一种新型含石榴皮复合植物提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种复合植物水提物及其在饲料及动物保健产品领域的应用，尤其涉及一种新型含石榴皮复合植物提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
：饲用抗生素曾对畜禽养殖业的发展起到了不可磨灭的贡献，但其耐药性和药物残留等问题也日益凸显。抗生素被禁用后，抗生素替代品的研究也就理所当然成为养殖业内首要解决的问题。植物提取物因富含蛋白、糖苷和酚酸等多种活性成分，兼具抑菌、抗氧化、抗应激、抗病毒和免疫调节等功能，且不易产生细菌耐药性和药物残留等问题，成为抗生素替代品的研究热点。但目前所研究的提取物大多是从单种植物原料中提取，因此往往存在生物活性成分含量较低、功能单一、效果不显著等问题。而对于复合提取物而言，又存在复方科学性不强、添加量过高、成本昂贵等缺陷。因此，若能筛选出具有多种功能、且性价比较高的复合植物提取物用于替代仔猪饲用抗生素，无疑可解决畜牧养殖业的一大难题。申请人前期研制的复方植物提取物在断奶仔猪上具有较好促生长及替代饲用抗生素效果，但因价格昂贵、添加量大等问题，限制了它的应用前景。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种复合植物水提物，用于替代饲用抗生素，最终实现“环保、无毒、安全和绿色”的养殖目标。本发明的第二个目的是提供上述的复合植物水提物的制备方法，该方法工艺简易，成本低。本发明的第三个目的是提供上述的复合植物水提物的应用。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：一种新型含石榴皮复合植物提取物，该植物水提物按质量百分比计由以下的组分的植物原料提取制得：石榴皮2.94％柠檬38.24％桂枝26.47％青蒿17.54％厚朴14.71%。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：上述的复合植物水提物的方法，该方法包括以下的步骤：1）将植物原料研磨粉碎、混合，按料水比1：20放入提取设备槽内，升温至80℃，提取6h后转至浓缩槽内，在0.085mpa、60℃条件下浓缩比重至1.25；2）将浓缩产物转至喷雾干燥设备，在进风温度150℃、空气流量500l/h、进料量20％条件下对其进行喷雾干燥。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：上述的复合植物水提物用于制备代替抗生素的动物饲料添加剂中的应用。本发明还提供了一种动物饲料添加剂，动物饲料添加剂包所述的复合植物水提物。本发明还提供了一种动物饲料，动物饲料包括权所述的复合植物水提物。综上所述，本发明采用的技术方案如下：（1）为了实现本发明的首要目的，首先摸索建立了一套适用于提取植物多种活性成分的简易工艺参数：料水比1：20、80℃提取6h后，在60℃下浓缩提取液比重至1.25，再进行喷雾干燥(进风温度150℃、空气流量500l/h、进料量20％)。（2）然后以体外抗炎、抑菌和抗氧化能力为评价指标，初步从23种植物原料中筛选出复合植物提取物的原料组成：石榴皮、厚朴、桂枝、青蒿和柠檬。原来配方原料为：石榴皮、艾叶、南五味子和吴茱萸。（3）进一步通过正交组合实验明确复合植物提取物的配方（石榴皮1g，桂枝9g，青蒿6g，厚朴5g和柠檬13g）及验证其抑菌功能（mic为125mg/ml）抗炎(ic50为0.434mg/ml)和抗氧化能力(ic50为0.31mg/ml)。原来配方（石榴皮1g，艾叶3g，南五味子9g和吴茱萸9g）及验证其抑菌功能（mic为250mg/ml）和抗氧化能力(ic50为6.46mg/ml)，未检测其抗炎活性。（4）分别给小鼠连续灌胃125、250、500、1000mg/kg·bw-1剂量的复方提取物21天，小鼠精神状态良好，毛色光亮、未见异常死亡现象，经综合分析后，复合植物提取物的最佳添加量应在250mg/kg·bw-1左右。（5）在小鼠饮水中添加0.6mg/ml（相当于200mg/kg·bw-1剂量）21天，可使小鼠日增重显著提高13.3%（p<0.05）。原来配方未做此内容研究，仅发现在每天给小鼠灌胃1000mg/kg·bw-1剂量，连续灌胃14天，可使小鼠日增重具有提高趋势。（6）在小鼠饮水中添加0.6mg/ml（相当于200mg/kg·bw-1剂量）21天，小鼠进行lps造模处理后，可降低小鼠的腹泻率，显著提高小肠的绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的值（p<0.05）。（7）与原来配方相比，本发明的复合植物提取物在小鼠上的用量仅为原来配方的20％，在很大程度上提高了其性价比，在畜禽养殖中具有较好应用前景。本发明的优点如下：1、本发明摸索建立了一套适用于提取植物多种活性成分的简易工艺，适用于各中小型企业加工、生产。2、本发明中用于组成复合植物提取物的几种植物原料均属低价或中等价位、且在国内资源丰富、性价比高。3、与原来配方相比，保留了性价比较高的石榴皮，极大地降低了复方的成本并可显著降低在仔猪上的应用剂量。附图说明图1为lps注射4小时后小鼠空肠绒毛的光镜切片图。图1a为正常对照组（生理盐水注射4h），图1b为lps组（lps注射4h）,图1c为复合植物提取物组（lps注射4h）。图2为lps注射24小时后小鼠空肠绒毛的光镜切片图。图2a为lps组（lps注射24h）,图2b为复合植物提取物组（lps注射24h）。具体实施方式一、植物原料的提取、筛选、复方活性成分检测1、提取包括青蒿、女贞子、柠檬、泽漆、桂枝、石榴皮、柠檬、刺五加、牛膝、绞股蓝、银杏、秦皮、鱼腥草、补骨脂、厚朴、香附子、茵陈蒿、迷迭香、肉桂、白术、淫羊藿、甘草、竹叶、蚊子草等23种植物原料。2、提取工艺：将植物原料研磨粉碎，按料水比1：20放入提取设备槽内，升温至80℃，提取6h后转至浓缩槽内，在0.085mpa、60℃条件下浓缩比重至1.25。将浓缩产物转至喷雾干燥设备，在进风温度150℃、空气流量500l/h、进料量20％条件下对其进行喷雾干燥。3、抑菌率测定：以大肠杆菌c83912为受试菌株，提取物生药浓度均为0.5g/ml、按体积比1：10加至各培养基、接种菌液为1：1000，在酶标板上于37℃、210r/min培养24h，600nm测od值。抑菌率计算公式为：表1植物水提物对大肠杆菌的抑菌率提取物种类桂枝香附子茵陈蒿女贞子淫羊藿肉桂抑菌率+++————+++提取物种类泽漆绞股蓝牛膝厚朴白术甘草抑菌率———+—++提取物种类银杏叶秦皮蚊子草迷迭香石榴皮刺五加抑菌率++—+—++++提取物种类青蒿补骨脂柠檬竹叶鱼腥草抑菌率+++————注：+++抑菌率>50%，++抑菌率在30%~50%，+抑菌率<30%，—无抑菌效果通过以上研究（表1），筛选出抑菌率较强的植物原料为：石榴皮、桂枝和青蒿。4、抗炎率测定：紫外分光光度计测定23种植物水提物对脂肪氧化酶（lox）活性的抑制率来表征植物水提物的体外抗炎活性。具体操作如下：（1）试验组：取1μl0.5g/ml的中药材水提物加入至已含20μl酶液的1.5mleppendorf管中，30℃水浴30min后，加入150μl底物，30℃反应3min，加入500μl无水乙醇终止反应，然后加入500μl蒸馏水混匀待测；（2）阳性对照组：以1μl蒸馏水替代中药材水提物，其余步骤同（1）；（3）阴性对照组：取1μl中药材水提物，以20μl蒸馏水取代酶液，其余步骤同（1）；（4）空白对照组：以1μl蒸馏水替代中药材水提物，在加底物之前先加入500μl无水乙醇终止反应，其余步骤同（1）。各取200μl待测液至96孔紫外检测板，在酶标仪上选取234nm波长检测反应液的吸光度od值。中药材水提物的抑制活性以抗炎率表示，公式如下：oda、odb、odc、odd分别表示试验组、阳性对照组、阴性对照组、空白对照组的od值。表2植物水提物对脂肪氧化酶的抑制活性（抗炎率）提取物种类桂枝香附子茵陈蒿女贞子淫羊藿肉桂抗炎率（％）68.0612.072.0120.072.385.66提取物种类泽漆绞股蓝牛膝厚朴白术甘草抗炎率（％）89.3432.786.7191.255.881.13提取物种类银杏叶秦皮蚊子草迷迭香石榴皮刺五加抗炎率（％）23.547.488.9290.8496.0634.29提取物种类青蒿补骨脂柠檬竹叶鱼腥草抗炎率（％）——91.47——注：—无抗炎效果通过以上研究（表2），筛选出抗炎能力较强的植物原料为：石榴皮、柠檬和厚朴5、抗氧化能力测定：检测提取物生药浓度分别为100、50、25、12.5和6.25mg/ml时，采用酶标板（100µl/孔）在体积比为1：1、37℃、30min条件下对dpph（0.5mg/ml）的清除率，516nm测od值，按公式：计算自由基清除率并利用curveexpert拟合回归方程换算半自由基清除率（ic50）。表3植物水提物对dpph自由基的清除ic50值（抗氧化ic50）提取物种类桂枝香附子茵陈蒿女贞子淫羊藿肉桂抗氧化ic50，mg/ml10.4136.081.042.555.341.5提取物种类泽漆绞股蓝牛膝厚朴白术甘草抗氧化ic50，mg/ml13.081.1199.271.5410.9178.45提取物种类银杏叶秦皮蚊子草迷迭香石榴皮刺五加抗氧化ic50，mg/ml2.870.718.520.310.0850.62提取物种类青蒿补骨脂柠檬竹叶鱼腥草抗氧化ic50，mg/ml2.71149.1720.5625.345.19通过以上研究（表3），筛选出抗氧化能力较强的植物原料为：石榴皮5、正交组合试验：采用l16(54)试验设计（表4），分别制备含柠檬、厚朴、青蒿、桂枝和石榴皮不同比例的16种复合植物提取物并检测其体外抑菌率和抗氧化能力。表4五种植物原料的的正交组合设计表格表5正交设计的各组合植物水提物的体外抑菌率、抗炎率和抗氧化ic50值组合抑菌率（%）抗炎率（%）抗氧化ic50（mg/ml）134.5386.930.82233.7378.530.823-4.9969.550.67436.5375.030.41526.9557.120.29631.7473.070.27717.7679.870.48838.5294.310.69959.0872.210.721079.4491.812.0111-1.2091.670.331279.6492.810.261360.5073.510.291428.5479.710.251581.0493.471.091671.06103.910.72根据正交设计和各组合的抑菌、抗炎和抗氧化结果（表5），采用spps方差分析方法明确抑菌效果的影响因素依次为：厚朴>石榴皮>桂枝>青蒿>柠檬，体外抑菌效果最佳且兼具抑菌和抗氧化功能的组合水平为：石榴皮为1，桂枝为4，青蒿为2，厚朴为4，柠檬为4，各水平相对应的原料质量分别为1g，9g，6g，5g和13g，该复方标记为抑菌复方。采用spps方差分析方法明确抗氧化效果的影响因素依次为：石榴皮>桂枝>厚朴>柠檬>青蒿，体外抗氧化效果最佳且兼具抑菌和抗炎功能的组合水平为：石榴皮为4，桂枝为1，青蒿为1，厚朴为2，柠檬为4，各水平相对应的原料质量分别为7g，1g，4g，3g和13g，该复方标记为抗氧化复方。6.复合植物提取物的制备、抑菌、抗炎和抗氧化活性测定配方：石榴皮2.94％柠檬38.24％桂枝26.47％青蒿17.54％厚朴14.71%。制备方法包括以下的步骤：1）将植物原料研磨粉碎，按料水比1：20放入提取设备槽内，升温至80℃，提取6h后转至浓缩槽内，在0.085mpa、60℃条件下浓缩比重至1.25；2）将浓缩产物转至喷雾干燥设备，在进风温度150℃、空气流量500l/h、进料量20％条件下对其进行喷雾干燥。（1）抗炎ic50值的检测：将水提物等比稀释，测定每个浓度梯度的抗炎率，方法同上。再根据抗炎率和水提物浓度，利用curveexpert软件拟合回归方程，计算抗炎率为50%时水提物浓度，即抗炎ic50。（2）抑菌mic值的检测：采用常量肉汤稀释法。将复方水提物浓缩至生药浓度1g/ml，用mh液体培养基以1:1000比例稀释0.5麦氏接种菌液。取灭菌试管加入1ml无菌肉汤培养基，倍比稀释至各试管中的水提物浓度分别为500、250、125、62.5和31.25mg/ml；并同时制备阳性对照和阴性对照。将所有试管置于37℃恒温培养箱中培养24h。培养结束后，观察细菌生长情况，最低浓度的无菌试管即为该水提物的最小抑菌浓度（mic）。（3）抗氧化ic50值的检测：方法同上。表6抑菌复方和抗氧化复方的抑菌mic、抗炎ic50及抗氧化ic50结果由表6可见，抑菌组方的抑菌mic值为125mg/ml，抗炎ic50值为0.434，抗氧化ic50值为0.31。7.不同剂量的复合植物提取物在小鼠上的应用效果选取54只balb/c雌性小鼠，按体重随机分为3个处理：对照组（灌胃生理盐水），抑菌复方组和抗氧化复方组，两个复方均设125、250、500、1000mg/kg·bw-14个水平（灌胃相应水提液），每个水平6只小鼠，试验期21天。整个饲养试验期间，所有实验小鼠精神状态良好，毛色光亮、未见异常死亡现象；由表7－12可见，2个复方高剂量添加会对小鼠日增重和部分脏器指数造成显著降低（p<0.05），特别是抗氧化复方小鼠的部分脏器指数即使在250mg/kg·bw-1剂量时仍与对照组差异显著（p<0.05）。因此仅对抑菌组方进行了小鼠上的促生长效果研究，且从生长性能来看，添加剂量应为250mg/kg·bw-1左右。表7不同处理组小鼠的日增重及采食量注：同行肩标字母不同者表示与对照组相比有显著性差异p<0.05，下表同表8不同处理组小鼠的脏器指数——肝脏表9不同处理组小鼠的脏器指数——肾脏表10不同处理组小鼠的脏器指数——胸腺表11不同处理组小鼠的脏器指数——脾脏表12不同处理组小鼠的脏器指数——心脏8.抑菌复方对小鼠促生长效果的研究选取60只15g左右的balb/c雌性小鼠，分为2组：对照组（正常饮水），抑菌复方组（饮水中添0.6mg/ml，相当于250mg/kg·bw-1剂量），每组设3个重复，试验期21天。试验结果表明（见表13）：与对照组相比，抑菌复方可使小鼠日增重显著提高13.3%（p<0.05）。表13抑菌复方对小鼠生长性能的影响对照抑菌复方组日采食量g3.11±0.093.25±0.09日增重g0.15±0.01a0.17±0.01b料重比21.21±1.6319.71±0.859.抑菌复方对小鼠肠道健康的保护作用选取45只balb/c雌性小鼠，分为3个处理：对照组（正常饮水）、lps组（正常饮水）、lps＋复方组（饮水中添加0.6mg/ml抑菌复方，相当于250mg/kg·bw-1剂量）），饲养试验至第21天，对照组注射生理盐水，其他2组注射lps，分别于lps注射后4h（每组8只）和24h（每组7只）屠宰、取样。由表14-16和图1-2所示，lps注射后4h试验结果表明：lps组小鼠全部出现腹泻，腹泻率为100％；与对照组相比，空肠隐窝深度cd显著升高（p<0.05），vh/cd显著降低（p<0.05）；与lps组相比，lps＋抑菌复方组小鼠腹泻率为75％，vh/cd均显著升高（p<0.05）。lps注射后24h试验结果表明，lps组小鼠腹泻率降至71.43％，lps＋抑菌复方组小鼠腹泻率降至57.14％，与lps组相比，lps＋抑菌复方组空肠vh和vh/cd均显著升高（p<0.05）。表14lps注射后4h和24h不同处理组小鼠腹泻情况表15lps注射4h后不同处理组小鼠空肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度的值对照组lps组lps+抑菌复方组绒毛高度（vh）474.23±41.25431.55±42.14463.65±37.02隐窝深度（cd）155.90±21.92a225.54±27.05b200.94±10.27b绒毛高度/隐窝深度（vh/cd）3.23±0.28c1.95±0.11a2.37±0.14b表16lps注射24h后不同处理组小鼠空肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度lps组lps+抑菌复方组绒毛高度（vh）331.00±60.26a447.31±79.84b隐窝深度（cd）168.15±15.74a185.58±21.00a绒毛高度/隐窝深度（vh/cd）2.01±0.34a2.46±0.28b当前第1页12