本发明属于畜牧业动物营养技术研究领域，涉及一种以丁酸梭菌为饲料添加剂的饲料配方，更具体的说是一种改善断奶仔猪肠道屏障功能、调节细胞因子含量、D-乳酸（D-lactic）和二胺氧化酶（DAO）等方面的应用。
背景技术：
肠道是食物在体内消化吸收的主要场所，同时也是重要的免疫器官。肠道处在机体与外界接触的第一线，是病原微生物侵入体内的主要通道，肠粘膜屏障是组织机体受病原微生物的感染，调节新陈代谢，维持内外环境平衡的关键。机械屏障是一种重要的肠黏膜屏障，由肠道上皮细胞和细胞间紧密连接等构成，而肠上皮细胞的机械屏障是黏膜屏障基础，紧密连接蛋白在加强细胞间连接，减小细胞间间隙，保护细胞和黏膜完整性中具有重要作用。肠黏膜屏障能够阻止消化道内有害大分子入侵，保证机体选择性吸收小分子物质。因此，肠黏膜屏障在维持肠道正常生理功能方面起着关键作用。
抗生素类生长促进剂在饲料工业中的大量使用导致诸多问题出现，如病原菌产生耐药性、动物免疫机能下降、体内菌群失调、畜禽产品中的药物残留等。近年来，畜牧业养殖在保障动物健康、促进动物生长、提高饲料利用率等方面越来越得到重视，饲料添加剂的研究正在向着无残留、无耐药性和对人类健康和环境无危害的方向发展。丁酸梭菌具有耐热、耐酸和耐多种抗生素等生物学特性，可调节肠道微生态平衡、产生益生物质、提高机体免疫力及促进动物生长，同时具有无污染、无有害残留等特点，逐渐成为热门的抗生素替代品之一。虽然我国农业部已于2009年7月批准了丁酸梭菌制剂作为微生物饲料添加剂的使用，但目前丁酸梭菌制剂还未被普遍的作为益生菌剂添加于动物饲料，而在仔猪上应用的相关报道还不多见。
仔猪断奶是养猪生产中的一个重要阶段，断奶应激是仔猪出生后经受的最大应激，由于生理、饲料和环境的改变常常造成仔猪肠消化系统损伤及菌群失衡等，因此仔猪肠道健康的营养调控这一领域的创新性有待于提高。通过在日粮中添加丁酸梭菌我们研究了一种调节改善仔猪肠道屏障功能的配合饲料，以此来改善仔猪肠道发育和健康的营养调控，会在一定程度上提高养殖业的经济效益。
技术实现要素：
本发明的一个目的是公开了一种调节仔猪肠道屏障功能的配合饲料。
本发明的另一个目的是公开了所配制的饲料对断奶仔猪肠道屏障功能调节的应用效果。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容
一种调节仔猪肠道屏障功能的配合饲料，其特征在于在饲料原料中使用丁酸梭菌饲料添加剂，进行合理配制日粮，由下述重量份数的原料组成：
玉米61—65 豆粕15—20 乳清粉3—6
鱼粉5—10 葡萄糖1-3 酸化剂0.1-0.5
磷酸氢钙0.5-1 石粉0.5-1 食盐0.1-0.5
L-赖氨酸盐酸盐0.1-0.5 DL-蛋氨酸0.1-0.5 苏氨酸0.1-0.5
仔猪预混料1-4 丁酸梭菌0.001-0.01（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明所述酸化剂指的是安徽华扬农牧科技有限公司产品，主要成分是乳酸、正磷酸、柠檬酸、富马酸、甲酸。
本发明所述的断奶仔猪配合饲料的制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
本发明一个优选的配方：
玉米63.2豆粕19乳清粉4.8
鱼粉8.4葡萄糖1酸化剂0.3
磷酸氢钙0.6 石粉0.7食盐0.3
L-赖氨酸盐酸盐0.3 DL-蛋氨酸0.1苏氨酸0.1
仔猪预混料1 丁酸梭菌0.005（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明另一个优选的配方：
玉米64.1豆粕18.5乳清粉4.9
鱼粉7.2葡萄糖2 酸化剂0.3
磷酸氢钙0.6石粉0.7 食盐0.3
L-赖氨酸盐酸盐0.1 DL-蛋氨酸0.1苏氨酸0.1
仔猪预混料1 丁酸梭菌0.006（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明进一步公开了所配制的饲料对断奶仔猪肠道微生物区系的应用效果。特别是对改善断奶仔猪肠道黏膜发育等方面的应用。本发明的断奶仔猪配合饲料实验结果表明：
日粮中添加丁酸梭菌后，显著提高了紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达，显著提高了血清中TNF-α和IL-10的分泌量，显著降低了血清中D-lactin的浓度，血清中DAO的浓度也有下降趋势，表明该饲料配方能有效提高仔猪肠道屏障功能。
为了更进一步说明本发明的积极效果，提供如下的试验方法及结果：
1．试验动物及分组：
采用单因子试验设计，选取体重6.95 ± 0.48 kg的健康杜×长×大三元杂交断奶仔猪12头，随机分为2个处理，每个处理分为6个重复，每个重复1头猪。每个处理组分别饲喂不同日粮：饲喂基础日粮(NC)、饲喂基础日粮+0.005%丁酸梭菌（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g，试验组）。丁酸梭菌为市售产品。
2．基础饲粮配方及营养水平：
根据NRC（1998）配制猪基础日粮配方及营养水平如表1所示。
表1 基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）
a 每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
b 根据NRC（1998）饲料成分表计算。
3．试验规程：
试验在一个商品万头猪场进行，试验期14天。饲喂、管理、免疫按猪场规定程序进行。饲喂14天后，从每个处理的每个重复组中随机选取1头断奶仔猪屠宰，屠宰前抽血，进行血液指标的分析，每个处理屠宰3头仔猪，并取空肠肠段进行紧密连接蛋白表达量的测定。整个试验过程中观察仔猪的健康状况，记录死、淘仔猪以及腹泻、用药情况。
4．测定指标：
血液指标的测定：每个处理随机选3头仔猪，屠宰前30min，前腔静脉采血，4℃，4000g，15min离心，取上清，-20℃保存。采用生化法测定DAO，采用ELISA法测定TNF-α、IL-10和D-lactic。空肠中紧密连接蛋白表达的测定：采血后处死，立即在无菌条件下打开腹腔，从空肠中段取5cm左右肠管，用PBS冲洗肠腔后分装于冻存管中，分别标号后即置于液氮中保存，用qPCR检测Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达。
5．统计分析：
采用SAS统计软件下的Compare Means模块中的One-Way ANOVA进行方差分析，并采用Duncan’s多重比较进行组间差异显著性检验，P<0.05为差异显著。
本发明公开的调节仔猪肠道黏膜的配合饲料在断奶仔猪饲料中的应用效果，主要包括：
（1）血清指标：
由表2可知，丁酸梭菌：试验组显著提高了血液中TNF-α和IL-10的含量（P<0.05），分别比对照组提高了34.25%和27.23%，显著降低了血液中D-lactic的浓度（P<0.05），比对照组降低了19.57%，DAO的浓度比对照组降低了13.07%。
表2 对仔猪血液指标的影响
（2）肠粘膜屏障：
由表3可知，紧密连接蛋白mRNA水平表达：试验组的Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达量显著高于对照组（P＜0.01），试验组中的Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达量比对照组分别提高了59.00%、107.00%、59.00%。
表3 对肠道连接蛋白mRNA表达的影响
试验结果表明：
日粮中添加丁酸梭菌后，显著提高了显著提高了Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA水平的表达量，表明该饲料配方能有效提高仔猪肠道屏障功能；
本发明对以丁酸梭菌为饲料添加剂的饲料配方进行了安全性实验，其方法如下：
（1）步骤：
材料和方法：选择28日龄断奶的杜×长×大仔猪6头，临床健康、发育正常，试验期30天，试验期内随时观察中毒表现及死亡情况。
（2）饲喂的仔猪饲料原料组成：
玉米63.55、豆粕19.5、乳清粉4、鱼粉7.4、葡萄糖2、酸化剂0.3、磷酸氢钙0.5、石粉0.6、食盐0.35、L-赖氨酸盐酸盐0.2、DL-蛋氨酸0.25、苏氨酸0.15、仔猪预混料1.1、丁酸梭菌0.01（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）。
结果：给断奶仔猪饲喂上述试验日粮，连续饲喂30天，未见明显中毒现象，观察期内无死亡，尸检中各主要脏器未见明显异常。
（3）结论：断奶仔猪日粮中添加0.01%丁酸梭菌（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）饲喂仔猪，饲喂效果安全。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作一步说明，但不作为本发明的限制。本发明的实施例中所述的重量份数原料指的是克、公斤或吨，可根据生产实际的需要加以调整。本发明所用到的各种原料例如：磷酸氢钙、石粉、食盐、L-赖氨酸盐酸盐、DL-蛋氨酸、苏氨酸、丁酸梭菌对外均有售；其中下面的产品均有市售：
酸化剂指的是安徽华扬农牧科技有限公司产品；
1%仔猪预混料购买于北京博农利生物科技有限公司；
玉米指的是普通市售二级玉米；
豆粕指的是中粮集团有限公司产品；
乳清粉指的是天津市升腾饲料有限公司产品；
鱼粉指的是进口秘鲁鱼粉；
豆奶宝指的是天津市新概念生物技术有限公司产品；
次粉指的是河北永生食品有限公司产品；
葡萄糖指的是天津市升腾饲料有限公司产品；
丁酸梭菌指的是洛阳瑞莱生物工程有限公司产品。
实施例1
断奶仔猪的配合饲料原料组成：
玉米62.48、豆粕18.5、乳清粉5、鱼粉8.5、葡萄糖1.5、酸化剂0.2、磷酸氢钙0.7、石粉0.63、食盐0.34、L-赖氨酸盐酸盐0.25、DL-蛋氨酸0.3、苏氨酸0.3、仔猪预混料1.2、丁酸梭菌0.001（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）。
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例2
断奶仔猪的配合饲料原料组成：
玉米64.9、豆粕16、乳清粉5、鱼粉8.6、葡萄糖1.5、酸化剂0.4、磷酸氢钙0.65、石粉0.7、食盐0.35、L-赖氨酸盐酸盐0.3、DL-蛋氨酸0.25、苏氨酸0.25、仔猪预混料1、丁酸梭菌0.01（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）。
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例3
采用断奶仔猪的配合饲料饲喂断奶仔猪的方法：
此系列配方适用28日龄断奶仔猪，适用期为断奶后30~45天，根据情况让仔猪自由采食即可，必须提供充足的饮水，其他按正常的饲养管理进行。
实施例4
比较试验
常规的断奶仔猪饲料：
方法：配制玉米-豆粕型断奶仔猪日粮，不添加丁酸梭菌。选择28日龄6头仔猪，试验期14天。试验结束后对3头仔猪进行屠宰，采血、取空肠肠段。
步骤：采用生化法和ELISA试剂盒测定血液指标，qPCR测定Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达。
结果：血清中D-lactin和DAO的浓度分别为2.15 mmol/L、3.75 mmol/L，TNF-α和IL-10的含量分别为41.42ng/L和58.91ng/L。Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA水平表达量分别为0.96、0.99、0.97。
日粮中添加含丁酸梭菌后饲料：
方法：配制玉米-豆粕型断奶仔猪日粮，添加0.005%丁酸梭菌（冻干粉中活菌含量为1×1010CFU/g）。选择6头28日龄仔猪，试验期14天。试验结束后随机选3头仔猪进行采血、取空肠肠段。
步骤：采用生化法测定DAO，采用ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-10和D-lactic。采用qPCR测定Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达。
结果：血清中D-lactin和DAO的浓度分别为1.67mmol/L、3.26mmol/L，TNF-α和IL-10的含量分别为77.16 ng/L和64.59 ng/L。Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达分别为1.55、2.03、1.41。
结论：日粮中添加丁酸梭菌能提高仔猪肠道屏障功能。通过比较试验说明：日粮中添加丁酸梭菌能调节断奶仔猪肠道屏障功能，改善肠道健康和提高仔猪整体健康状况。