一种快速检测植物乳杆菌st-iii的引物及其检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明目的是提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，其特征在于：所述特异性标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KdpA蛋白质的基因，并位于植物乳杆菌ST-III来源的pST-III质粒上。本发明的另一个目的是提供一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其特征在于：该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的序列形同，引物长度为15-40bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序列互补，引物长度为15-40bp，该引物对扩增片段长度为200-1773bp。具有如下优点：检测速度快、特异性高、灵敏度高、成本低。
【专利说明】一种快速检测植物乳杆菌ST-I I I的引物及其检测方法和 试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测植物乳杆菌ST-III的引物及其检测方法和试剂盒，属 于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌ST-III是一株典型的益生菌，自身具有降低胆固醇、降血脂、提高人 体免疫力等多种益生功能。该菌株的基因组已于2010年测定并公布，同时该菌株已经作 为发酵剂应用于工业生产，但目前市场相对混乱，存在大量以假乱真、以次充好的现象。目 前已经确定植物乳杆菌ST-III的很多益生功能与其自身的pST-ΙΙΙ质粒密切相关，而且 pST-III质粒决定了植物乳杆菌ST-III -些特殊性质。pST-ΙΙΙ质粒大小为53. 6kbp，多拷 贝，而且核苷酸序列也已经被公布测定。这些核苷酸序列的公布可以使我们了解不同益生 菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为同种细菌不同菌株间的区分和鉴 定奠定基础。经分析发现pST-III质粒存在一个编码钾离子转运基因簇Kdp，此基因簇赋予 植物乳杆菌ST-III极强的耐盐性，而且是目前为止在乳杆菌中仅在植物乳杆菌ST-III发 现这一钾离子转运簇。这为植物乳杆菌ST-III进行分子标记，并提供特异性的检测方法提 供额可能。分子检测主要是PCR方法检测具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、成本低的 优势，因此建立植物乳杆菌ST-III的PCR方法能快速的将植物乳杆菌ST-III与其它植物 乳杆菌菌株区分开来，从而检测市场上以假乱真、以次充好的乳制品，对乳制品的监管，具 有很强的应用价值。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：
[0004] 本发明的一个目的是提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，其特 征在于：
[0005] 特异性标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KdpA蛋白质的基因，位于植物乳杆 菌ST-III来源的pST-III质粒上。
[0006] 本发明所提供的特异性标记分子，还可以具有这样的特征：
[0007] 的特异性标记分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第720位至第1200位所示。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其特征在于：
[0009] 该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的序列中的 一段相同，长度为15_40bp ;另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序 列中的一段互补，长度为15_40bp，该引物对扩增出的片段长度为200-1773bp。
[0010] 本发明所提供的引物，还可以具有这样的特征，的引物对中，一条引物的序列如 SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 本发明的又一个目的在于提供一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特 征在于：该试剂盒包括上述目的中所提供的引物对。
[0012] 根据本发明所提供的试剂盒，其特征在于：
[0013] 的试剂盒还包括dNTP，10 XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。
[0014] 本发明再一个目的在于提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在 于，包括如下步骤：
[0015] 步骤一，提取待测样品囷株中的质粒DNA ;
[0016] 步骤二，以步骤一所得质粒DNA为模板，以上述目的中所提供的引物对进行PCR反 应；
[0017] 步骤三，将步骤二所得PCR反应产物进行电泳检测，检测是否存在权利要求3或4 的引物扩增出的片段。
[0018] 另外，本发明所提供的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，还可以具有这样的特 征：
[0019] 其中，步骤二中的PCR反应的反应体系包括引物对，该引物对中的两种引物的浓 度均为 0· 5mmol/L ;0· 2mmol/L 的dNTP ;lXPCRbuffer ;L 5mmol/L的 Mg2+;0. 02U/yL的Taq DNA聚合酶；以及I. 0-2. Ong/ μ L的DNA模板。
[0020] 另外，本发明所提供的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，还可以具有这样的特 征：
[0021] 步骤二中的 PCR反应程序为：95°C，3min ;95°C下 45s，55°C下 45s，72°C下 lmin，进 行30个循环；72°C，5min ;4°C保存。
[0022] 本发明的再一个目的在于提供一种上述特异性标记分子作为植物乳杆菌ST-III 菌株的特征序列在检测植物乳杆菌ST-III菌株中的应用。
[0023] 发明作用与效果
[0024] 本发明所提供的特异性检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物及其检测方法和试剂 盒，具有如下优点：
[0025] 1.检测速度快、特异性高
[0026] 与传统的微生物的生化培养鉴定技术的整个鉴定周期需要5-7天相比，本发明所 提供的检测方法只需要3-4个小时，检测速度明显变快。本发明所设计的引物对根据编码 植物乳杆菌ST-IIIKdpA蛋白质基因的特异性标记片段设计，该引物可以在编码植物乳杆 菌ST-III菌株中扩增出相应的DNA片段，并且只特异性的扩增植物乳杆菌ST-III的基因， 而不能在其他乳杆菌中扩增出相应片段，包括NCBI已报道的经过全基因组（含质粒）测序 的乳杆菌菌株，说明以该基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。
[0027] 2.灵敏度高、成本低
[0028] PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克 水平，因此灵敏度高。而且本发明中的模板为多拷贝的质粒（约10个拷贝），因此与一般的 以基因组为模板的PCR方法相比，本发明中的方法能再提高一个数量级的灵敏度，因此本 发明中的方法灵敏度更高。此外，与通过全基因组序列测序区分同类细菌间不同菌株的方 法相比，费用大为降低、实验周期也大为缩短，可以很方便地投入实际应用。
【具体实施方式】
[0029] 以下说明本发明的【具体实施方式】
[0030] 实施例1酸奶中植物乳杆菌ST-III的检测
[0031] 取IOml酸奶，8000g离心lOmin，弃上清，取沉淀。以去离子水洗沉淀2次，用质粒 提取试剂盒（SanPrep柱式质粒DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程有限公司）提取菌体的 质粒DNA。然后以所提取DNA为模板进行PCR反应。
[0032] PCR反应体系为：0. 5mmol/L的上游引物，0. 5mmol/L的下游引物，0. 2mmol/L的 dNTP，IXPCR buffer，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02U/uL 的 Taq DNA 聚合酶，IuL 的 DNA 模板，加 去例子水至 20ul。PCR 反应程序为：95°C，3min ;将 95°C下 45s，55°C下 45s，72°C下 lmin， 对以上三步进行30个循环；72°C 5min ;4°C保存。
[0033] 最后进行电泳检测，取5ul PCR产物在I %琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为100V， 电泳时间为40min。以DNA分子量标记为对照进行检测。
[0034] 结果显示在紫外灯下存在480bp的核酸片段，说明待测样品中存在植物乳杆菌 ST-IIIo
[0035] 实施例2特异性验证
[0036] 选择选择不同的植物乳杆菌菌株20株，包括5株植物乳杆菌植物亚种，5株不同 来源的植物乳杆菌ST-III，3株植物乳杆菌P8菌株，2株植物乳杆菌299v菌株，1株植物 乳杆菌ATCC8014,1株植物乳杆菌CCFM8610,1株植物乳杆菌CCFM8724,1株植物乳杆菌 CCFM8661，1株植物乳杆菌CW006。其它种乳杆菌50株，包括10株嗜酸乳杆菌，5株动物乳 杆菌，5株短乳杆菌，5株布氏乳杆菌，5株解淀粉乳杆菌，5株卷曲乳杆菌，5株德氏乳杆菌， 5株发酵乳杆菌，5株干酪乳杆菌，利用本发明所提供的引物对进行PCR反应，PCR扩增体系 和程序以及电泳的具体操作参照实施例1。
[0037] 结果显示在紫外灯下，只有植物乳杆菌ST-III有较亮的480bp电泳条带，其它菌 株和菌种均没有480bp电泳条带。说明设计的PCR引物检测特异性强，可以准确、方便地将 植物乳杆菌ST-III与其它不同细菌区分开来。
[0038] 本实施方式提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，此特异性标记 分子是编码植物乳杆菌ST-III KdpA蛋白质的基因。
[0039] KdpA蛋白质是参与钾离子转运的蛋白质之一，编码植物乳杆菌ST-III菌株KdpA 蛋白质的基因的GenBank Accession No.为LPST_P0009。优选的，的特异性标记分子是编 码植物乳杆菌ST-IIIKdpA蛋白质的基因。更优选的，特异性标记分子是编码植物乳杆菌 ST-III KdpA蛋白质基因的第720bp至第1200bp所示序列的核苷酸。特异性标记分子最优 选的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第720bp至第1200bp所示。
[0040] 上述实施例还提供一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物对。该引物对中，一条 引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的前端序列相同，引物长度为15-40bp， 最佳的是23bp ;另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序列互补，引物 长度15-40bp，最佳的是23bp ;该引物对扩增出的片段长度为200-1773bp.，优选480bp。优 选的，引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3 所示。
[0041] 上述实施例所提供的特异性扩增植物乳杆菌ST-III菌株的引物，根据本发明的 特异性标记分子的序列进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得。
[0042] 本实施例还提供一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，该试剂盒包括的引 物对，该试剂盒较佳的还包括dNTP，10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。更佳的，试剂盒还包 括阳性对照或者基因抽提试剂。
[0043] 本发明的待测样品为任何可能含有植物乳杆菌ST-III的物质，较佳的比如牛奶 或乳制品。
[0044] 本发明根据NCBI已报道的乳杆菌的序列，运用blast程序找出植物乳杆菌ST-III 所特有的核苷酸序列kdpA基因，根据这些核苷酸序列设计相应引物。经过对这些引物的筛 选和验证，得到了能够用于鉴定植物乳杆菌ST-III的特异性引物。本发明一并提供了使用 该引物的方法和试剂盒。应理解，以上实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范 围。上述实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
[0045]
[0046]
【权利要求】
1. 一种植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，其特征在于： 所述特异性标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KdpA蛋白质的基因，位于植物乳杆 菌ST-III来源的pST-III质粒上。
2. 如权利要求1所述的植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，其特征在于： 所述的特异性标记分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第720位至第1200位所示。
3. -种检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物对，其特征在于： 该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的序列中的一段 相同，长度为15-40bp ;另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序列中 的一段互补，长度为15-40bp，该引物对扩增出的片段长度为200-1773bp。
4. 如权利要求3所述的检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物对，其特征在于： 所述引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
5. -种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特征在于： 该试剂盒包括如权利要求3或4所述的引物对。
6. 如权利要求5所述的检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特征在于，还包括： dNTP ;10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。
7. -种植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一，提取待测样品菌株中的质粒DNA ; 步骤二，以步骤一所得的所述质粒DNA为模板，以权利要求3或4所述的引物对进行 PCR反应； 步骤三，对步骤二所得的PCR反应产物进行电泳检测，检测是否存在权利要求3或4所 述的引物扩增出的片段。
8. 如权利要求7所述的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于： 其中，步骤二中所述的PCR反应的反应体系包括 所述引物对，该引物对中的两种引物的浓度均为〇. 5mmol/L;0. 2mmol/L的dNTP ; 1 X PCR buffer ; 1. 5mmol/L 的 Mg2+;0. 02U/ y L 的 Taq DNA 聚合酶；以及 1. 0-2. Ong/ y L 的 DNA模板。
9. 如权利要求7所述的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于： 其中，步骤二中所述的PCR反应的反应程序依次为，95 °C，3min ;95 °C下45s，55 °C下 45s，72°C下 lmin，进行 30 个循环；72°C，5min;4°C保存。
10. 如权利要求1所述的特异性标记分子作为植物乳杆菌ST-III菌株的特征序列在检 测植物乳杆菌ST-III菌株中的应用。
【文档编号】C12Q1/04GK104480204SQ201410747460
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】艾连中, 王光强, 夏永军, 陈卫, 王彦波, 郭本恒, 宋馨 申请人:上海理工大学