本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种酶降解半乳甘露聚糖产品及其制备方法与应用。
背景技术：
1946年，moore等首次报道抗生素的促生长作用，在饲料中添加青霉素能够改善畜禽的生产性能，其后抗生素被广泛应用到动物饲养中改善畜禽生产性能和提高饲料利用率。近年来，由于抗生素造成的细菌耐药性，耐药基因能够通过动物转移到人，给人类健康带来潜在的威胁，不同国家与地区开始限制抗生素的使用。瑞典于1986年率先禁用抗菌促生长剂，欧盟于2006年禁止所有抗生素作为促生长剂使用。我国于2016年禁止硫酸黏菌素作为促生长剂使用，限抗、禁抗已是大势所趋，开发具有抗生素替代效果的饲料添加剂迫在眉睫。
致病性沙门氏菌和大肠杆菌的i型菌毛又称甘露糖敏感型菌毛，可与畜禽黏膜上皮细胞表面的甘露糖结合受体结合完成粘附，从而实现感染致病。i型菌毛对细胞外基质表面的甘露糖残基的识别和结合起着重要作用。半乳甘露聚糖，是一种包含甘露糖和半乳糖的多糖，存在于瓜尔豆胶、长角豆胶和一些真菌中。半乳甘露聚糖的主链由甘露糖以β-1,4糖苷键连接，侧链以α-1,6键连接有半乳糖残基。半乳甘露聚糖因其富含甘露糖，具有和酵母细胞壁相似的功效，能够特异性结合动物肠道上皮细胞i型甘露糖结合受体，阻碍沙门氏菌和大肠杆菌在动物肠道上皮细胞的黏附，进而减少沙门氏菌和大肠杆菌在动物肠道内的增殖。brufau等报道，添加半乳甘露聚糖能够改善肉鸡肠道形态和肠道屏障功能，降低沙门氏菌的危害。
半乳甘露聚糖在畜禽肠道后段被降解成半乳甘露寡糖后被肠道菌群发酵利用，生成有机酸等物质参与代谢。andersen和andrés-barranco等发现了育肥猪饲料中添加半乳甘露寡糖可以有效的降低沙门氏菌的患病率。侯振平等在断奶仔猪日粮中添加半乳甘露寡糖发现0.2％和0.3％半乳甘露寡糖在回肠明显的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量，回肠微生物种类相对减少。李鹏等用半乳甘露寡糖饲喂50日龄的新西兰肉兔，研究发现半乳甘露寡糖试验组兔十二指肠的绒毛长度和隐窝深度、空肠肠绒毛长度和肠黏膜厚度、回肠各黏膜结构相关指标均显著高于空白对照组，说明在半乳甘露寡糖的作用下，小肠的消化吸收功能得到了综合提高。
然而半乳甘露聚糖具有很高的黏度，添加到动物日粮中具有抗营养作用。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种具有抗生素替代效果的酶降解半乳甘露聚糖产品及其制备方法。
本发明所提供的酶降解半乳甘露聚糖产品，为：半乳甘露聚糖、半乳甘露寡糖和甘露糖的混合物，其中，以质量百分比计，半乳甘露聚糖占30％～70％，半乳甘露寡糖占30％～70％，甘露糖占2～10％。产品中的甘露糖能提高半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖抑制病原菌的功效，为必需组分。
具体地，以质量百分比计，所述酶降解半乳甘露聚糖产品中半乳甘露聚糖占50.0％，半乳甘露寡糖占47.35％，甘露糖占2.65％。
其中，半乳甘露聚糖的分子量为3kda～300kda；半乳甘露寡糖的分子量为0.3kda～3kda。
上述酶降解半乳甘露聚糖产品是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
1)制备半乳甘露聚糖；
2)使用酶对半乳甘露聚糖进行部分酶降解，得到酶降解半乳甘露聚糖产品。
上述方法步骤1)中，所述半乳甘露聚糖以长角豆胶、刺槐豆胶或瓜尔豆胶等为原料通过水提醇沉法制备得到。
所述半乳甘露聚糖的单糖组成为甘露糖和半乳糖，其中半乳糖：甘露糖(质量比)为1：1.6～1：3.8。
上述方法步骤2)中，所述酶为β-甘露聚糖酶。
β-甘露聚糖酶与半乳甘露聚糖的配比可为0.2～2g：1g，具体可为2g：1g，其中，β-甘露聚糖酶的酶活为50000u/g。
所述酶降解的温度可为30℃～40℃，具体可为37℃，时间可为4～18小时，具体可为12小时。
本发明的另一目的是提供上述酶降解半乳甘露聚糖产品的应用。
所述应用为上述酶降解半乳甘露聚糖产品替代抗生素在提高饲粮养分表观消化率、提高畜禽生长性能中的应用。
所述畜禽具体可为肉鸡。
本发明还提供一种提高饲粮养分表观消化率、提高畜禽生长性能的方法。
本发明所提供的提高饲粮养分表观消化率、提高畜禽生长性能的方法，为：用上述酶降解半乳甘露聚糖替代抗生素添加到畜禽日粮中喂食畜禽，即可。
其中，以畜禽日粮为100％计，上述酶降解半乳甘露聚糖以0.1％～0.5％的比例添加。
本发明提供了一种具有抗生素替代效果的酶降解半乳甘露聚糖产品及其制备方法，并将这种酶降解半乳甘露聚糖产品应用到肉鸡饲养中，能够提高肉鸡的生长性能。
本发明的优点在于：1原料来源丰富，制备工艺简单；2本发明所提供的酶降解半乳甘露聚糖产品能消除半乳甘露聚糖的抗营养作用，不降低畜禽的生产性能；3本发明提供的酶降解半乳甘露聚糖产品中含有甘露糖，具有更好地抑制病原菌与肠道细胞黏附的功效；4本发明制备的酶降解半乳甘露聚糖产品可应用到畜禽日粮中，减少抗生素的使用。
本发明采用酶法修饰的方法制备得到了具有特定结构和组成的酶降解半乳甘露聚糖产品，更好地发挥其替代抗生素的功效。
附图说明
图1添加甘露糖对半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物解聚曲线的影响。其中，1为半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物(质量比1：1)，2为半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物添加2％甘露糖，3为半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物添加5％甘露糖，4为半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物添加10％甘露糖。
图2为制备得到的半乳甘露聚糖的薄层层析(tlc)测定结果。其中，1为半乳甘露聚糖酸解前样品，2为甘露糖标准品，3为半乳糖标准品。
图3为制备得到的半乳甘露聚糖的高效液相色谱(hplc)图。
图4为半乳甘露聚糖酶降解产物的薄层层析分析结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所采用的β-甘露聚糖酶购自北京挑战生物技术有限公司，酶活为50000u/g。
实施例、
(一)甘露糖在半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖抑制沙门氏菌中的作用
许多沙门氏菌以及其他肠道微生物不仅能够粘附肠道，而且还能够凝聚豚鼠的红细胞或者含有甘露聚糖的酵母细胞。itzhakofek认为，具有i型菌毛的肠道微生物和酵母细胞的凝聚机制与其对肠道细胞的粘附机制有较好的相关性(itzhakofeketal,1978)。以酵母细胞替代肠道细胞作为粘附介质进行研究，具有培养简单、检测快捷的优点，可用于肠道微生物的菌毛鉴定以及抑制粘附剂的体外评价(rogeretal,2012；oyofob.a.etal,1989；davidetal,1980)。其测定原理为：酵母细胞具有与肠道细胞相似的结构，能够与沙门氏菌凝集。凝聚态的沙门氏菌和酵母细胞产生沉降效应，600nm波长下菌液的光吸收值呈现下降趋势。具有特殊结构的糖能抑制沙门氏菌和酵母细胞的凝聚，加入糖后沙门氏菌和酵母细胞发生解聚，600nm波长下菌液的光吸收值又呈现上升趋势。绘制沙门氏菌和酵母细胞添加不同糖的解聚曲线，能够评价不同糖抑制沙门氏菌和酵母细胞凝集效果。
具体操作步骤：将半乳甘露聚糖(本实验室制备)和半乳甘露寡糖(本实验制备，不含甘露糖)以质量比为1：1配置成半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖的混合物，混合物分别添加2％甘露糖、5％甘露糖和10％甘露糖，用pbs缓冲液配成0.22g/l的溶液。将沙门氏菌接种于lb培养基中，于摇床内37℃、250r/min培养，2％接种量活化3次后，于37℃静置培养12h待用。酿酒酵母接种于ypd培养基中，于摇床内30℃、250r/min培养，5％接种量活化3次，培养24h后待用。分别将沙门氏菌、酵母细胞用pbs缓冲液调od600＝2.0；在比色皿中加入1.5ml的酵母细胞悬液，加入搅拌子，400rpm搅动，吸光值稳定后加入275μl的沙门氏菌悬液，凝聚完全后，加入150μl上述糖液，至吸光值稳定。
结果如图1所示。在均匀搅拌的条件下，酵母细胞初始吸光值稳定在2.0左右；100s时，按最佳凝聚比例添加沙门氏菌，体系吸光值逐渐降低，500s后趋于稳定，此时，沙门氏菌和酵母细胞完全凝聚。500s时加入不同糖溶液，沙门氏菌和酵母细胞发生解聚，曲线呈现不同的趋势。加入半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物后，沙门氏菌和酵母细胞的解聚作用较好，至1600s时吸光值增加至1.827；半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物后添加2％甘露糖后，至1600s时吸光值增加至1.898混合物加入5％甘露糖后，至1600s时吸光值增加至1.93；混合物加入10％甘露糖后，至1600s时吸光值增加至1.965；从上述结果可以看出，半乳甘露聚糖和半乳甘露寡糖混合物能够抑制沙门氏菌和酵母细胞凝聚，加入甘露糖后，解聚效果优于未加甘露糖组，并且添加甘露糖后的解聚效果随着甘露糖添加量的增加而升高。
(二)半乳甘露聚糖的制备
称取5g长角豆胶样品，加入500ml去离子水，磁力搅拌2h，8000rmp10℃离心15min取上清，上清加入三氯乙酸(终浓度为7％)放4℃过夜除蛋白，8000rmp10℃离心30min取上清，上清加入3倍体积96％的预冷乙醇，上清与乙醇混匀后取沉淀，沉淀用80％冷乙醇洗两次，沉淀放入45℃烘箱烘干乙醇，放入冻干机过夜冻干，得到半乳甘露聚糖。
(三)半乳甘露聚糖的单糖组成分析
称取50mg半乳甘露聚糖，加入0.6ml72％浓硫酸，研磨2小时,加入50ml水，转移至250ml三角瓶中，沸水浴3小时，冷却至室温，加入约2.5g碳酸钡中和，抽滤，并用200ml水清洗三角瓶及沉淀，浓缩至1ml。
薄层层析分析：将标准液和样品液分别点于薄层层析板上，放入展开槽中展开，取出风干后，浸泡于显色剂中10s，在110℃显色3min，取出冷却到室温。展开剂：正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，配置100ml，经两次展开；显色剂：95％硫酸：乙醇＝1:1(体积比)配置50ml；点样量：2.5μl。
图2为薄层层析(tlc)测定结果。由图2可以得出，半乳甘露聚糖的单糖成分是甘露糖和半乳糖。
高效液相色谱(hplc)分析见图3，分析条件：色谱柱，sugar-d(4.6id×250mm)；流动相，乙腈：水＝4:1；流速，1ml/min；检测时间，20min；上样量，20μl；检测器，视差折光检测器。半乳甘露聚糖样品经hplc的视差折光检测器检测，半乳甘露聚糖的单糖组成是甘露糖和半乳糖，甘露糖和半乳糖的质量比是1.79：1。
(四)半乳甘露聚糖的酶法降解及产物分析
配制10％半乳甘露聚糖溶液，加入β-甘露聚糖酶(北京挑战生物技术有限公司，50000u/g)(β‐甘露聚糖酶与半乳甘露聚糖的配比为2g：1g)，37℃酶解12小时，煮沸灭活10min。酶解产物进行薄层层析分析(图4)，发现半乳甘露聚糖在β-甘露聚糖酶的作用下，发生了部分降解，产生了半乳甘露寡糖。终产物是半乳甘露聚糖、半乳甘露寡糖和甘露糖的混合物。用3kda超滤管分离半乳甘露寡糖和半乳甘露聚糖，冷冻干燥后计算半乳甘露寡糖和半乳甘露聚糖的量。半乳甘露寡糖样品中包含甘露糖，甘露糖采用hplc定量分析。计算得到半乳甘露聚糖：半乳甘露寡糖：甘露糖的质量比例为50.0％：47.35％：2.65％(表1)。
表1半乳甘露聚糖酶降解产物分析
(五)酶降解半乳甘露聚糖对肉鸡生产性能的影响
1试验设计
选768羽1日龄健康爱拔益加(aa)商品肉仔鸡,根据体重一致原则随机分为6组,每组设8个重复，每个重复16只鸡。第1组为对照组，饲喂基础日粮(ⅰ组)；第2组为抗生素组，在基础日粮中添加5mg/kg的黄霉素(ⅱ组)；第3组为半乳甘露聚糖组，在基础日粮中添加0.1％未经处理的半乳甘露聚糖(ⅲ组)；第4～6组在基础日粮中分别添加0.1％、0.2％、0.3％的酶降解半乳甘露聚糖(ⅳ组、ⅴ组和ⅵ组)。试验时间42d。
2试验管理
试验采用单因素完全随机试验设计试验，随机选取同期出雏的1日龄健康aa肉仔鸡(公雏)。鸡只的饲养管理按《aa肉仔鸡饲养管理手册》进行。统一采用笼养方式，人工光照，自由采食颗粒饲料和饮用自来水，自然通风。入雏前24h将鸡舍升温至32～35℃，此后温度每周降低2～3℃，直至保持在22～24℃为止；湿度保持在50％～65％范围内。试验期42天，分为1-21日龄和22-42日龄2个阶段。试验期间每日观察鸡群的健康状况，记录死淘鸡数，常规免疫。
3生产性能结果
试验第21、42天，分别以重复为单位对试验鸡进行空腹称重，统计饲粮消耗量，计算21、42d的肉鸡平均体重和1～21d、22～42d、1～42d的平均日增重、平均日采食量、料重比和营养物质消化率。
表2饲粮添加不同水平酶降解半乳甘露聚糖对肉仔鸡生长性能的影响
同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
表2是饲粮添加不同水平酶降解半乳甘露聚糖对肉仔鸡生长性能的影响。由表2可知，1-21日龄，与对照组相比，添加抗生素组和添加0.3％酶降解半乳甘露聚糖组平均日增重显著提高(p<0.05)，且添加0.3％酶降解半乳甘露聚糖组的平均日增重在数值上高于抗生素组(p>0.05)。添加0.1％和0.2％酶降解半乳甘露聚糖组相比于未经处理的半乳甘露聚糖的平均日增重在数值上有所提高。与对照组相比，抗生素组对平均日采食量无影响，添加0.2％和0.3％酶降解半乳甘露聚糖组可以显著提高平均日采食量(p<0.05)。与对照组相比，抗生素组和添加0.3％酶降解半乳甘露聚糖组平均体重有升高的趋势(0.05<p<0.1)，与未经处理的半乳甘露聚糖相比，0.3％酶降解半乳甘露聚糖组有降低料重比的趋势(0.05<p<0.1)。。
21-42日龄，未经处理的半乳甘露聚糖组平均日增重和平均日采食量最低，其它各组均能显著提高平均日增重和平均日采食量(p<0.05)，但酶降解半乳甘露聚糖组与对照组相比，平均日增重差异不显著(p>0.05)，0.2％酶降解半乳甘露聚糖组平均日增重数值最高。与未经处理的半乳甘露聚糖组相比，0.2％酶降解半乳甘露聚糖有提高平均体重的趋势(0.05<p<0.1)。
1-42日龄，0.2％和0.3％酶降解半乳甘露聚糖组的平均日增重和平均日采食量均显著高于未经处理的半乳甘露聚糖组(p<0.05)；各组之间料重比差异不显著(p>0.05)。
结果表明：未经处理的半乳甘露聚糖由于具有一定的抗营养作用，导致了动物生产性能的降低。酶降解半乳甘露聚糖的添加量为0.2％和0.3％时，能代替抗生素提高动物生产性能。
表3饲粮添加不同水平酶降解半乳甘露聚糖对肉仔鸡营养物质消化率的影响
同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
表3是饲粮添加不同水平酶降解半乳甘露聚糖对肉仔鸡营养物质消化率的影响。由表3可知：未经处理半乳甘露聚糖21日龄脂肪的消化率最差，抗生素组、0.1％和0.3％酶降解半乳甘露聚糖组脂肪消化率极显著高于对照组(p<0.0001)；对照组和未经处理半乳甘露聚糖组21日龄粗蛋白消化率最低，其它各组均极显著高于这两组(p<0.0001)；21日龄干物质消化率相比于未经处理半乳甘露聚糖组和对照组而言，0.3％酶降解半乳甘露聚糖组可以提高21日龄干物质消化率，差异极显著(p<0.01)，而抗生素组与对照组相比无显著差异。
42日龄粗脂肪消化率未经处理半乳甘露聚糖组最低，其它各组均有提高的趋势(0.05<p<0.1)；未经处理半乳甘露聚糖组的粗蛋白消化率最低，与其相比，0.2％和0.3％酶降解半乳甘露聚糖组显著提高了蛋白质的消化率(p<0.05)；42日龄干物质消化率未经处理半乳甘露聚糖组最低，其它各组有提高的趋势(0.05<p<0.1)。结果表明，未经处理的半乳甘露聚糖降低粗脂肪、粗蛋白、干物质消化率，添加抗生素能够增加粗脂肪、粗蛋白、干物质消化率，而酶降解半乳甘露聚糖能够显著提高粗脂肪、粗蛋白、干物质消化率，能够达到比抗生素略好的功效。