO4.3H20 1.5，K2HPO4.3H20 3，MgSO4.7H20 0.4，FeSO4.7H20
0.015，MnSO4.H2O 0.015，玉米浆 25mL，豆饼水解液 20mL, VH 0.5mg, VB1 2.5mg, Ala 20mg,Met 20mg, Lys 20mg, CaCO3 20 (分消)。种子 31°C，200 r/min 培养 24h。10% 接种量接发酵，31。。，200 r/min 发酵培养 48h。
[0020]最终选育出一株产酸较高、遗传性能稳定的菌株KM1，进一步对其进行发酵优化。
[0021](2)摇瓶发酵条件优化: c.种子培养优化
在活化斜面上培养汉，活化培养基(g/L):蛋白胨1，酵母浸粉0.5，牛肉膏1，玉米浆2mL，琼脂1.5。
[0022]从活化斜面上划取一环菌，接于种子培养基中，31°C，200 r/min培养。首先，利用均匀设计法对种子培养基进行优化，优化后的种子培养基成分为(g/L):葡萄糖30，硫酸铵3，甜菜碱 1.5，KH2PO4.3H20 1.5，MgSO4.7H20 0.4，FeSO4.7H20 0.01, MnSO4.H2O 0.01, ?米浆15mL，豆饼水解液20 mL,VH 0.Smg7VB1 2.5mg。然后，对种子培养条件进行优化，得到最优培养条件为31 °C，200 r/min，24h。
[0023]在此基础上，通过在种子培养基中添加VB12，进一步优化种子培养条件。如图2所示，添加VB12后种子达到对数期的生长时间缩短，约12h，对照组(未添加VB12)为24h。接发酵后，L-异亮氨酸的产量也有所提高。如图3所示，对照组(添加量为“O”)L-异亮氨酸的产量为8.44 g/L。种子培养基中VB1J^加量为8 mg/L时，L-异亮氨酸产量最高为9.66g/L,比对照组提高14.4%。
[0024]d.摇瓶发酵培养基优化
B.flavuwmi菌株为氨基酸缺陷型，首先对发酵培养基中丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的添加量进行正交优化。在此基础上，通过在发酵培养基中添加VB12，缩短发酵周期，提高效率。80g糖分批发酵约35h，优化前为48h。通过研究培养基中VB12的添加量来提高L-异亮氨酸的产量。如图4所示，对照组L-异亮氨酸的产量为9.99 g/L。发酵培养基中VB12添加量为2mg/L时，L-异亮氨酸产量最高为11.83g/L，比对照组提高18.4%。
[0025]e.5L发酵罐补料分批发酵
将发酵罐中发酵培养基经121°C左右、15min蒸汽灭菌，降温至31°C左右后接入菌种，接种量为8%;同时将经过压缩、过滤后的无菌空气输入发酵罐中，将经121°C、8min蒸汽灭菌后的800g/L葡萄糖液进行连续流加；pH7，溶氧1(Γ20%，发酵50h;产酸达到38.9g/L。与不添加VB12相比较，发酵时间缩短了 10h，产酸提高了 14.8%。
[0026]f.利用高效液相色谱法测定发酵液中L-异亮氨酸含量。
【权利要求】
1.一种提高异亮氨酸产量的方法，该方法是:通过紫外诱变育种选育出一株异亮氨酸产生菌汉该菌株的出发菌株为黄色短杆菌汉fIavum ?10505(Met>Ethr+ a -ABr+AECr );在异亮氨酸产生菌汉fIavummi的种子培养基中和发酵培养基中添加VB12。
2.根据权利要求1所述的所述的一种提高异亮氨酸产量的方法，其特征在于:所述的黄色短杆菌汉10505菌株来源于吉林大学生物与农业工程学院发酵工程实验室。
3.根据权利要求1所述的所述的一种提高异亮氨酸产量的方法，其特征在于:所述的异亮氨酸产生菌汉fIavummi应用于发酵法生产L-异亮氨酸。
【文档编号】C12R1/13GK104357503SQ201410672837
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月23日 优先权日:2014年11月23日
【发明者】王健, 刘丽君 申请人:吉林大学