一种快速检测乳酸乳球菌的引物及其检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明的一个目的是提供一种乳酸乳球菌的特异性标记分子，其特征在于：所述特异性标记分子是编码乳酸乳球菌Usp45蛋白质的基因。本发明的另一个目的是提供一种检测乳酸乳球菌的引物对，其特征在于：该引物对中，一条引物和乳酸乳球菌的特异性标记分子的序列形同，引物长度为15-40bp；另一条引物和乳酸乳球菌的特异性分子标记的序列互补，引物长度为15-40bp，该引物对扩增片段长度为200-1383bp。本发明具有如下优点：检测速度快、特异性高、灵敏度高、成本低。
【专利说明】一种快速检测乳酸乳球菌的引物及其检测方法和试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，特别涉及一种快速方便检测乳酸乳球菌的引物及其检 测方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 酸乳球菌（Lactococcus Iactis)作为乳球菌属中最具代表性的菌种。乳酸乳 球菌已经被美国食品药品管理局和世界卫生组织认定为GRAS (Generally RecognizedAs Safe)，是相当安全的食品微生物。所以常被用在食品工业里面。乳酸乳球菌最初被鉴定为 乳酸链球菌（Streptococcus Iactis)，直到1987年才被重新划分为乳酸乳球菌。目前乳酸 乳球菌包括4个亚种，分别为乳酸乳球菌乳酸亚种（L. Iactis subsp. Iactis)，乳酸乳球菌 乳脂亚种（L. Iactis subsp. cremoris)，乳酸乳球菌霍氏亚种（L. Iactis subsp. hordniae) 和L. Iactis subsp. tructae。目前已经发现在所有分析过的乳酸乳球菌菌株中均含有 45kDa的未知功能的分泌蛋白质，此蛋白质被命名为Usp45。此蛋白质的发现为乳酸乳球菌 进行分子标记，并提供特异性的检测方法提供了可能。
[0003] 问题是市场上乱用现象比较严重，乳酸乳球菌和乳酸链球菌不分，混用、乱用现象 比较突出。因此需要建立乳酸乳球菌的快速检测方法的将乳酸乳球菌与其它细菌菌株区分 开来。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：
[0005] 本发明的一个目的是提供一种乳酸乳球菌的特异性标记分子，其特征在于：特异 性标记分子是编码乳酸乳球菌Usp45蛋白质的基因。
[0006] 进一步，本发明所提供的乳酸乳球菌的特异性标记分子，还可以具有这样的特征： 其中，特异性标记分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第33位至第693位所示。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种检测乳酸乳球菌的引物对，其特征在于：
[0008] 该引物对中，一条引物和乳酸乳球菌的特异性标记分子的序列其中一段相同，弓丨 物长度为15-40bp ;另一条引物和乳酸乳球菌的特异性分子标记的序列互补，引物长度为 15-40bp，该引物对扩增片段长度为200-1383bp。
[0009] 进一步，本发明所提供的引物对，还可以具有这样的特征，一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 本发明的又一个目的在于提供一种检测乳酸乳球菌的试剂盒，其特征在于：该试 剂盒包括上述目的中所提供的引物。
[0011] 进一步，本发明所提供的检测乳酸乳球菌的试剂盒，还可以具有这样的特征：试剂 盒还包括dNTP，10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。
[0012] 本发明再一个目的在于提供一种乳酸乳球菌的检测方法，其特征在于，包括如下 步骤：
[0013] 步骤一，提取待测样品菌株中的质粒DNA ;
[0014] 步骤二，以步骤一所得质粒DNA为模板，以上述目的中所提供的引物对进行PCR反 应；
[0015] 步骤三，将步骤二所得PCR反应产物进行电泳检测，检测是否存在上述目的中提 供的引物对所扩增出的片段。
[0016] 另外，本发明所提供的乳酸乳球菌的检测方法，还可以具有这样的特征：其中，上 述步骤二中的PCR反应体系包括0. 5mmol/L的上游引物，0. 5mmol/L的下游引物，0. 2mmol/L 的 dNTP，I XPCR buffer，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶，1. 0-2. Ong/ μ L 的DNA模板。
[0017] 另外，本发明所提供的乳酸乳球菌的检测方法，还可以具有这样的特征：其中，步 骤二中的PCR反应的反应程序依次为，95°C，3min ;95°C下45s，55°C下45s，72°C下lmin，进 行30个循环；72°C，5min ;4°C保存。
[0018] 本发明的再一个目的在于提供一种上述特异性标记分子作为乳酸乳球菌的特征 序列在检测乳酸乳球菌中的应用。
[0019] 发明作用与效果
[0020] 本发明所提供的特异性检测乳酸乳球菌的引物及其检测方法和试剂盒，具有如下 优点：
[0021] 1.检测速度快、特异性高
[0022] 与微生物的生化培养鉴定技术整个鉴定周期需要5-7天相比，本发明的PCR方法 只需要3-4个小时，检测速度明显变快。本发明所设计的引物对根据编码乳酸乳球菌Usp45 蛋白质基因的特异性标记片段设计，该引物可以在编码乳酸乳球菌菌株中扩增出相应的 DNA片段，并且只特异性的扩增乳酸乳球菌的基因，而不能在其他乳杆菌中扩增出相应片 段，包括NCBI已报道的经过全基因组（含质粒）测序的乳杆菌菌株，说明以该基因片段为 基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。
[0023] 2.灵敏度高、成本低
[0024] PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克 水平，因此灵敏度高。而且本发明中的模板为多拷贝的质粒（约10个拷贝），因此与一般的 以基因组为模板的PCR方法相比，本发明中的方法能再提高一个数量级的灵敏度，因此本 发明中的方法灵敏度更高。此外，与通过全基因组序列测序区分同类细菌间不同菌株的方 法相比，费用大为降低、实验周期也大为缩短，可以很方便地投入实际应用。
【具体实施方式】
[0025] 以下说明本发明的【具体实施方式】
[0026] 实施例1酸奶中乳酸乳球菌的检测
[0027] 取IOml酸奶，8000g离心lOmin，弃上清，取沉淀。以去例子水洗沉淀2次，用质 粒提取试剂盒（SanPrep柱式质粒DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程有限公司）提取菌体 的质粒DNA。然后以所提取DNA为模板进行PCR反应。
[0028] PCR反应体系为：0. 5mmol/L的上游引物，0. 5mmol/L的下游引物，0. 2mmol/L的 dNTP，IXPCR buffer，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶，1 μ L 的 DNA 模板，加 去例子水至2(^1。？0?反应程序为：95°0,311^11;30个循环（95°0 458,55°0 458,72°0 11^11); 72°C 5min ;4°C 保存。
[0029] 最后进行电泳检测，取5 μ I PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为100V， 电泳时间为40min。以DNA分子量标记为对照进行检测。
[0030] 结果显示在紫外灯下存在480bp的核酸片段，说明待测样品中存在乳酸乳球菌。
[0031] 实施例2特异性验证
[0032] 选择选择不同的乳酸菌菌株20株，包括乳酸乳球菌4株，乳酸链球菌5株，植物乳 球菌2株，格氏乳球菌2株，干酪乳杆菌4株，植物乳杆菌3株。其它种细菌菌株50株，包 括大肠杆菌10株，枯草芽孢杆菌10株，金黄色葡萄球菌10株，弯曲杆菌5株，沙门氏菌5 株，假单胞菌5株，短小芽孢杆菌5株。利用本发明所提供的引物对进行PCR反应，PCR扩 增体系和程序以及电泳的具体操作参照实施例1。
[0033] 结果显示在紫外灯下，只有乳酸乳球菌有较亮的480bp电泳条带，其它菌株和菌 种均没有480bp电泳条带。说明设计的PCR引物检测特异性强，可以准确、方便地将乳酸乳 球菌与其它不同细菌区分开来。
[0034] 本发明的技术方案之一为：一种乳酸乳球菌菌株的特异性标记分子，特异性标记 分子是编码乳酸乳球菌Usp45蛋白质的基因。
[0035] Usp45蛋白质是乳酸乳球菌的分泌蛋白质，目前其功能未知。通过blast分析发 现此蛋白质仅存在于乳酸乳球菌的不同菌株中，与其它细菌的蛋白质相似性极低。因此可 以选择Usp45蛋白质的编码基因作为乳酸乳球菌的特异性标记分子。优选的，特异性标记 分子是编码乳酸乳球菌Usp45蛋白质的基因。更优选的，特异性标记分子是编码乳酸乳球 菌Usp45蛋白质基因的第33bp至第693bp所示序列的核苷酸。特异性标记分子最优选的 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第33bp至第693bp。
[0036] 本发明采取的技术方案二为：一种检测乳酸乳球菌菌株的引物对。该引物对中， 一条引物和乳酸乳球菌菌株的特异性标记分子的序列形同，引物长度为15_40bp，最佳的是 25bp ;另一条引物和乳酸乳球菌菌株的特异性分子标记的序列互补，引物长度15-40bp，最 佳的是22bp ;该引物对扩增出的片段为长度200-1383bp，优选645bp。优选的，引物对中， 一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0037] 本发明的特异性扩增乳酸乳球菌菌株的引物，根据本发明的特异性标记分子的 序列进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得。
[0038] 本发明采取的技术方案之三为：一种检测乳酸乳球菌菌株的试剂盒，该试剂盒包 括上述引物。试剂盒较佳的还包括dNTP，10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。更佳的，试剂 盒还包括阳性对照或者基因抽提试剂。
[0039] 本发明采取的技术方案之四为：一种乳酸乳球菌菌株的检测方法，包括如下步 骤：
[0040] 步骤一，提取待测样品菌株中的基因组DNA ;
[0041] 步骤二，以步骤一所得基因组DNA为模板，以本发明的引物对进行PCR反应；
[0042] 步骤三，将步骤二所得PCR反应产物进行电泳检测，具有本发明引物扩增出的片 段的样品中存在乳酸乳球菌ST-III菌株。
[0043] 本发明中，步骤二所述的PCR反应体系为常规，只要能扩增出特异性产物即可。较 佳的是，所述的PCR反应体系总体积为20-50 μ L，反应体系中包括0. 5mmol/L的上游引物， 0· 5mmol/L 的下游引物，0· 2mmol/L 的 dNTP，IXPCR buffer，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 02U/ yL 的 Taq DNA 聚合酶，I. 0-2. Ong/ μ L 的 DNA 模板。
[0044] 步骤二所述的PCR反应程序为常规，只要能扩增出特异性产物即可。较佳的为： 95°C，3min ;95°C下45S，55°C下45S，72°C下lmin，中间这三个步骤进行30个循环；72°C下 5min ;4°C 保存。
[0045] 步骤三的电泳为本领域常规，可以是琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳， 较佳的是琼脂糖凝胶电泳，优选1%琼脂糖凝胶电泳。按本领域常规方法，将凝胶电泳产 物在一定条件下成像，即可判断结果。比如在紫外凝胶成像仪下拍照成像。采用上述引物 的PCR反应产物，如有645bp核酸片段，则说明待测样品中存在乳酸乳球菌菌株。若不存 在645bp的核酸片段，则说明待测样品中不存在乳酸乳球菌。与本领域常规一样，可与对照 DNA标准品比较而得DNA片段的长度。
[0046] 本发明根据NCBI已报道的乳酸乳球菌的序列，运用blast程序找出乳酸乳球菌所 特有的核苷酸序列Usp45基因，根据这些核苷酸序列设计相应引物。经过对这些引物的筛 选和验证，得到了能够用于鉴定乳酸乳球菌的特异性引物。本发明一并提供了使用该引物 的方法和试剂盒。下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说 明本发明而非用于限定本发明的范围。上述实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件进行。
[0047]
[0048]
【权利要求】
1. 一种乳酸乳球菌的特异性标记分子，其特征在于： 所述特异性标记分子是编码乳酸乳球菌Usp45蛋白质的基因。
2. 如权利要求1所述的乳酸乳球菌菌株的特异性标记分子，其特征在于： 其中，所述特异性标记分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第33位至第693位所示。
3. -种检测乳酸乳球菌的引物对，其特征在于： 该引物对中，一条引物和乳酸乳球菌的特异性标记分子的序列的其中一段相同，长 度为15-40bp ;另一条引物和乳酸乳球菌的特异性分子标记的序列中的一段互补，长度为 15-40bp，该引物对扩增出的片段长度为200-1383bp。
4. 如权利要求3所述的检测乳酸乳球菌的引物对，其特征在于： 所述引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
5. -种检测乳酸乳球菌的试剂盒，其特征在于： 该试剂盒包括如权利要求3或4所述的引物。
6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于： 所述的试剂盒还包括dNTP，10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。
7. -种乳酸乳球菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一，提取待测样品菌株中的质粒DNA ; 步骤二，以步骤一所得质粒DNA为模板，以权利要求3或4所述的引物对进行PCR反 应； 步骤三，将步骤二所得PCR反应产物进行电泳检测，检测是否存在权利要求3或4所述 的引物对扩增出的片段。
8. 如权利要求7所述的乳酸乳球菌的检测方法，其特征在于： 步骤二中所述的PCR反应的反应体系包括引物对，该引物对中的两种引物的浓度均为 0? 5mmol/L ;0? 2mmol/L 的 dNTP ;1 XPCR 缓冲液；1. 5mmol/L 的 Mg2+;0. 02U/uL 的 Taq DNA 聚 合酶；1. 0-2. Ong/ y L 的 DNA 模板。
9. 如权利要求7所述的乳酸乳球菌的检测方法，其特征在于： 其中，步骤二中所述的PCR反应的反应程序依次为，95°C，3min ;95°C下45s，55°C下 45s，72°C下 lmin，进行 30 个循环；72°C，5min;4°C保存。
10. 如权利要求1所述的特异性标记分子作为乳酸乳球菌的特征序列在检测乳酸乳球 菌中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK104480203SQ201410747459
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】艾连中, 王光强, 夏永军, 陈卫, 王彦波, 郭本恒, 宋馨 申请人:上海理工大学