本发明方法属于农产品深加工技术领域，具体涉及一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的方法。
背景技术：
我国是芝麻的消费大国，尽管全国芝麻年产量在60万吨以上，但仍不能满足国内芝麻消费，每年仍需进口100万吨芝麻。目前，国内芝麻加工产品有两大类：一类是芝麻油，另一类是芝麻作为辅料的食品，如芝麻球、芝麻汤圆等。随着人民对健康、安全、新颖食品需求的不断增长，开发新型的芝麻食品具有广阔的市场。
芝麻蛋白是芝麻的主要组分之一，约占芝麻质量的20%左右。研究表明：芝麻蛋白营养价值较高，含有8种必需氨基酸且富含赖氨酸；同时，芝麻蛋白中致敏蛋白、胰蛋白酶抑制剂较少，安全性高，是一类有利用价值的植物蛋白资源。
与大豆蛋白相比，芝麻蛋白的凝胶性差，不能通过加入盐离子或酸形成结构稳定的凝胶，这限制了芝麻蛋白在食品领域中的应用范围。研究发现：物理、化学、生物改性可以提高蛋白凝胶性。其中物理改性通常采用超高压处理蛋白，所需设备投资大，难以工业化推广；化学改性虽然效果显著，但是存在化学试剂残留与改性过程中形成有害物质的风险，因而不满足消费者的要求；采用谷氨酰胺转移酶改性可催化蛋白质肽链发生分子内和分子间发生共价交联，从而提高蛋白凝胶性，这种生物改性方法具有条件温和，安全绿色的优点，因而具有工业推广价值。目前，谷氨酰胺转移酶成本较高，且在热、酸碱及有机溶剂中不稳定，这也限制酶法改性蛋白的工业化转化。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的方法，该方法可以有效提高芝麻蛋白凝胶性，既避免了化学加工方式中存在试剂残留问题，又具有条件温和可控，绿色节能，产品安全性和附加值高等特点，易于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的方法，其包括如下步骤：
1）芝麻粉碎除油：将芝麻粉碎（粉碎至40－60目），采用有机溶剂萃取芝麻中的油脂，萃取结束后，收集除油后的芝麻粉（优选可通过减压蒸馏去除残余有机溶剂），备用；
所述有机溶剂为石油醚、正戊烷或乙醚。萃取条件为：萃取温度30－60℃，芝麻与有机溶剂的料液比为1g：3－6ml（m/v），萃取3－6次，每次萃取时间为20－60 min。减压蒸馏条件：压力-0.08－-0.10 MPa，温度为50－70℃，时间30－60 min；
2）复酶水解：将除油后的芝麻粉与水混合配成5－25%（m/v）的溶液a并调节pH至3.0－5.5，加入复酶在100－400 rpm的搅拌条件下于30－60℃水解反应30－120 min，水解完毕后，冷却、静置、离心（具体可以是：冷却到4℃，静置60－180 min，随后采用3000－5000 rpm离心30 min），收集沉淀a，备用；
其中，调节pH采用的酸可以是盐酸、硫酸、磷酸，所采用的碱可以是氢氧化钠；
3）固定化酶制备：将壳聚糖与环氧氯丙烷按1g：3－5ml的比例混合后于60－70℃反应10－30 min，然后加入壳聚糖质量1－5倍的多胺，并于70－80℃反应5－25 min，反应结束后，收集固体a备用；
在氮气保护下，在0.05－0.2 mol/L的Fe3O4溶液中加入等体积的浓氨水（浓度22-25%），在70－80℃下反应0.5－2 h，反应结束后，收集固体Fe3O4微球，储存于pH2－4的蒸馏水中；
将固体a用稀盐酸溶解后，分别加入占壳聚糖质量40－60%、5－20%的固体Fe3O4微球和三聚磷酸钠，搅拌均匀（以5,000－10,000 rpm搅拌30 min），用磁铁吸附固体颗粒，获得磁性壳聚糖微粒；
将磁性壳聚糖微粒加入到含2－6%戊二醛的磷酸缓冲液中配成浓度0.2－0.5%（m/v）的悬浊液，室温搅拌反应1－4h，然后加入含2－8%（m/v）谷氨酰胺转移酶的磷酸缓冲液，继续搅拌反应4－6 h，用磁铁吸附微粒，蒸馏水洗净，获得固定化谷氨酰胺转移酶，备用；其中，含2－8%谷氨酰胺转移酶的磷酸缓冲液加入量为悬浊液体积的1－3倍；所述磷酸缓冲液浓度0.05mol/L、 pH8；
4）固定化酶改性：将步骤2）获得的沉淀a与水混合配成5－20%（m/v）的溶液b并调节pH至7.5－9.0，然后加入固定化谷氨酰胺转移酶在50－250 rpm的搅拌速度下于30－65℃改性20－100min，随后用磁铁吸附回收固定化酶，溶液采用平板离心机以1000－3000 rpm离心，收集滤液备用；
5）改性蛋白回收：将步骤4）所得滤液中和后，超滤膜处理，浓缩至50%时，加入蒸馏水恢复至初始体积，再次使用超滤膜进行超滤处理，重复上述操作2－5次，用蒸馏水调节固形物浓度至5－15%，然后喷雾干燥，即获得成品。
具体的，步骤2）中，所述复酶是由纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成的混合酶，复酶的添加量为除油后芝麻粉质量的0.05－0.50%，其中，复酶中各原料的重量百分比为：纤维素酶30－60%、半纤维素酶15－35%，果胶酶为20－45%。
具体的，步骤3）中，所述壳聚糖、环氧氯丙烷、多胺的反应在微波反应器中进行；所述的多胺为精胺和/或亚精胺。
具体的，步骤4）中，固定化谷氨酰胺转移酶的添加量是溶液b的5－15%（m/v）。所述平板离心机采用的滤布目数为400－800目。
具体的，步骤5）中，采用的超滤膜截留分子量为8000－50000 Da。超滤的操作压力为0.5－1.5 Mpa。喷雾干燥的条件为：进口温度160－190℃，出口温度为60－80℃。
固定化酶技术可以有效提高酶的利用率，从而降低酶法的生产成本；并且固定化酶还可以提高酶的稳定性，从而减少酶解条件的限制。因此，采用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性具有工业推广价值与市场发展前景。本发明提供了一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的生产工艺，该方法可以提升芝麻蛋白的凝胶性，增加芝麻蛋白的应用范围，拓展芝麻蛋白消费市场。由于该发明的生产工艺中采用固定化酶、生物酶解、膜分离等生物和物理加工方法，杜绝了化学加工方式中存在试剂残留问题，提高了产品的安全性与品质。本发明方法推动了芝麻蛋白资源的深加工发展，既满足了人民群众对新型芝麻食品的消费需求，又繁荣市场，给相关企业带来丰厚收益。
与现有技术相比，本发明方法的有益效果如下：
1）较物理改性、化学改性，本发明方法采用固定化酶改性技术具有条件温和可控，产品安全性高，易于工业化生产等特点；
2）本发明方法中采用膜分离技术对料液进行脱盐浓缩，高效节能且无污染；
3）采用本发明方法生产的芝麻蛋白凝胶性高，可以用于肉糜、肉肠、挤压膨化食品中，具有广阔的应用市场。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述各实施例中，对制备所得的芝麻蛋白产品进行相关的蛋白凝胶性检测，具体测定方法如下：
芝麻蛋白凝胶性的测定方法：采用质构分析法（TPA）。配制13% （m,/v）芝麻蛋白溶液，将芝麻蛋白溶液在90℃加热40min，然后用冰水浴将凝胶迅速冷却至室温，最后样品放入4℃冰箱过夜。二次压缩实验前，在室温下静置1h，进行。采用Φ50 mm圆型探头，压缩距离10 mm，前进速度60 mm/min，压缩速度60 mm/min，后撤速度60 mm/min。根据质构曲线，计算凝胶硬度。
实施例1
一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的方法，其包括如下步骤：
1）芝麻粉碎除油
取200 g芝麻粉碎至40目，加入1000 mL石油醚在50℃萃取5次，每次萃取30 min，萃取结束后，收集芝麻粉并在-0.10 MPa、60℃减压蒸馏40 min，获得除油后的芝麻粉，备用；
2）复酶水解
将除油后的芝麻粉与水混合配成10%（m/v）的溶液a，并用盐酸调节pH至4.0，加入1.0 g复酶（所述复酶由纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合组成，三者分别占复酶质量的45%、30%、25%）在300 rpm的搅拌条件下于50℃水解反应90 min，水解完毕后，冷却到4℃，静置60 min，随后4000 rpm离心30 min，收集沉淀a，备用；
3）固定化酶制备
将50 g壳聚糖与150 mL环氧氯丙烷混合后，放入微波反应器中在60℃反应30 min，然后加入150 g精胺，70℃反应25 min，反应结束后，收集固体a，备用；
在氮气保护下，在250 mL 0.05 mol/L的Fe3O4溶液中加入等体积浓氨水，在75℃下反应1 h，反应结束后，收集固体Fe3O4微球，储存于pH2的蒸馏水中；
将固体a用稀盐酸溶解后，加入25 g固体 Fe3O4微球和5 g三聚磷酸钠，以8,000 rpm搅拌30 min，用磁铁吸附固体颗粒，获得磁性壳聚糖微粒；
将50 g磁性壳聚糖微粒加入到10,000 mL含4%戊二醛的磷酸缓冲液（pH8，0.05mol/L）中，室温搅拌2 h，然后加入20,000 mL含 4%谷氨酰胺转移酶的磷酸缓冲液（pH8，0.05mol/L），继续搅拌4 h，用磁铁吸附微粒后，蒸馏水洗净，获得固定化谷氨酰胺转移酶，备用；
4）固定化酶改性
将步骤2）获得的沉淀a与水混合配成400 mL 10%（m/v）的溶液b并调节pH至8.5，加入20 g固定化谷氨酰胺转移酶在150 rpm的搅拌速度下于45℃改性80 min，随后用磁铁吸附回收固定化酶，溶液采用配有400目滤网的平板离心机以2,000 rpm离心，收集滤液备用；
5）改性蛋白回收
将步骤4）所得滤液中和后，采用截留分子量10,000 Da的超滤膜处理，在操作压力0.5 MPa浓缩至50%时，加入蒸馏水使其恢复至初始体积，再次使用超滤膜进行超滤处理，连续重复上述操作3次，用蒸馏水调节固形物浓度至9%，喷雾干燥（进口温度180℃，出口温度70℃），获得芝麻蛋白成品35.62 g。
经测试可知：上述制备所得改性芝麻蛋白的凝胶硬度为0.78N，较未改性的芝麻蛋白提高1.95倍。
实施例2
一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的方法，其包括如下步骤：
1）芝麻粉碎除油
取300 g芝麻粉碎至60目，加入1800 mL正戊烷在60℃萃取4次，每次萃取50 min，萃取结束后，收集芝麻粉并在-0.10 MPa、70℃减压蒸馏60 min，获得除油后的芝麻粉，备用；
2）复酶水解
将除油后的芝麻粉与水混合配成15%（m/v）的溶液a，并用盐酸调节pH至3.5，加入1.5 g复酶（所述复酶由纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合组成，三者分别占复酶质量的50%、30%、20%）在400 rpm的搅拌条件下于55℃水解反应100 min，水解完毕后，冷却到4℃，静置90 min，随后5000 rpm离心30 min，收集沉淀a，备用；
3）固定化酶制备
将100 g壳聚糖与300 mL环氧氯丙烷混合后，放入微波反应器中在70℃反应20 min，然后加入400 g亚精胺、80℃反应20 min，反应结束后，收集固体a，备用；
在氮气保护下，在400 mL 0.10 mol/L的Fe3O4溶液中加入等体积浓氨水，在75℃下反应1 h，反应结束后，收集固体Fe3O4微球，储存于pH3的蒸馏水中；
将固体a用稀盐酸溶解后，加入50 g 固体 Fe3O4微球和10 g三聚磷酸钠，以10,000 rpm搅拌30 min，用磁铁吸附固体颗粒，获得磁性壳聚糖微粒；
将100 g磁性壳聚糖微粒加入到20,000 mL 含4%戊二醛的磷酸缓冲液（pH8，0.05mol/L）中，室温搅拌2 h，然后加入20,000 mL 含5%谷氨酰胺转移酶的磷酸缓冲液（pH8，0.05mol/L），继续搅拌5 h，用磁铁吸附微粒后，蒸馏水洗净，获得固定化谷氨酰胺转移酶，备用；
4）固定化酶改性
将步骤2）获得的沉淀a与水混合配成1200 mL 5%（m/v）的溶液b并调节pH至8.7，加入100 g固定化谷氨酰胺转移酶在200 rpm的搅拌速度下于50℃改性60 min，随后用磁铁吸附回收固定化酶，溶液采用配有600目滤网的平板离心机以3,000 rpm离心，收集滤液备用；
5）改性蛋白回收
将步骤4）所得滤液中和后，采用截留分子量20,000 Da的超滤膜处理，在操作压力1.0 MPa浓缩至50%时，加入蒸馏水使其恢复至初始体积，再次使用超滤膜进行超滤处理，连续重复上述操作4次，用蒸馏水调节固形物浓度至10%，喷雾干燥（进口温度190℃，出口温度60℃），获得芝麻蛋白成品52.72 g。
经测试可知：上述制备所得改性芝麻蛋白的凝胶硬度为0.81N，较未改性的芝麻蛋白提高2.02倍。
实施例3
一种利用固定化酶改性提高芝麻蛋白凝胶性的方法，其包括如下步骤：
1）芝麻粉碎除油
取300 g芝麻粉碎至60目，加入1500 mL乙醚在45℃萃取3次，每次萃取60 min，萃取结束后，收集芝麻粉并在-0.08 MPa、60℃减压蒸馏60 min，获得除油后的芝麻粉，备用；
2）复酶水解
将除油后的芝麻粉与水混合配成10%（m/v）的溶液a，采用盐酸并调节pH至4.5，加入1g复酶（所述复酶由纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合组成，三者分别占复酶质量的50%、20%、30%）在300 rpm的搅拌条件下于50℃水解反应120 min，水解完毕后，冷却到4℃，静置150 min，随后5000 rpm离心30 min，收集沉淀a，备用；
3）固定化酶制备
将100 g壳聚糖与400 mL环氧氯丙烷混合后，放入微波反应器中在70℃反应20 min，然后加入300 g精胺和亚精胺混合物（二者质量比为1:1），80℃反应20 min，反应结束后，收集固体a，备用；
在氮气保护下，在500 mL 0.10 mol/L的Fe3O4溶液中加入等体积浓氨水，在75℃下反应1 h，反应结束后，收集固体Fe3O4微球，储存于pH2.5的蒸馏水中；
将固体a用稀盐酸溶解后，加入50 g 固体 Fe3O4微球和10 g三聚磷酸钠，以9,000 rpm搅拌30 min，用磁铁吸附固体颗粒，获得磁性壳聚糖微粒；
将150 g磁性壳聚糖微粒加入到30,000 mL含4%戊二醛的磷酸缓冲液（pH8，0.05mol/L）中，室温搅拌2 h，然后加入60,000 mL含6%（m/v）谷氨酰胺转移酶的磷酸缓冲液（pH8，0.05mol/L），继续搅拌5 h，用磁铁吸附微粒后，蒸馏水洗净，获得固定化谷氨酰胺转移酶，备用；
4）固定化酶改性
将步骤2）获得的沉淀a与水混合配成600 mL 10%（m/v）的溶液b并调节pH至8.5，加入90 g固定化谷氨酰胺转移酶在150 rpm的搅拌速度下于50℃改性50 min，随后用磁铁吸附回收固定化酶，溶液采用配有800目滤网的平板离心机以3,000 rpm离心，收集滤液备用；
5）改性蛋白回收
将步骤4）所得滤液中和后，采用截留分子量8,000 Da的超滤膜处理，在操作压力1.5 MPa浓缩至50%时，加入蒸馏水使其恢复至初始体积，再次使用超滤膜进行超滤处理，连续重复上述操作4次，用蒸馏水调节固形物浓度至15%，喷雾干燥（进口温度190℃，出口温度60℃），获得芝麻蛋白成品52.69 g。
经测试可知：上述制备所得改性芝麻蛋白的凝胶硬度为0.85N，较未改性的芝麻蛋白提高2.12倍。