一种植物源家禽饲料抗菌添加剂及其制备方法与流程

本发明属于饲料抗菌添加剂领域，具体涉及一种植物源家禽饲料抗菌添加剂及其制备方法。

背景技术：

在家禽饲养领域，耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)、肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)和空肠弯曲杆菌(c.jejuni)等是家禽类动物极易感染的致病菌。而食用致病菌感染的未经煮熟的禽肉和禽蛋等是人类感染疾病的主要途径。抗生素类药物作为饲料添加剂被广泛用于家禽饲料中，但长期以来由于抗生素的滥用，导致抗生素残留超标和细菌耐药性严重等诸多问题，严重威胁着动物和人体的健康。因此，植物源添加剂作为安全绿色的饲料添加剂逐渐成为近年来研究的热点。植物提取物添加剂在家禽饲料及养殖业中的主要作用表现为：改善适口性和肠道功能，提高采食量；促进唾液和消化液的分泌；抗菌杀菌；抗氧化等。专利cn106260523a公开了一种饲用复合植物精油添加剂及饲料制备方法，以适当的剂量添加到饲料中后起到有效抑制饲料中有害菌的生长，防止动物疾病，且能促进动物采食和提高生产性能。

百里香精油为透明无色或淡黄色液体，是从常绿灌木草本植物中提取出来的芳香精油，具有改善消化系统、促进血液循环、减轻神经性疼痛和抗菌杀菌等功效。因其安全绿色、无毒副作用的优势，在天然食品添加剂的开发中拥有较好的应用前景。专利cn105997561公开了一种酪蛋白-百里香精油脂质体抗菌剂的制备方法及用途，纳米脂质体的包封防止了百里香精油的挥发，提高了其稳定性和利用率，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实现了长效的抗菌效果。另外，百里香精油的主要成分百里香酚是抗氧化性很强的酚类化合物，能防止自由基的破坏，避免过氧化，从而在一定程度上保护饲料油脂和维生素。因此以百里香精油为主要成分的抗菌添加剂在家禽饲料中具有良好的应用前景。

固体脂质体是继脂质体、乳剂、胶束等发展的一种新型纳米载药系统，具有优良的生物相容性、广泛的药物适应性、丰富的给药途径等优点，可避免百里香精油因直接添加到家禽饲料中所出现的易挥发不稳定和浪费等问题。固体脂质体要比普通脂质体稳定性更高，储存时间更长，因此可作为家禽饲料抗菌添加剂的理想传递载体。ε-聚赖氨酸(ε-pl)是由链霉菌产生的一种由l-赖氨酸残基的ε-氨基和α-羧基形成的酰胺键连接而成的天然生物可降解的聚合物。ε-pl是一种聚合阳离子肽，等电点为9.0，在水溶液中带正电荷，能够与表面带负电荷的物质结合。研究表明ε-pl具有广谱抑菌性，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用，且无毒安全可食用。

等离子体(plasma)是指高度电离的气体，气体在受到外界高能量作用时电离产生的由大量带电粒子离子、电子和中性粒子原子、分子所组成的表现为电荷中性的体系。低温等离子体无毒无害且环保。低温等离子体中绝大部分粒子的能量均略高于聚合物中的化学键能，通过电场加速后低温等离子体完全有足够的能量引起聚合物表面的各种化学键发生断裂或重新组合，因而会对分子材料表面进行改性。例如利用等离子体技术处理一些可食用膜，可以改变膜的表面粗糙度，提高膜的表面亲水性。再如用等离子体处理低密度聚乙烯，会提高乳酸链球菌肽的吸附量，对食品达到抗菌保鲜效果。因此，我们可以尝试使用低温等离子体对固体脂质体进行表面处理改性，进一步提高固体脂质体的抗菌效果。

百里香精油封装进固体脂质体，可以解决由于百里香精油的易挥发不稳定性而导致的在实际应用中存在功效期短的问题。ε-pl对纳米脂质体的修饰，一方面可以使纳米脂质体表面携带正电荷，使其成为阳离子型固体脂质体；另一方面可以起到协同抗菌的效果。而采用低温等离子体对固体脂质体进行表面处理改性，可进一步提高抗菌效果。将使用该方法制备的百里香精油固体脂质体用作家禽饲料添加剂，可有效对抗家禽易感致病菌。

技术实现要素：

本发明的目的是公开一种植物源家禽饲料抗菌添加剂及其制备方法。其实质为封装百里香精油的固体脂质体，既解决了百里香精油因易挥发不稳定而影响抗菌效果的问题，又保证了该抗菌添加剂便于添加至家禽饲料，可实现稳定长效抗菌效果。

本发明以百里香精油为主要抗菌剂，制备百里香精油纳米脂质体，并采用具有抗菌性能的阳离子聚合物ε-pl对纳米脂质体进行修饰制备阳离子型脂质体。由于液体脂质体不便直接应用于固体家禽饲料，因此利用冷冻干燥技术将脂质体转化为固体脂质体，最后再利用低温等离子体对固体脂质体进行表面处理改性，进一步提高抗菌效果。

本发明所述百里香精油纳米脂质体的制备方法为薄膜-超声分散法，具体步骤如下：将大豆卵磷脂，胆固醇和百里香精油置于圆底烧瓶中，加入有机溶剂氯仿，超声分散使其充分分散溶解。使用旋转蒸发器蒸发掉有机溶剂，至圆底烧瓶内壁形成光滑的浅黄色脂质薄膜。随后将脂质薄膜放入真空干燥箱中，真空干燥后取出。加入表面活性剂pvp、冷冻保护剂甘露醇以及pbs，水浴超声使其混合均匀，直至形成稳定的乳浊液。将所得乳浊液于细胞超微粉碎仪中破碎，离心将所得产品离心，去除上层精油和下层杂质，用微孔滤膜进行过滤，得到的滤液(乳液状态)即为百里香精油纳米脂质体。

其中大豆卵磷脂、胆固醇、百里香精油、表面活性剂pvp、冷冻保护剂甘露醇的质量比为20:4:5:1:1，其中百里香精油的浓度为5.0mg/ml，表面活性剂pvp的浓度为1.0mg/ml，冷冻保护剂甘露醇的浓度为1.0mg/ml。

所述超声分散指100hz，超声30min。

所述旋转蒸发器的蒸发温度为30-40℃。

所述真空干燥指真空状态60℃下干燥24h。

所述水浴超声指100hz，超声3h。

所述于细胞超微粉碎仪中破碎指工作2.5s，间隙2.5s，功率360w，破碎30min。

所述离心指6000r/min，离心15min。

所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

本发明所述制备百里香精油纳米脂质体时所用的有机溶剂氯仿，可替换为无水乙醇和丙酮两者的混合溶剂(1：1，v/v)，但优选氯仿。

本发明所述制备百里香精油纳米脂质体时所用的表面活性剂pvp可替换为聚山梨醇酯80、f68和胆酸钠的一种或它们的混合物等，但优选pvp。

本发明所述使用阳离子聚合物ε-pl对百里香精油纳米脂质体进行修饰，具体操作如下：首先使用去离子水配制浓度为4.0mg/ml的ε-pl溶液，再将ε-pl溶液逐滴滴加入已制得的百里香精油脂质体中，磁力搅拌通过静电相互作用对百里香精油脂质体进行表面修饰，修饰后的百里香精油脂质体中ε-pl溶液的最终浓度为2.0mg/ml。

所述磁力搅拌指置于磁力搅拌器上，120r/min，搅拌4h。

本发明所述将百里香精油纳米脂质体转化为百里香精油固体脂质体的方法为采用冷冻干燥法，首先将通过静电作用修饰后的百里香精油纳米脂质体置于-80℃冷阱中预冻3h，随后转移至冷冻干燥架真空冷冻干燥48～72h。

本发明所述冷冻干燥时，为防止在冷冻干燥过程中脂质体聚集，需加入支架剂进行冷冻保护，所用支架剂可为甘露醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖和山梨醇的一种或者它们之间的混合物等。

本发明所述采用低温等离子体技术(plasma)对冷冻干燥后的百里香精油固体脂质体进行表面处理改性，其具体操作条件如下：保护气为氮气n2，功率400w，时间2min。

本发明想法新颖，产品结构特殊，充分发挥了各组分的优越性，制备出一种高稳定性、高抗菌性的植物源家禽饲料抗菌添加剂，本发明制得的百里香精油固体脂质体具体优点如下：

(1)采用薄膜-超声分散法制备百里香精油纳米脂质体，该方法比热高压均质法和水性溶剂扩散法等方法制备的纳米脂质体粒径小，而且载药量和包封率均较高。

(2)本产品作为家禽饲料抗菌添加剂，产品质量稳定，生物相容性好。采用冷冻干燥法制成固体脂质体除去水分，使产品稳定性大幅度提高，便于运输且储存时间长，可发挥长效抗菌效果。

(3)固体脂质体具有一定的缓释作用，在一定程度上具有控制百里香精油释放的特性，从而可提高百里香精油的生物利用度，发挥长效抗菌效果。

(4)本发明制得的百里香精油固体脂质体家禽饲料抗菌添加剂，制备工艺简单，无需昂贵仪器，且百里香精油作为天然植物提取物可替代饲料中抗生素的使用，安全性显著提高。

(5)该家禽饲料抗菌添加剂不仅具有良好的抗菌效果，能有效杀死家禽易感致病菌。而且其具有的自然芳香气味能够触发家禽类动物嗅觉神经，改善适口性和胃肠道功能，促进家禽食欲，增加采食量。

附图说明

表1不同类型脂质体的参数表征

图1百里香精油固体脂质体中百里香精油在鸡模拟胃液中的释放

图2百里香精油固体脂质体对耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)的抗菌效果

图3百里香精油固体脂质体对肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)的抗菌效果

图4百里香精油固体脂质体对鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)的抗菌效果

图5百里香精油固体脂质体对空肠弯曲杆菌(c.jejuni)的抗菌效果

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1家禽饲料抗菌添加剂—百里香精油固体脂质体的制备

1实验材料

2实验仪器

3实验方法

①将大豆卵磷脂与胆固醇(5:1，w/w)置于圆底烧瓶中，加入一定量的百里香精油(5.0mg/ml)和有机溶剂氯仿(50.0ml)，超声分散(100hz，30min)使其充分分散溶解。

②使用旋转蒸发器(30-40℃)蒸发掉有机溶剂，至圆底烧瓶内壁形成光滑的浅黄色脂质薄膜。随后将脂质薄膜放入真空干燥箱中，真空状态60℃下干燥24h后取出。加入表面活性剂pvp(1.0mg/ml)、冷冻保护剂甘露醇(1.0mg/ml)以及pbs(50.0ml)，水浴超声(100hz，3h)使其混合均匀，直至形成稳定的乳浊液。

③将所得乳浊液于细胞超微粉碎仪中(工作2.5s，间隙2.5s，功率360w)破碎30min，离心(6000r/min，15min)，除去上层精油和下层杂质，用0.22μm微孔滤膜进行过滤，得到的滤液(乳液状态)即为百里香精油纳米脂质体。

④使用去离子水配制浓度为4.0mg/ml的ε-pl溶液，将ε-pl溶液逐滴滴加入已制得的百里香精油纳米脂质体乳液中，置于磁力搅拌器上(120r/min)搅拌4h，通过静电相互作用对百里香精油纳米脂质体进行表面修饰。

⑤采用冷冻干燥法，将百里香精油纳米脂质体转化为更稳定的百里香精油固体脂质体。首先将样品置于-80℃冷阱中预冻3h，随后转移至冷冻干燥架真空冷冻干燥48～72h，直至样品呈现冻干的固体颗粒粉末状态，即可制成百里香精油固体脂质体。

⑥为进一步提高百里香精油固体脂质体的抗菌效果，采用低温等离子体技术(plasma)对百里香精油固体脂质体进行表面处理改性，其具体操作条件如下：保护气为n2，功率400w，时间2min，即可制成百里香精油固体脂质体-plasma。

实施例2家禽饲料抗菌添加剂—百里香精油固体脂质体的表征

1实验材料

百里香精油固体脂质体

2实验仪器

3实验方法

①百里香精油固体脂质体的粒径、多分散指数(pdi)和zeta电势使用激光粒度仪测定。将样品使用pbs稀释10～20倍进行测定。同样测定未经ε-pl修饰的百里香精油纳米脂质体(乳液状态)的各参数作对照。

②包封率(％)和载药量(％)则采用gc-ms分析计算得到。

a.首先绘制标准曲线：用无水乙醇将百里香精油分别稀释成浓度为0mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，和0.8mg/ml的标准溶液，通过gc-ms分析，绘制标准曲线。

b.称取一定量的百里香精油固体脂质体于离心管中，加入一定量的无水乙醇，置于超声清洗机(30℃)中进行超声溶解3h后，将混合液在6000rpm/min下离心15min。用0.22μm滤膜过滤，取上清液用gc-ms进行分析。然后根据标准曲线及公式即可计算出样品中百里香精油的包封率(％)。同样测定未经ε-pl修饰的百里香精油纳米脂质体(乳液状态)作对照。包封率计算公式如下：

c.称取一定量的百里香精油固体脂质体于离心管中，加入一定量的无水乙醇，置于超声清洗机(30℃)中进行超声溶解3h后，将混合液在6000rpm/min下离心15min。用0.22μm滤膜过滤，取上清液用gc-ms分析百里香精油的含量。然后根据标准曲线及公式即可计算出样品中百里香精油的载药量(％)。载药量计算公式如下：

4家禽饲料抗菌添加剂—百里香精油固体脂质体的表征

百里香精油固体脂质体的各表征参数如表1所示。百里香精油纳米脂质体经冷冻干燥成为固体脂质体后，粒径无显著增大，这说明冷冻干燥技术不会对纳米脂质体造成损害。pdi用于表征纳米脂质体粒径分布情况，pdi介于0～0.3之间时，表示其粒径分布窄，颗粒具有良好的均一性。由表1可知，两种脂质体的pdi均小于0.3，这表明两种脂质体粒径分布比较集中，颗粒比较均一。zeta电势是用于表征纳米脂质体体系稳定性的参数，zeta电势较高(>|30|mv)的纳米脂质体较稳定。由表1可知，制得的百里香精油纳米脂质体稳定性较高。而百里香精油固体脂质体的zeta电势为+10.2，这是由于ε-pl的表面修饰，中和了原本表面的负电荷，可以更好地作为抗菌添加剂添加到家禽饲料中。包封率和载药量是评价纳米脂质体抗菌性能的关键参数，由表1可知，两种脂质体中百里香精油的包封率高，均为50％左右，载药量为9.19％，该结果表明产品性能较好。

表1

实施例3家禽饲料抗菌添加剂—百里香精油固体脂质体中百里香精油在鸡模拟胃液中的释放

1实验材料

百里香精油固体脂质体和百里香精油固体脂质体-plasma

鸡模拟胃液成分：胃蛋白酶：3.0mg/ml

蒸馏水：100ml

ph值：2.0～3.5(使用1.0mol/l的盐酸调节ph)

使用细菌过滤器过滤后备用。

2实验仪器

3实验方法

为将产品更好的应用于实际中，我们选用家禽中常见的鸡作为模式家禽动物进行实验分析。称取一定量的百里香精油固体脂质体-plasma于50.0ml鸡模拟胃液中，置于40℃(模拟鸡体温)恒温水浴锅中培养。每隔一段时间，取出500μl的样品，取样后再加入等量纯净的鸡模拟胃液以维持恒定的溶液体积。取出的样品离心(6000rpm/min)下15min，用0.22μm滤膜过滤，取上清液用gc-ms分析百里香精油含量。根据百里香精油标准曲线计算不同时间点释放的百里香精油的量。同样测定百里香精油固体脂质体在鸡模拟胃液中的释放行为作为对照。累积释放率计算公式如下：

4百里香精油固体脂质体中百里香精油在鸡模拟胃液中的释放

由图1可以看出，百里香精油固体脂质体和百里香精油固体脂质体-plasma对百里香精油均具有很好的缓释效果，可持续28h，从而保证百里香精油能够发挥长效的抗菌作用。相比于百里香精油固体脂质体来说，经plasma处理过的百里香精油固体脂质体中的百里香精油释放速率更快，且最终累计释放量更多，这是因为plasma的处理使得百里香精油固体脂质体表面的亲水性增加，从而溶解性增加，加速了百里香精油的释放。

实施例4家禽饲料抗菌添加剂—百里香精油固体脂质体在鸡模拟胃液中的抗菌性能评价

1实验材料

抗菌剂：百里香精油固体脂质体和百里香精油固体脂质体-plasma

模式菌种：耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)、肠炎沙门氏菌(s.enteritidiscicc24119)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimuriumcicc21483)和空肠弯曲杆菌(c.jejunicicc22936)

鸡模拟胃液成分：胃蛋白酶：3.0mg/ml

蒸馏水：50ml

ph值：2.0～3.5(使用1.0mol/l的盐酸调节ph)

使用细菌过滤器过滤后备用。

2实验仪器

3实验方法

本实验采用平板菌落计数法，以耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)、肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)和空肠弯曲杆菌(c.jejuni)为模式菌种，分别对百里香精油固体脂质体的抗菌性能进行评价。其中前三种菌种的生长条件大致相同，而空肠弯曲杆菌的生长条件比较苛刻，属于微需氧菌种。因此，前三种菌的抗菌效果以e.colirpoe为例进行描述，空肠弯曲杆菌(c.jejuni)单独描述。具体方法步骤如下：

①以耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)为例，将e.colirpoe接种到液体培养基中，置于37℃空气摇床(150rpm)中震荡培养24h，获得对数生长期的菌悬液。取适量处于对数期的e.colirpoe加入含有家禽模拟胃液的试管中(此时细菌浓度约为10^5～6cfu/ml)。

②然后向试管中分别加入百里香精油固体脂质体(5％)或百里香精油固体脂质体-plasma(5％)，不添加百里香精油固体脂质体的一组作空白对照，将各试管均置于空气摇床中在40℃的条件下震荡培养。每隔24h取样，采用平板菌落计数法分别测定各样品中的残存菌数。实验重复三次，结果取平均值。百里香精油固体脂质体对肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)的抗菌性能评价实验过程同耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)。

③将空肠弯曲杆菌(c.jejuni)接种到布氏肉汤液体培养基中，置于37℃微需氧环境下培养24h，获得对数生长期的菌悬液。取适量处于对数期的c.jejuni加入含有家禽模拟胃液的试管中(此时细菌浓度约为10^5～6cfu/ml)。然后向试管中分别加入百里香精油固体脂质体(5％)或百里香精油固体脂质体-plasma(5％)，不添加百里香精油固体脂质体的一组作空白对照，将各试管均置于40℃微需氧环境条件下培养。每隔24h取样，采用平板菌落计数法测定分别各样品中的残存菌数。实验重复三次，结果取平均值。

4家禽饲料抗菌添加剂—百里香精油固体脂质体在鸡模拟胃液中的抗菌性能评价

由图2、图3、图4和图5可以看出，百里香精油固体脂质体对家禽中常见的耐药性大肠杆菌(e.colirpoe)、肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)和空肠弯曲杆菌(c.jejuni)均具有较好的抗菌效果。这充分说明固体脂质体可以有效提高百里香精油的稳定性，防止其挥发，提高其溶解性，从而发挥更好的抗菌效果。而且百里香精油固体脂质体-plasma对三种菌的抗菌效果相比来说更佳，这也证实了plasma的表面改性处理能够进一步提高百里香精油固体脂质体抗菌性能。