本发明涉及甲鱼的深加工领域，尤其是涉及甲鱼小分子多肽。
技术背景
甲鱼（amydasincnsis），是鳖的俗称，也叫团鱼、水鱼、是卵生两栖爬行动物，是龟鳖目鳖科软壳水生龟的统称。共有20多种。中国现存主要有中华鳖、山瑞鳖、斑鳖、鼋，其中以中华鳖最为常见。甲鱼不仅是餐桌上的美味佳肴，上等筵席的优质材料，还可作为中药材料入药。其具有诸多滋补药用功效，有清热养阴，平肝熄风，软坚散结，对肝硬化，肝脾肿大，小儿惊痫等作用。
甲鱼富含动物胶、角蛋白、铜、维生素d等营养素，能够增强身体的抗病能力及调节人体的内分泌功能，也是提高母乳质量、增强婴儿的免疫力及智力的滋补佳品。甲鱼的腹板称为“龟板”，是名贵的中药，有滋阴降火之功效。用于治疗头晕、目眩、虚热、盗汗等疾患。还对头颅外伤(例如新生儿头颅血肿等)遗留下来的顽固性头痛有很好的疗效。龟板胶是大分子胶原蛋白质，含有皮肤所需要的各种氨基酸，有养颜护肤、美容健身之效。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供甲鱼小分子多肽，甲鱼小分子多肽具有较强的抑瘤作用，可以作为增强剂配合抑瘤剂使用，制备工艺简洁，甲鱼蛋白的发酵与酶解效率较高，可以节省大量的能量与时间成本，甲鱼小分子多肽分成四段分子量区间，既避免了发酵液中活性多肽的浪费，还有利于对其精细化、区别化地进一步研究。
本发明方法中所使用的微生物及其所购买企业为：米曲霉，保定微农生物科技有限公司；酿酒酵母菌，烟台曼森商贸有限公司。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：甲鱼小分子多肽，其制备方法包括：预处理、发酵、酶解、分离，具体包括以下步骤：
预处理：取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:5～7的比例与异丙醇混合均匀，在25～28℃温度下反应3～5h，过滤，在4500～5000r/min转速下离心20～30min，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为25～33%，调节ph值至6.8～7.0，在121～122℃温度下灭菌12～15min即得发酵基质；经脱脂处理后，甲鱼蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对发酵菌的影响；
发酵：取发酵基质干重3.5～4.0%的米曲霉种子液、2.0～3.0%的酿酒酵母菌种子液接种入发酵基质中，另外再加入种子液重量0.3～1.0%的发酵增效剂，在120～160r/min转速、28～30℃温度条件下发酵培养48～60h；发酵结束后，将发酵液煮沸8～10min灭酶，11000～12000r/min离心15～30min，上清液过0.2～0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；在此发酵条件下，甲鱼蛋白回收率可达85%以上，蛋白质被酶解为蛋白质片段，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的发酵液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值；利用混合菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，降低单菌发酵的劣势，菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对抗菌肽生成的不利因素，制备活性多肽的成本更低，发酵反应较温和，发酵过程易控；
酶解：将发酵液低温调整至含水量为70～75%，添加2500～3300u/g中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量3.5～4.6‰的（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，微波功率为260～300w，间歇微波时间为5～8min，在酶解温度为53～55℃、酶解ph值为7.3～7.5的条件下酶解1.5～2.0h，酶解结束后煮沸12～15min灭酶得酶解液；（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于中性蛋白酶的金属原子活性中心，降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，使甲鱼蛋白的水解度可达到34％以上，提高了甲鱼多肽的产量与产率，同时节省了能量与时间成本，具有较高的推广价值；
分离：在0.25～0.28mpa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5kda、3kda与1kda的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的甲鱼小分子多肽：t1（>5kda）、t2（5kda～3kda）、t3（3kda～1kda）与t4（<1kda），经柱层析分离后取洗脱峰分管收集并干燥即得甲鱼小分子多肽；将甲鱼小分子多肽分成四段不同分子量区间，不仅避免了发酵液中活性多肽的浪费，还可以更加精细化、区别化地进一步研究各个分子量区间段多肽的生物学活性；甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞dna的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。
作为优选，发酵增效剂包含下列含量的物质：65～80%尿素、2～6%α-萘乙酸钠、15～20%氧化钙、3～7%硫酸镁、1～5%磷酸二甲酯；尿素可以均质化甲鱼匀浆，使甲鱼匀浆组织更好的与微生物代谢出的酶接触，增大二者的接触几率，提高发酵效率；同时，发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使酿酒酵母菌增强对乙酰辅酶a的分泌，进而增进其与草酰乙酸的缩合反应，加快柠檬酸的合成，可以大幅度提高酿酒酵母菌三羧酸循环的速度，加快酿酒酵母菌的生长繁殖与发酵代谢，促使酿酒酵母菌代谢出更多的酶与发酵底物作用，进而提高小分子多肽的产率与产量。
作为优选，柱层析操作为：选用sephadexg-25柱层析，用蒸馏水平衡后装柱（16mm×500mm），上样质量浓度2～3mg/ml，上样量2ml，洗脱液为蒸馏水，流速20～25ml/h，在220nm处检测，收集洗脱峰；柱层析可以较为迅速、精确的得到目标波长的洗脱峰组分，同时又不会影响甲鱼小分子多肽的结构与性质。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）经脱脂处理后，甲鱼蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对发酵菌的影响；
2)利用混合菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，可以降低单菌发酵的劣势，菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对抗菌肽生成的不利因素，提高发酵效率，节约能量成本与时间成本；
3）酶解时加入的（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于蛋白酶的金属原子活性中心，降低与底物之间的能量壁垒，增大反应活性，大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，使甲鱼蛋白的水解度可达到34％以上，提高了甲鱼多肽的产量与产率，同时节省了能量与时间成本；
4）发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使酿酒酵母菌增强对乙酰辅酶a的分泌，加快其与草酰乙酸缩合合成柠檬酸的速度，大幅度提高酿酒酵母菌三羧酸循环的速度，加快酿酒酵母菌的生长繁殖与发酵代谢，促使酿酒酵母菌代谢出更多的酶，提高小分子多肽的产率与产量；
5）甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞dna的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
甲鱼小分子多肽，其制备方法包括以下步骤：
1）取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:5的比例与异丙醇混合均匀，在25℃温度下反应3h，过滤，在4500r/min转速下离心20min，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为25%，调节ph值至6.8，在121℃温度下灭菌12min即得发酵基质；2）取发酵基质干重3.5%的米曲霉种子液、2.0%的酿酒酵母菌种子液接种入发酵基质中，在120r/min转速、28℃温度条件下发酵培养48h；发酵结束后，将发酵液煮沸8min灭酶，11000r/min离心15min，上清液过0.2μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；3）将发酵液低温调整至含水量为70%，添加2500u/g中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量3.5‰的（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，微波功率为260w，间歇微波时间为5min，在酶解温度为53℃、酶解ph值为7.3的条件下酶解1.5h，酶解结束后煮沸12min灭酶得酶解液；4）在0.25mpa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5kda、3kda与1kda的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的甲鱼小分子多肽：t1（>5kda）、t2（5kda～3kda）、t3（3kda～1kda）与t4（<1kda），干燥即得甲鱼小分子多肽。
实施例2：
甲鱼小分子多肽，其制备方法包括以下步骤：
1）预处理：取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:7的比例与异丙醇混合均匀，在28℃温度下反应5h，过滤，在5000r/min转速下离心30min，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为33%，调节ph值至7.0，在122℃温度下灭菌15min即得发酵基质；经脱脂处理后，甲鱼蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对发酵菌的影响；
2）发酵：取发酵基质干重4.0%的米曲霉种子液、3.0%的酿酒酵母菌种子液接种入发酵基质中，另外再加入种子液重量1.0%的发酵增效剂，发酵增效剂包含下列含量的物质：70%尿素、6%α-萘乙酸钠、18%氧化钙、4%硫酸镁、2%磷酸二甲酯，在160r/min转速、30℃温度条件下发酵培养60h；发酵结束后，将发酵液煮沸10min灭酶，12000r/min离心30min，上清液过0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；在此发酵条件下，甲鱼蛋白回收率可达85%以上，蛋白质被酶解为蛋白质片段，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的发酵液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值；利用混合菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，降低单菌发酵的劣势，菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对抗菌肽生成的不利因素，制备活性多肽的成本更低，发酵反应较温和，发酵过程易控；
3）酶解：将发酵液低温调整至含水量为75%，添加3300u/g中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量4.6‰的（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，微波功率为300w，间歇微波时间为8min，在酶解温度为55℃、酶解ph值为7.5的条件下酶解2.0h，酶解结束后煮沸15min灭酶得酶解液；（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于中性蛋白酶的金属原子活性中心，降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，使甲鱼蛋白的水解度可达到34％以上，提高了甲鱼多肽的产量与产率，同时节省了能量与时间成本，具有较高的推广价值；
4）分离：在0.28mpa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5kda、3kda与1kda的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的甲鱼小分子多肽：t1（>5kda）、t2（5kda～3kda）、t3（3kda～1kda）与t4（<1kda）；经柱层析分离操作：选用sephadexg-25柱层析，用蒸馏水平衡后装柱（16mm×500mm），上样质量浓度3mg/ml，上样量2ml，洗脱液为蒸馏水，流速25ml/h，在220nm处检测，收集洗脱峰分管收集并干燥即得甲鱼小分子多肽；将甲鱼小分子多肽分成四段不同分子量区间，不仅避免了发酵液中活性多肽的浪费，还可以更加精细化、区别化地进一步研究各个分子量区间段多肽的生物学活性；甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞dna的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。
实施例3：
甲鱼小分子多肽，分成四段不同分子量区间的甲鱼小分子多肽：t1（>5kda）、t2（5kda～3kda）、t3（3kda～1kda）与t4（<1kda），甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞dna的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。
甲鱼小分子多肽的制备方法包括：预处理、发酵、酶解、分离，具体包括以下步骤：
预处理：取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:6的比例与异丙醇混合均匀，在26℃温度下反应4h，过滤，在4500r/min转速下离心25min，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为30%，调节ph值至6.9，在121℃温度下灭菌15min即得发酵基质；经脱脂处理后，甲鱼蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对发酵菌的影响；
发酵：取发酵基质干重4%的米曲霉种子液、2%的酿酒酵母菌种子液接种入发酵基质中，另外再加入种子液重量1%的发酵增效剂，在140r/min转速、28℃温度条件下发酵培养60h；发酵结束后，将发酵液煮沸10min灭酶，11500r/min离心20min，上清液过0.2μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；在此发酵条件下，甲鱼蛋白回收率可达85%以上，蛋白质被酶解为蛋白质片段，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的发酵液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值；利用混合菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，降低单菌发酵的劣势，菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对抗菌肽生成的不利因素，制备活性多肽的成本更低，发酵反应较温和，发酵过程易控；
酶解：将发酵液低温调整至含水量为75%，添加3000u/g中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量4‰的（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，微波功率为280w，间歇微波时间为6min，在酶解温度为54℃、酶解ph值为7.4的条件下酶解2h，酶解结束后煮沸15min灭酶得酶解液；（r）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于中性蛋白酶的金属原子活性中心，降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，使甲鱼蛋白的水解度可达到34％以上，提高了甲鱼多肽的产量与产率，同时节省了能量与时间成本，具有较高的推广价值；
分离：在0.28mpa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5kda、3kda与1kda的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的甲鱼小分子多肽：t1（>5kda）、t2（5kda～3kda）、t3（3kda～1kda）与t4（<1kda），经柱层析分离后取洗脱峰分管收集并干燥即得甲鱼小分子多肽；将甲鱼小分子多肽分成四段不同分子量区间，不仅避免了发酵液中活性多肽的浪费，还可以更加精细化、区别化地进一步研究各个分子量区间段多肽的生物学活性；甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞dna的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。
发酵增效剂包含下列含量的物质：75%尿素、4.8%α-萘乙酸钠、15%氧化钙、4%硫酸镁、1.2%磷酸二甲酯；尿素可以均质化甲鱼匀浆，使甲鱼匀浆组织更好的与微生物代谢出的酶接触，增大二者的接触几率，提高发酵效率；同时，发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使酿酒酵母菌增强对乙酰辅酶a的分泌，进而增进其与草酰乙酸的缩合反应，加快柠檬酸的合成，可以大幅度提高酿酒酵母菌三羧酸循环的速度，加快酿酒酵母菌的生长繁殖与发酵代谢，促使酿酒酵母菌代谢出更多的酶与发酵底物作用，进而提高小分子多肽的产率与产量。
柱层析操作为：选用sephadexg-25柱层析，用蒸馏水平衡后装柱（16mm×500mm），上样质量浓度2.5mg/ml，上样量2ml，洗脱液为蒸馏水，流速25ml/h，在220nm处检测，收集洗脱峰；柱层析可以较为迅速、精确的得到目标波长的洗脱峰组分，同时又不会影响甲鱼小分子多肽的结构与性质。
实施例4：
取对数期的人肺癌a549细胞，用质量分数1‰胰酶消化，用含质量分数5%胎牛血清的rpmi-1640培养基稀释，制备1×105个/ml的细胞悬液；每孔100μl接种于96孔板，置于37℃，5％co2饱和湿度的孵箱内培养24h，待细胞贴壁后弃培养液，加入100μl不同质量浓度（5，15，25，50，100μg/ml）的甲鱼小分子多肽（将t1、t2、t3与t4混配）。以只加培养液设立空白组，只加细胞和培养液设立对照组，每组设3个平行孔，培养24h；每孔加入20μl质量浓度5mg/mlmtt溶液，孵育4h，弃上清液，每孔加入150ldmso，15min后用酶标仪在波长490nm处测定其吸光度od。计算细胞增殖抑制率，多元回归法计算半数抑制浓度ic50。以实施例1～3中的甲鱼小分子多肽进行测定的结果如表1所示，由表1可知，甲鱼小分子多肽对人肺癌a549细胞具有较强的抑制作用。
表1.抑瘤效果
注：每组重复3次，*与对照组相比p<0.05。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。