本发明涉及饲料添加剂领域，尤其涉及一种由啤酒废弃酵母泥制备核糖核苷酸的方法及含核糖核苷酸的饲料添加剂。
背景技术：
我国每年从啤酒生产中淘汰下来的废酵母折干有5万吨之多，啤酒酵母细胞中核糖核酸(RNA)含量高达酵母细胞的4％至6％。核苷酸已应用于饲料和养殖业，作为饲料添加剂。许多哺乳动物、家禽和鱼虾，在其快速生长阶段，或遭遇到环境和生活条件急剧改变时，机体许多重要免疫器官如淋巴、骨髓、肠道、血红细胞和白细胞中内源核苷酸不能满足需要，造成机体免疫力急骤下降，诱发许多疾病。在相应阶段适当补充外源核苷酸，可以维持养殖动物机体整体免疫功能，促进肠道细胞分化、生长和修复；增强抗应激能力，减少疾病和死亡；产生体内抗氧化，消除自由基；可诱食、增食，促进生长发育；提高生殖能力和繁殖系数等。
为了利用废酵母中的核苷酸，需将核糖核酸从废酵母中分离出来，并将其酶解为核苷酸。现有从啤酒废弃酵母泥分离核糖核酸的方法，得到的核糖核酸含量很有限，在5-6％左右(地衣酚核糖核酸测定法)，核糖核酸酶解方法水解效率很低，需要耗费很长的酶解时间，约22-30小时。
技术实现要素：
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种由啤酒废弃酵母泥制备核糖核苷酸的制备方法及含核糖核苷酸的饲料添加剂。
一种由啤酒废弃酵母泥制备核糖核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1、预处理：对啤酒废弃酵母泥进行过筛除杂，离心获得干物质浓度10-22wt％的酵母泥浓缩液；
S2、第一次酶解：将步骤S1制得的酵母泥浓缩液加热升温至40-60℃，调整pH值至4.0-11.0，然后加入第一复合酶，在40-60℃酶解15-18小时得到第一酶解液，终止酶解并离心得到上清液A；第一复合酶的用量为酵母泥干物质重量的1-3wt‰，所述第一复合酶由蛋白酶和纤维素酶按照1:1的重量比组成；
S3、超滤纯化核酸：使用超滤设备将上清液A在室温及压强不超过3MPa条件下进行超滤纯化，得到核糖核酸浓缩液，浓度为80-90wt％；
S4、第二次酶解：向核糖核酸浓缩液中加入第二复合酶，在40-60℃酶解1.0-2.0小时得到第二酶解液；终止酶解并离心得到上清液B；喷雾干燥上清液B得到酵母核苷酸粉，核苷酸单体含量为40-60wt％；第二复合酶的用量为核糖核酸浓缩液中干物质重量的1-3wt‰，所述第二复合酶由核酸酶和磷酸二酯酶按照1:1的重量比组成。
优选地，所述步骤S2中第一复合酶的酶活力与底物浓度之比为5000-10000U/g，反应温度为50-60℃。
更优选地，所述步骤S2中第一复合酶的酶活力与底物浓度之比为6000-8000U/g。
优选地，所述步骤S4中第二复合酶的酶活力与底物浓度之比为1000-5000U/g，反应温度为50-60℃。
优选地，所述步骤S2中终止酶解的方法为：调整第一酶解液pH值至3.0-5.0，加热至80-100℃灭活20-30min。
更优选地，所述步骤S2中在终止酶解后，向第一酶解液中加入SDS缓冲液，SDS缓冲液的重量为第一酶解液重量的1-2倍，离心得上清液A。
优选地，所述步骤S4中终止酶解并离心的方法为：将第二酶解液的pH值调至5.0以下，加热至80-100℃保持20-30min，离心得上清液B。
优选地，步骤S2和步骤S4中的离心条件为7000r/min、10-20min。
一种含核糖核苷酸的饲料添加剂，包含下述重量百分数的下述组分：
上述核苷酸粉15-25wt％，协同增效剂5-15wt％，载体60-80wt％。
优选地，所述含核糖核苷酸的饲料添加剂包含下述重量百分数的下述组分：
上述核苷酸粉20wt％，协同增效剂10wt％，载体70wt％。
优选地，所述协同增效剂为核苷酸碱基，所述载体为葡萄糖和风味物质，所述风味物质用于改善饲料适口性，如香味剂、鲜味剂或味精等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过两次酶解自啤酒废弃酵母泥中制得核糖核苷酸，通过设定特定的组合酶和条件，可以加快啤酒酵母的酶解和核糖核酸的水解，提高核糖核苷酸的酶解效率。在对啤酒废弃酵母泥进行蛋白酶解阶段，复合使用蛋白酶与纤维素酶，比使用单一酶酶解效果更好，酶解速度更快，显著缩短酶解时间，从原来的22-24小时缩短为15-18小时，酶解速度提高了约25-30％。在核酸酶解阶段，复合使用核酸酶和磷酸二酯酶，比单一使用核酸酶或磷酸二酯酶酶解速度更快，缩短酶解时间。
本发明经过第一次酶解、浓缩后得到的核糖核酸纯度高达80-90％，第二次酶解、干燥后得到的核糖核苷酸单体含量为40-60％，制备的饲料添加剂中核苷酸的含量为20-25％。本发明饲料添加剂适用于所有养殖动物，能提高母畜繁殖性能，提高幼小动物生长速度，促进幼小动物肠道发育，提高机体免疫力水平。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。本实施例中核糖核酸的测定使用地衣酚核糖核酸测定法，核苷酸的测定使用高效液相色谱法。
实施例1
一种由啤酒废弃酵母泥制备核糖核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1、预处理
对啤酒废弃酵母泥进行除杂，然后1000r/min离心，去上清液，得到干物质约为15％的啤酒酵母泥浓缩液，以提高干物质浓度，进而提高生产效率。本实施例中使用新鲜的啤酒废弃酵母泥，不必进行除臭处理。
S2、第一次酶解
使用NaOH溶液调整啤酒酵母泥浓缩液pH值至6.0；再向其中加入第一复合酶，第一复合酶由中性蛋白酶和纤维素酶组成，两种酶的重量比例为1:1，酶的总重量是底物干物质总量的1‰，酶活力与底物浓度之比为5000U/g；然后在温度为55℃、pH为6.0的条件下进行酶解18h，得到第一酶解液。
使用盐酸将第一酶解液的pH值调节至3.0，加热至80℃，使中性蛋白酶、纤维素酶以及未被水解的酵母蛋白进行变性沉淀30min，然后用离心机分离，转速为7000r/min，时间为10-20min，去沉淀，得到上清液A；
S3、超滤纯化核酸
使用超滤设备将上清液A在室温、压强不超过3MPa的条件下进行超滤纯化，得到核糖核酸浓缩液(浓度为80-90wt％)，本实施例中使用的超滤设备是以切向流过滤方式运行、使用管式膜组件的超滤设备，其超滤膜截留分子量为5000Da，控制进入超滤设备的滤液中的酵母和氯化钠总浓度不超过15％，进样速度为10ml/cm2·min。
S4、第二次酶解
将核糖核酸浓缩液中的核糖核酸浓度以重量计控制在10-20％(超滤结束后调整)，然后加入第二复合酶，所述第二复合酶由核酸酶和5’-磷酸二酯酶组成，酶活力与底物浓度之比为1000U/g，再加入硫酸锌，使溶液中硫酸锌的浓度为0.5×10-3mol/L，然后在温度为60℃、pH值为4.0的条件下进行酶解1h，得到第二酶解液，然后使用盐酸将第二酶解液的pH值调节至5.0以下，再加热至100℃保持30min，使酶蛋白变性沉淀，最后用离心机分离，转速7000r/min，时间10-20min，去除沉淀，得到上清液B。上清液B经喷雾干燥得到酵母核苷酸粉，喷雾干燥条件为：进风温度为140℃，出风温度为80℃，所得酵母核苷酸粉的性能指标如下：灰分含量≤5％，水分含量≤5％，核苷酸含量40-60％。
一种含核糖核苷酸的饲料添加剂，包含下述含量的下述组分：
上述核苷酸粉20wt％，协同增效剂10wt％，载体70wt％；
其中，所述协同增效剂为核苷酸碱基，所述载体为无水葡萄糖和风味物质。所得饲料添加剂的性能指标如下：灰分≤8.5％，水分含量≤10％，核苷酸含量≥20％。
实施例2
一种由啤酒废弃酵母泥制备核糖核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1、预处理
对啤酒废弃酵母泥进行除杂，然后1000r/min离心，去上清液，得到干物质约为20％的啤酒酵母泥浓缩液。本实施例中使用新鲜的啤酒废弃酵母泥，可不进行除臭处理。
S2、第一次酶解
使用NaOH溶液调整啤酒酵母泥浓缩液pH值至6.0；再向其中加入第一复合酶，第一复合酶由中性蛋白酶和纤维素酶组成，两种酶的重量比例为1:1，酶的总重量是底物干物质总量的2‰，酶活力与底物浓度之比为6000U/g；然后在温度为60℃、pH为6.0的条件下进行酶解15h，得到第一酶解液。
使用盐酸将第一酶解液的pH值调节至3.0，加热至100℃，使中性蛋白酶、纤维素酶以及未被水解的酵母蛋白进行变性沉淀30min，然后用离心机分离，转速7000r/min，时间10-20min，去沉淀，得到上清液A；
S3、超滤纯化核酸
使用超滤设备将上清液A在室温、压强不超过3MPa的条件下进行超滤纯化，得到核糖核酸浓缩液(浓度80-90wt％)，本实施例中使用的超滤设备是以切向流过滤方式运行、使用管式膜组件的超滤设备，其超滤膜截留分子量为5000Da，控制进入超滤设备的滤液中的酵母和氯化钠总浓度不超过15％，进样速度为10ml/cm2·min。
S4、第二次酶解
将核糖核酸浓缩液中的核糖核酸浓度以重量计控制在10-20％(超滤后调整)，然后加入第二复合酶，所述第二复合酶由核酸酶和5’-磷酸二酯酶组成，酶活力与底物浓度之比为1000U/g，再加入硫酸锌，使溶液中硫酸锌的浓度为0.5×10-3mol/L，然后在温度为60℃、pH值为4.0的条件下进行酶解1h，得到第二酶解液，然后使用盐酸将第二酶解液的pH值调节至5.0以下，再加热至100℃保持30min，使酶蛋白变性沉淀，最后用离心机分离，转速7000r/min，时间10-20min，去除沉淀，得到上清液B。上清液B经喷雾干燥得到酵母核苷酸粉，喷雾干燥条件为：进风温度为140℃，出风温度为80℃，所得酵母核苷酸粉的性能指标如下：灰分含量≤5％，水分含量≤5％，核苷酸含量40-60％。
一种含核糖核苷酸的饲料添加剂，包含下述含量的下述组分：
上述核苷酸粉25wt％，协同增效剂10wt％，载体65wt％其中，所述协同增效剂为核苷酸碱基，所述载体为葡萄糖和风味物质两种。所得饲料添加剂的性能指标如下：灰分≤8.5％，水分含量≤10％，核苷酸含量≥23％。
实施例3
一种由啤酒废弃酵母泥制备核糖核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1、预处理
对啤酒废弃酵母泥进行除杂，然后1000r/min离心，去上清液，得到干物质约为25％的啤酒酵母泥浓缩液，以提高干物质浓度。本实施例中使用新鲜的啤酒废弃酵母泥，可进行除臭处理。
S2、第一次酶解
使用NaOH溶液调整啤酒酵母泥浓缩液pH值至6.0；再向其中加入第一复合酶，第一复合酶由中性蛋白酶和纤维素酶组成，两种酶的重量比例为1:1，酶的总重量是底物干物质总量的3‰，酶活力与底物浓度之比为8000U/g；然后在温度为60℃与pH为6.0的条件下进行酶解15h，得到第一酶解液。
使用盐酸将第一酶解液的pH值调节至3.0，加热至100℃，使中性蛋白酶、纤维素酶变性沉淀30min，加入SDS缓冲液，SDS缓冲液的重量为酶解液重量的1-2倍，使第一酶解液中未被水解的酵母蛋白变性沉淀，然后用离心机分离，转速7000r/min，时间10-20min，去沉淀，得到上清液A；
S3、超滤纯化核酸
使用超滤设备将上清液A在室温、压强不超过3MPa的条件下进行超滤纯化，得到核糖核酸浓缩液，其中核糖核酸的浓度为80-90wt％，本实施例中使用的超滤设备是以切向流过滤方式运行、使用管式膜组件的超滤设备，其超滤膜截留分子量为5000Da，控制进入超滤设备的滤液中的酵母和氯化钠总浓度不超过15％，进样速度为10ml/cm2·min。
S4、第二次酶解
将核糖核酸浓缩液中的核糖核酸浓度以重量计控制在10-20％，然后加入第二复合酶，所述第二复合酶由核酸酶和5’-磷酸二酯酶组成，酶活力与底物浓度之比为3000U/g，再加入硫酸锌，使溶液中硫酸锌的浓度为0.5×10-3mol/L，然后在温度为60℃、pH值为4.0的条件下进行酶解1h，得到第二酶解液，然后使用盐酸将第二酶解液的pH值调节至5.0以下，再加热至100℃保持30min，使酶蛋白变性沉淀，最后用离心机分离，转速7000r/min，时间10-20min，去除沉淀，得到上清液B。上清液B经喷雾干燥得到酵母核苷酸粉，喷雾干燥条件为：进风温度为140℃，出风温度为80℃。所得酵母核苷酸粉的性能指标如下：灰分含量≤5％，水分含量≤5％，核苷酸含量40-60％。
一种含核糖核苷酸的饲料添加剂，包含下述含量的下述组分：
上述核苷酸粉20wt％，协同增效剂10wt％，载体70wt％；
其中，所述协同增效剂为核苷酸碱基，所述载体为葡萄糖和风味物质两种。所得饲料添加剂的性能指标如下：灰分≤8.5％，水分含量≤10％，核苷酸含量≥20％。
效果实施例1、提高母猪繁殖性能及生产性能，提高初生仔猪生产性能
将同一品种、相同怀孕期的母猪8头随机分成两组：对照组和试验组，每组4头母猪，每头母猪作为一个重复组。对照组日粮为基础日粮，试验组日粮为基础日粮+1kg/吨本发明含核糖核苷酸的饲料添加剂。试验从怀孕第90天开始进行，直到哺乳期结束。期间各重复组母猪均采用相同的饲养管理。试验期间记录各母猪的采食量、产仔情况以及仔猪采食量等指标，试验结束后分析对比两组间母猪的日均采食量(ADFI)、各项产仔性能指标以及仔猪包括日增重(ADG)在内的各项生长性能指标，结果如表1-3所示。
表1、母猪采食量统计表
由表1可知，试验组母猪在妊娠后期采食量比对照组增加了2.8％，哺乳期采食量增加7.4％。说明本发明有利于胚胎的发育，对维持母猪体况以及提高产仔性能有促进作用。
表2、母猪产仔情况统计表
注：上述数据均为平均数，N＝4，数字肩标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表2可知，试验组母猪产仔性能各项指标均比对照组有良好的改善，其中成活率得到显著提高，幅度达6.06％。因此，本发明有利于提高母猪生产效益。
表3、仔猪生长情况统计表
由表3可知，与对照组相比，试验组仔猪各项生长性能指标均有良好的改善。因此，本发明有利于提高母乳营养品质，从而促进乳仔猪健康生长，提高生产效益。
效果实施例2、提高幼小动物生产性能
选择同一批21日龄断奶仔猪50头，分2组：对照组和试验组，每组设置25头仔猪。对照组日粮为基础日粮，试验组日粮为基础日粮+1kg/吨本发明含核糖核苷酸的饲料添加剂。试验期为15天(22-36日龄)。试验期间记录各组仔猪的采食量、腹泻情况及健康状况，试验结束后通过分析两组仔猪各项生长性能指标，评估产品效果，结果如表4所示。
表4、幼小动物生产性能表
由表4可知，与对照组相比，试验组仔猪各项生长性能指标均有良好的改善，说明本发明确实可以提高幼小动物生长性能，提高生产效益。
效果实施例3、提高商品肉鸡生产性能
选择一批1日龄麻黄鸡100羽，分为2组：对照组和试验组，每组50羽小鸡，对照组日粮为基础日粮，试验组日粮为基础日粮+500克/吨本发明含核糖核苷酸的饲料添加剂，试验时间为21天(1-21日龄)，试验期间记录各组小鸡耗料量及健康状况，试验结束后通过分析各项生长性能指标评估产品实际效果，结果如表5所示。
表5、肉鸡生产性能表
由表5可知，与对照组相比，试验组鸡的生长性能得到良好的改善，有利于提高肉鸡早期的生长速度，节约饲养成本，提高养殖效益。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。