本发明属于微生物发酵饲料技术领域，具体涉及一种发酵液态仔猪饲料及其制备方法。
背景技术：
随着仔猪的断奶日龄不断提前，面临着“早期断奶综合征”的挑战，如得不到有效解决将使早期断奶失去预期价值。长久以来，人们习惯添加抗生素来增强仔猪的免疫能力，以此来控制腹泻等各种疾病。经过广泛和长期使用抗生素，抗生素带来的负面效应越来越多。在食品安全倍受关注的今天，世界各国人民纷纷禁用抗生素。
与其他的饲料相比，发酵液态保育期仔猪饲料有以下优势：第一，在物理形态与母乳相似，仔猪可以同时获得养分和水的供应；第二，发酵过程中产生大量的乳酸等微生物代谢产物，使液体发酵饲料含有特殊的香味，适口性好，诱使仔猪采食量增加，生长速度加快；第三，发酵液态仔猪饲料往往含有大量的益生菌，其主要是通过消耗氧气、产生乳酸和分泌一些抗菌物质来增强仔猪免疫功能，杀灭病原微生物，防止仔猪腹泻等疾病的发生。
技术实现要素：
本发明公开了一种微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法和应用，以取代抗生素的添加及防治仔猪“早期断奶综合征”。
本发明公开的技术方案如下：
一种用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，其特征在于它是由芽孢菌和乳酸菌组合而成；芽孢菌与乳酸菌接种的体积份数比为2:1~3:1（v/v），所述芽孢菌指的是芽孢B1与芽孢菌B2，B1 B2接种比例为1:1（v/v），所述乳酸菌指的是：乳酸菌R1和乳酸菌R2，R1和R2接种比例为1:2（v/v）；其中芽孢菌B1指的是枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.504），芽孢菌B2指的是解淀粉芽孢杆菌（CGMCC3413），乳酸菌R1指的是凝结芽孢杆菌（CGMCC1.1322），乳酸菌R2指的是粪肠球菌（CGMCC1.130）。
本发明进一步公开了一种微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法和应用，其特征在于按如下的步骤进行：
1）将乳酸菌在MRS培养基液体42℃ 静置培养24h，芽孢菌在LB培养基35℃,200转/分钟，震荡培养18h，得到乳酸菌种子液和芽孢菌种子液；
LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 10，pH7.5。
MRS培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸出粉5，葡萄糖5，CH3COONa 5，柠檬酸二胺2，吐温80 1，K2HPO4 2，MgSO4•7H2O 0.2，MnSO4•7H2O 0.05，pH6.2。
2）将植物性原料粉碎，与水混合均匀，加热到100℃，维持时间10min；
3）待温度降到30℃左右，接种液体微生物种子液，混合均匀后装入塑料桶或不锈钢桶内发酵；在本发明的一些实施例中，在所述步骤2）中，植物性原料粉碎粒度达到物料80%通过40目。
在本发明的一些实施例中，在所述步骤3）中，植物性原料与水质量比为1:3~1:4.5（W/V）。
在本发明的一些实施例中，在所述步骤3）中一种用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，其特征在于它是由芽孢菌和乳酸菌组合而成；其中芽孢菌与乳酸菌混合接种量为4% ~6%（v/w），芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1~3:1（v/v），芽孢菌B1与芽孢菌B2接种比例为1:1（v/v），乳酸菌R1和乳酸菌R2接种比例为1:2（v/v）。
所述的芽孢菌B1指的是枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.504），芽孢菌B2指的是解淀粉芽孢杆菌（CGMCC3413），乳酸菌R1指的是凝结芽孢杆菌（CGMCC1.1322），乳酸菌R2指的是粪肠球菌（CGMCC1.130）。
在本发明的一些实施例中，在所述步骤3）中，植物性原料配比为：玉米粉:豆粕=3:1。在本发明的一些实施例中，在所述步骤2）中，发酵温度30℃～35℃，发酵时间为4天～10天，得到发酵液态保育期仔猪饲料，该发酵饲料还原糖含量达到1.56%以上，乳酸含量达到4.0%以上，乳酸菌数达到109cfu/g以上，大肠杆菌检测不到。
本发明更进一步公开了用于液体菌液发酵液态仔猪饲料,该发酵液态饲料可提高仔猪饲料的利用率，改善饲料风味，而且提高防治断奶仔猪综合征。实验结果显示: 发酵液态仔猪饲料增加了饲料消化吸收效率，日增重提高11.68%；而且发酵饲料中的益生菌改善肠道的微生态环境，提高了机体免疫力，使仔猪腹泻率下降54.88%。该发酵液态仔猪饲料通过发酵后，提高了饲料的适口性和消化率，大大减缓由母乳直接到固体饲料对断奶仔猪的应激，从而减少腹泻率和死亡率。
本发明更加详细的描述如下：
（1）发酵菌种的筛选
本发明从9株菌中筛选目标菌株。菌种按类别可分为芽胞菌4株，分别是枯草芽孢杆菌（B10-5）、枯草芽孢杆菌（WL-BA-1）、解淀粉芽孢杆菌（BI2）、枯草芽孢杆菌（BI1）；乳酸菌5株，分别是植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、豆粕乳杆菌、粪肠球菌LJ、发酵乳杆菌。
1）芽孢菌菌株的筛选
将活化好的芽胞菌分别点接到淀粉培养基和酪素培养基平板上，然后放入37 ℃恒温生化培养箱中培养，观察菌株周围是否有透明圈产生，挑取产生透明圈的菌株再次活化，稀释涂布到平板上，使之产生单菌落，观察产生透明圈的大小，挑取透明圈大的菌株.通过产淀粉酶实验和产蛋白酶实验从4株芽胞菌中筛选出高产淀粉酶和高产蛋白酶的菌株。分别是枯草芽孢杆菌B1（CGMCC1.504）、解淀粉芽孢杆菌B2（CGMCC3413）。
2）乳酸菌菌株的筛选
将活化好的乳酸菌菌液分别按照5%的比例接种于饲料中，然后搅拌饲料使之充分混匀，装入发酵袋置于37℃环境中发酵3d后进行检测。检测时称取5g发酵饲料放入三角瓶中，加入45ml蒸馏水振荡20min，然后离心取上清，稀释相应倍数后用生物传感分析仪测定其乳酸含量，选取乳酸含量高的2株菌株。通过乳酸菌产乳酸性能实验从6株乳酸菌中筛选出产酸高的乳酸菌。分别是凝结芽孢杆菌R1（CGMCC1.1322）、粪肠球菌R2（CGMCC1.130）。
（2）发酵条件的优化：
1）发酵液态饲料芽孢菌与乳酸菌混合比例的优化：
将筛选出的2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的发酵料中，接种量为8%，芽孢菌与乳酸菌接种比例分别为1:2，1:1，2:1， 3:1，4:1，2株芽孢菌接种比例为1:1，2株乳酸菌接种比例为1:1，料水比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表1 芽孢菌与乳酸菌混合比例发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表1可以看出，当芽孢菌和乳酸菌的混合比例为2:1时，还原糖含量最高，益生菌数也较高。因此，芽孢菌与乳酸菌的混合比例选择是2:1。
2）发酵饲料2株芽孢菌比例的优化：
将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的发酵料中，接种量为8%，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌B1和B2接种比例分别为3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，2株乳酸菌接种比例为1:1，料水比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表2 两种芽孢菌不同混合比例发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表2可以看出，芽孢菌B1和B2的混合比例为1:1与其他混合比例相比，还原糖含量最高。因此，最终确定2株芽孢菌B1和B2的混合比例为1:1。
3）发酵饲料2株乳酸菌比例的优化:
将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的发酵料中，接种量为8%，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌B1和B2接种比例为1:1，2株乳酸菌R1和R2比例分别为3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，料水比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表3 两种乳酸菌不同混合比例发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表3可以看出，两种乳酸菌R1和R2的混合比例为1:2时，还原糖含量最高。因此，最终确定2株乳酸菌R1和R2的混合比例为1:2。
4）发酵饲料接种量的优化：
将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的发酵料中，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌B1和B2接种比例为1:1，2株乳酸菌R1和R2比例为1:2，接种量分别为4%，6%，8%，10%，12%，料水比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表4 不同接种量发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表4可以看出， 随着接种量的增加，还原糖含量先减小后增加再减小， 在接种量为4%和10%时还原糖含量最高且一样，乳酸含量也高，但接种量高成本也增加，因此，接种量为4%时最合适。
5）发酵饲料料水比的优化：
将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的发酵料中，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌B1和B2接种比例为1:1，2株乳酸菌R1和R2比例为1:2，接种量为4%，料水比分别为1:3，1:3.5，1:4，1:4.5，1:5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表5 不同料水比发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表5可以看出，当料水比为1:3.5时，还原糖含量最高，益生菌数相对较高，因此，选择料水比为1:3.5。
6）发酵饲料温度的优化：
将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的发酵料中，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌B1和B2接种比例为1:1，2株乳酸菌R1和R2比例为1:2，接种量为4%，料水比为1:3.5，分别置于20℃、26℃发酵5d，32℃、37℃、42℃发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表6 不同发酵温度发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表6可看出，随着温度的升高，还原糖先增加后减小，32℃达到最高。实际发酵过程中可选择20-30℃范围作为发酵温度。
（3）正交试验优化发酵条件
将筛选出的2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，以单因素优化的条件进行正交实验，采用L9(33)型三水平三因素正交实验对芽孢菌与乳酸菌的接种比例，总接种量，料水比进行分析。发酵3d后，测定其乳酸含量，还原糖，芽孢菌数和乳酸菌数，以还原糖含量作为指标，选取还原糖含量最高的作为最终饲料发酵条件。
表7 正交实验影响因素与水平列表
表8 正交试验极差分析
表9 正交试验方差分析
从正交实验结果直观分析R值可知，影响试验结果的因素依次为A>C>B，即对产乳酸影响因素依次为接种量、料水比、接种比例，即优化后的条件是接种量为4%，芽孢菌与乳酸菌接种比例为1:1，料水比为1:3.5，正交试验中第4组既是这个组合。
(4) 微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法
通过上述多次实验研究，最终微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法如下：
1）将乳酸菌在MRS培养基液体42℃ 静置培养24h，芽孢菌在LB培养基35℃,200转/分钟，震荡培养18h，得到乳酸菌种子液和芽孢菌种子液；
LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 10，pH7.5。
MRS培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸出粉5，葡萄糖5，CH3COONa 5，柠檬酸二胺2，吐温80 1，K2HPO4 2，MgSO4•7H2O 0.2，MnSO4•7H2O 0. 05，pH6.2。
2）将植物性原料粉碎，与水混合均匀，加热到100℃，维持时间10min；
3）待温度降到30℃左右，接种液体微生物种子液，微生物种子液是由芽孢菌、乳酸菌混菌组合而成。芽孢菌与乳酸菌混合种子液总计接种量为4%~6%（v/w），其中芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1~3:1（v/v），芽孢菌B1与芽孢菌B2接种比例为1:1（v/v），乳酸菌R1和乳酸菌R2接种比例为1:2（v/v），料水比为1:3~1:3.5（w/w）。混合均匀后装入塑料桶或不锈钢桶内发酵；20-30℃发酵3-5天。
本发明公开的微生物发酵保育期仔猪液态饲料及其制备方法与应用所具有的积极效果在于：
（1）本发明利用芽孢菌、乳酸菌和酵母菌混合发酵植物性原料，由此制备的仔猪饲料无任何抗生素添加，富含乳酸、蛋白质、小肽、多糖、维生素、矿物质及微量元素等营养物质，抗营养因子少，具有适口性好、易消化等特点，益生菌明显增多，且能在肠道内定植，可使仔猪顺利度过断奶期，减少仔猪的腹泻率，提高仔猪的存活率。
（2）本发明的仔猪饲料具有安全可靠、无药物残留、适口性好、易消化等特点，可大幅度减少抗生素的使用，改善动物的健康水平，提高机体免疫力。该发酵液态仔猪饲料通过发酵后，提高了饲料的适口性和消化率，大大减缓由母乳直接到固体饲料对断奶仔猪的应激，从而减少腹泻率和死亡率，此外，该液态仔猪饲料含有益生菌及其代谢产物，具有营养和保健双重功效。
附图说明：
图1为微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备工艺流程。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
液体菌液的组成：
一种用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，它是由芽孢菌和乳酸菌组合而成；芽孢菌与乳酸菌接种的体积份数比为2:1（v/v），所述芽孢菌指的是芽孢B1与芽孢菌B2，B1 B2接种比例为1:1（v/v），所述乳酸菌指的是：乳酸菌R1和乳酸菌R2，R1和R2接种比例为1:2（v/v）；其中芽孢菌B1指的是枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.504），芽孢菌B2指的是解淀粉芽孢杆菌（CGMCC3413），乳酸菌R1指的是凝结芽孢杆菌（CGMCC1.1322），乳酸菌R2指的是粪肠球菌（CGMCC1.130）。
实施例2
微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法
通过上述多次实验研究，最终微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法如下：
1）将乳酸菌在MRS培养基液体42℃ 静置培养24h，芽孢菌在LB培养基35℃,200转/分钟，震荡培养18h，得到乳酸菌种子液和芽孢菌种子液；
LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 10，pH7.5。
MRS培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸出粉5，葡萄糖5，CH3COONa 5，柠檬酸二胺2，吐温80 1，K2HPO4 2，MgSO4•7H2O 0.2，MnSO4•7H2O 0. 05，pH6.2。
2）将植物性原料粉碎，与水混合均匀，加热到100℃，维持时间10min；
3）待温度降到30℃左右，接种液体微生物种子液，微生物种子液是由芽孢菌、乳酸菌混菌组合而成。芽孢菌与乳酸菌混合种子液总计接种量为4%（v/w），其中芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1（v/v），芽孢菌B1与芽孢菌B2接种比例为1:1（v/v），乳酸菌R1和乳酸菌R2接种比例为1:2（v/v），料水比为1:3（w/w）。混合均匀后装入塑料桶或不锈钢桶内发酵； 30℃发酵3天。在此工艺条件下制备的发酵保育期仔猪液态饲料，还原糖含量较发酵前提高了1.56%，乳酸含量达到4.0%，消除大肠杆菌对饲料的污染。
实施例3
通过上述多次实验研究，最终微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法如下：
1）将乳酸菌在MRS培养基液体42℃ 静置培养24h，芽孢菌在LB培养基35℃,200转/分钟，震荡培养18h，得到乳酸菌种子液和芽孢菌种子液；
LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 10，pH7.5。
MRS培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸出粉5，葡萄糖5，CH3COONa 5，柠檬酸二胺2，吐温80 1，K2HPO4 2，MgSO4•7H2O 0.2，MnSO4•7H2O 0. 05，pH6.2。
2）将植物性原料粉碎，与水混合均匀，加热到100℃，维持时间10min；
3）待温度降到30℃左右，接种液体微生物种子液，微生物种子液是由芽孢菌、乳酸菌混菌组合而成。芽孢菌与乳酸菌混合种子液总计接种量为6%（v/w），其中芽孢菌与乳酸菌接种比例为3:1（v/v），芽孢菌B1与芽孢菌B2接种比例为1:1（v/v），乳酸菌R1和乳酸菌R2接种比例为1:2（v/v），料水比为1:3.5（w/w）。混合均匀后装入塑料桶或不锈钢桶内发酵； 20℃发酵5天。在此工艺条件下制备的发酵保育期仔猪液态饲料，还原糖含量较发酵前提高了1.56%，乳酸含量达到4.0%，消除大肠杆菌对饲料的污染。
实施例4
以该方法制作的微生物发酵保育期仔猪液态饲料，饲喂7日龄-35日龄仔猪，共24只，分两个处理组，每个处理组三个重复，对照组饲喂全价粉料，试验组微生物发酵保育期仔猪液态饲料替代50%全价粉料。
试验仔猪断奶后立即转入保育舍，圈舍均为高床平养，保持舍内通风顺畅。试验组采用以食槽无剩余料为原则，自由采食和饮水，每天在早上08:00、中午12: 00、下午 17: 00和晚上21:00等4个时间点定时饲喂，乳头式饮水器饮水，猪舍温度控制在25-30℃ ， 每天打扫2次猪舍。其他日常管理按常规进行。
表10 全价粉料与微生物发酵保育期仔猪液态饲料饲喂效果
(1)微生物菌体本身就是良好的饲料蛋白质，其蛋白质含量高，且氨基酸组成与动物所需氨基酸组成更为相似，更容易被消化吸收，因此料肉比降低8.65%；
(2)植物性蛋白质经微生物发酵后，大分子蛋白质被降解为小分子物质，而且植物性蛋白质的抗原特性降低，提供了生物活性物质，如功能性多肽、 酶等，改善了饲料口味，提高了饲料的适口性，日采食量提高1.96%。
(3) 植物中往往含有一些抗营养因子， 如胰蛋白酶抑制因子和植酸磷等， 容易影响幼龄动物小肠中营养物质的吸收利用， 但玉米和豆粕等大原料经过发酵后， 可消除或减少上述抗营养因子， 并将植物蛋白降解为小肠更容易吸收的小肽、寡肽和游离氨基酸，微生物发酵还将产生很多酶，如蛋白酶、 脂肪酶和淀粉酶等，都能大大提高饲料的消化吸收率，日增重提高11.68%。
(4)由于微生物发酵减少了饲料中的抗营养因子，增加了饲料消化吸收效率，而且发酵饲料中的益生菌改善肠道的微生态环境，使仔猪腹泻率下降54.88%。