微生物复合制剂高效降解腌鱼中亚硝酸盐的方法与流程

一种微生物复合制剂高效降解腌鱼中亚硝酸盐的方法，涉及微生物技术和食品工艺技术领域，用于对腌鱼中亚硝酸盐的降解。

背景技术：

腌鱼具有营养丰富、风味浓郁、便于贮藏、食用方便等特点，具有悠久的加工和食用历史，目前在国内及东南亚沿海地区拥有广阔的消费市场。亚硝酸盐作为防腐剂及发色剂常用于腌鱼的加工生产过程中。少量的亚硝酸盐具有一定的药用效果，但是较大剂量的亚硝酸盐会对人体健康会造成非常大的损害。其危害表现为以下两方面：一方面，亚硝酸盐能够和血红蛋白相结合，产生高铁血红蛋白，使红细胞失去携带氧的功能，身体上一般会出现青紫的症状，严重的可能会造成生命危险；另一方面，亚硝酸盐能够在人体胃内形成亚硝胺，这种物质是强致癌因子。流行病学调查表明，沿海地区经常食用腌制水产品的人群胃癌发病率较高，这与腌制水产品中亚硝酸盐含量较高关系密切。因此，如何确保腌鱼等传统水产食品的食用安全性，更好地在国内外市场流通，是当前腌制水产品加工业急需解决的问题之一。

乳酸菌具有降解亚硝酸盐的特性，且乳酸菌大多为益生菌，通过将具有高效降解亚硝酸盐特性的优良乳酸菌运用于腌鱼中，具有较高的可行性。目前许多研究利用单一乳酸菌或者混合乳酸菌发酵制备发酵香肠、泡菜等发酵食品，获得品质和风味更好的产品，但对于在腌鱼中的应用甚少。乳酸菌的生长温度范围较广，适宜生长温度范围为20℃～40℃，可以在nacl浓度为0～10％的范围内生长，当nacl浓度达到或超过20％时，基本无生长迹象。腌鱼的盐含量一般在5％～15％，大部分乳酸菌都可以生长。将乳酸菌应用在腌鱼中具有可行性和安全性。

研究表明混合乳酸菌相较于单一乳酸菌发酵，获得的产品品质更佳。因此本专利选择耐盐浓度高、亚硝酸盐降解效果较好的三种乳酸菌：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)、戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus，p.pentosaceus)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis，l.brevis)制备发酵液，在不同发酵温度、发酵时间和菌接种量的条件下，测量鱼肉在发酵前后亚硝酸盐、过氧化值、tvb-n、组胺(国家标准中的理化指标)含量的变化，得到鱼肉品质较好的工艺条件。

技术实现要素：

微生物复合制剂高效降解腌鱼中亚硝酸盐的方法：将l.plantarum、p.pentosaceus、l.brevis以1:1:1的比例，含量分别为1.0×10⁸cfu/ml灭菌生理盐水，制备成发酵液。将快速腌制好的鱼肉置于发酵液中30℃发酵24h，得到亚硝酸盐、过氧化值、tvb-n、组胺含量较低的产品，鱼肉的品质更佳。

具体实施步骤为：

(1)将l.plantarum、l.plantarum、l.brevis挑取单菌落转接于mrs液体培养基中，于37℃恒温培养18h。4℃、5000rpm离心15min，用无菌生理盐水重悬后，再次离心重复操作三次，采用活菌计数法，对菌体浓度进行计数，并用生理盐水稀释到1.0×10¹⁰cfu/ml，于4℃冰箱保存备用。

(2)将新鲜草鱼去鳞、去内脏、去皮，均匀切成长宽约4cm、厚约1cm的方块，自然条件下沥干水，置于60mg/l的亚硝酸钠溶液中浸泡1h。将鱼肉取出沥干溶剂，精确称量10％的食盐均匀涂抹在鱼肉表面并放置在密封罐中15℃腌制6h。腌制过后淋干盐水浸入配制好的发酵液中，在不同的发酵温度下发酵一定时间后取出干燥则得到最终产品。

(3)将腌鱼平均分成四份，分别浸泡在l.plantarum、l.plantarum，l.brevis比例为1：1：1，各含1.0×10⁶cfu/ml生理盐水的发酵液中，并分别置于20℃、30℃、37℃、45℃条件下恒温培养。所有样品在发酵时间为0h、12h、24h、36h时分别取样，以未接种的发酵液作空白对照。取出的样品研碎置于密封袋中-20℃保存待测

(4)将腌鱼平均分成四份，浸泡在l.plantarum、l.plantarum、l.brevis比例为1：1：1，各含1.0×10⁴、1.0×10⁶、1.0×10⁸、1.0×10¹⁰cfu/ml生理盐水的发酵液中。30℃条件下恒温培养。分别在发酵时间为0h、12h、24h、36h时取样，以未接种的发酵液作空白对照。取出的样品研碎置于密封袋中-20℃保存待测。。

(5)亚硝酸盐的测量

称取5g(精确至0.01g)制成匀浆的试样，置于50ml烧杯中，加12.5ml饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300ml将试样洗入500ml容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。在振荡上述提取液时加入5ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5ml乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30ml，滤液备用。

吸取40.0ml上述滤液于50ml带塞比色管中，另吸取0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml亚硝酸钠标准使用液，分别置于50ml带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min～5min后各加入1ml盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

(6)过氧化值的测量

应避免在阳光直射下进行试样测定。称取试样2g～3g(精确至0.001g)，置于250ml碘量瓶中，加入30ml三氯甲烷-冰乙酸混合液,轻轻振摇使试样完全溶解。准确加入1.00ml饱和碘化钾溶液，塞紧瓶盖，并轻轻振摇0.5min，在暗处放置3min。取出加100ml水，摇匀后立即用0.01mol/l硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，滴定至淡黄色时，加1ml淀粉指示剂，继续滴定并强烈振摇至溶液蓝色消失为终点。同时进行空白试验。

(6)tvb-n的测量

直接绞碎搅匀称取试样10g，置于具塞锥形瓶中，准确加入100.0ml水,不时振摇,试样在样液中分散均匀，浸渍30min后过滤，滤液应及时使用，不能及时使用的滤液置冰箱内0℃～4℃冷藏备用。

将水溶性胶涂于扩散皿的边缘，在皿中央内室加入硼酸溶液1ml及1滴混合指示剂。在皿外室准确加入滤液1.0ml，盖上磨砂玻璃盖,磨砂玻璃盖的凹口开口处与扩散皿边缘仅留能插入移液器枪头或滴管的缝隙，透过磨砂玻璃盖观察水溶性胶密封是否严密，如有密封不严处，需重新涂抹水溶性胶。然后从缝隙处快速加入1ml饱和碳酸钾溶液，立刻平推磨砂玻璃盖，将扩散皿盖严密，于桌子上以圆周运动方式轻轻转动，使样液和饱和碳酸钾溶液充分混合，然后于37℃±1℃温箱内放置2h,放凉至室温,揭去盖，用盐酸或硫酸标准滴定溶液(0.0100mol/l)滴定。使用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液混合指示液，终点颜色至紫红色。使用2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液混合指示液，终点颜色至蓝紫色。同时做试剂空白。

(7)组胺的测量

称取5.000～10.00g搅碎并混合均匀的试样，置于具塞锥形瓶中，加入15ml～20ml三氯乙酸溶液，浸泡2h～3h，过滤。吸取2.0ml滤液，置于分液漏斗中，加氢氧化钠使呈碱性，每次加入3ml正戊醇，振摇5min，提取三次，合并正戊醇并稀释至10.0ml吸取2.0ml正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加3ml盐酸(1+11)振摇提取三次，合并盐酸提取液并稀释至10.0ml，备用。

吸取2.0ml盐酸提取液于10ml比色管中，另吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0ml组胺标准使用液，分别置于10ml比色管中，加水1ml，再各加1ml盐酸(1+11)。试样与标准管各加3ml碳酸钠溶液(50g/l)，3ml偶氮试剂，加水至刻度，混匀，放置10min后用1cm比色杯以零管调节零点，于480nm波长处测吸光度，绘制标准曲线比较。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

当发酵液中l.plantarum：p.pentosaceus：l.brevi＝1：1：1＝1.0×10⁸cfu/ml，发酵温度为30℃，发酵时间为24h时，亚硝酸盐降解量达到84.34％，过氧化值、挥发性盐基氮、组胺含量均下降至较低水平，分别为0.41mg/100g、11.05mg/100g、11.58mg/100g。利用乳酸菌发酵液发酵的方式能够有效地降解腌制鱼类中的亚硝酸盐含量，明显改善腌制鱼类的风味和品质，对于提高腌鱼的食用安全性和工业化生产提供了技术支持。

本发明的优点是：

(1)l.plantarum、p.pentosaceus、l.brevis三种乳酸菌是有益菌，可以有效抑制有害菌的生长，高效降解亚硝酸盐，可以有效解决腌鱼中因亚硝酸盐过高而导致的食品安全问题；

(2)短时间的发酵既可以满足乳酸菌的生长条件，又可以使提高腌鱼的品质，改善腌鱼的风味，进一步优化了腌鱼的工艺。

附图说明

图1：不同发酵温度下腌鱼中亚硝酸盐含量随时间的变化:对照组发酵液中未接种菌种；试验组发酵液中接种了乳酸菌：20℃发酵；●：30℃发酵；37℃发酵；45℃发酵；

图2：不同菌接种量时腌鱼中亚硝酸盐含量的变化：菌接种量为0；菌接种量1.0×10⁴cfu/ml；菌接种量1.0×10⁶cfu/ml；菌接种量1.0×10⁸cfu/ml；菌接种量1.0×10¹⁰cfu/ml；

图3：不同发酵温度下腌鱼中过氧化值随时间的变化：对照组发酵液中未接种菌种；试验组发酵液中接种了乳酸菌：20℃发酵；●：30℃发酵；37℃发酵；45℃发酵；

图4：不同接种量时腌鱼中过氧化值的变化：菌接种量为0；菌接种量1.0×10⁴cfu/ml；菌接种量1.0×10⁶cfu/ml；菌接种量1.0×10⁸cfu/ml；菌接种量1.0×10¹⁰cfu/ml；

图5：不同发酵温度下腌鱼中亚硝酸盐含量随时间的变化:对照组发酵液中未接种菌种；试验组发酵液中接种了乳酸菌：20℃发酵；●：30℃发酵；37℃发酵；45℃发酵；

图6：不同接种量时腌鱼中tvb-n含量的变化：菌接种量为0；菌接种量1.0×10⁴cfu/ml；菌接种量1.0×10⁶cfu/ml；菌接种量1.0×10⁸cfu/ml；菌接种量1.0×10¹⁰cfu/ml；

图7：不同发酵温度下腌鱼中tvb-n含量随时间的变化：对照组发酵液中未接种菌种；试验组发酵液中接种了乳酸菌：20℃发酵；●：30℃发酵；37℃发酵；45℃发酵；

图8：不同接种量时腌鱼胺含量的变化：菌接种量0；菌接种量1.0×10⁴cfu/ml；菌接种量1.0×10⁶cfu/ml；：菌接种量1.0×10⁸cfu/ml；：菌接种量1.0×10¹⁰cfu/ml。