一种饲用抗生素替代复合制剂及其制备方法与流程

本发明属于微生态制剂和中草药提取物技术领域，具体涉及一种饲用抗生素替代复合制剂及其制备方法。

背景技术

由于抗生素在养殖业和饲料业中的滥用，使抗药、耐药和畜产品残留问题变得十分严重；因此，抗生素替代品的研究变得尤为重要。随着国内外对康盛使用监管的日趋严格和公众意识的不断提升，抗生物替代品的研发与应用正趋于被公众接受的地位，饲用抗生素替代品的品种也在不断推陈出新，目前市场上的饲用抗生物替代品主要有：（1）有机酸；（2）酶制剂；（3）低聚糖类；（4）微生态制剂；（5）中药及中药提取物类，这些替代品应用方面的研究也多是各种替代品在饲料中独立使用添加，其中两种配伍使用研究较少，尤其是微生态制剂与中草药的复配使用，微生态制剂中的大量益生菌对动物胃肠道微生物区系的调控、动物的生长、机体健康具有促进作用。中药具有低毒、无抗药性、功能性强、经济实用等特点。

小檗碱又称黄连素，广泛分布在植物界，是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，是黄连抗菌的主要有效成分，小檗碱具有抗菌、抗病毒的功效，同时又对动物的机体状态非常有益，也在兽医临床中常被采用，小檗碱作为一种中药提取物，其作为饲料添加物应用于饲料中的抗菌有一定的作用，但是将其与微生物复配制成制剂用于饲料中的研究较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种饲用抗生素替代复合制剂及其制备方法，寻求一种在养殖业和饲料业中能替代抗生素的制剂，以期解决饲料中抗药、耐药和畜产品残留的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种饲用抗生素替代复合制剂，包括复合微生态制剂以及中草药制剂，复合微生态制剂与中草药制剂的质量配比为（40-400）：1，所述中草药制剂具体例如为小檗碱，具体复合微生态制剂与小檗碱的质量配比例如为（2：0.005）、（2：0.01）、（2：0.02）、（2：0.03）、（2：0.04）或（2：0.05）。

所述的复合微生态制剂，由体积比为1:1:1:1的干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和布拉迪酵母菌液混合而成，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和布拉迪酵母的菌液有效活菌数均为1.0×10⁶-1.0×10⁸cfu/ml，具体的，所述干酪乳杆菌菌液有效活菌数为1.0×10⁶cfu/ml、粪肠球菌菌液有效活菌数为1.0×10⁷cfu/ml、枯草芽孢杆菌菌液有效活菌数为1.0×10⁶cfu/ml、布拉迪酵母的菌液有效活菌数均为1.0×10⁷cfu/ml。

所述饲用抗生素替代复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和布拉迪酵母分别接种到mrs培养基、mrs培养基、lb培养基和ypd培养基，培养得到各自的菌液，将所得菌液按体积配比混合即得复合微生态制剂；

（2）将步骤（1）中得到的混合菌液加入到添加有中草药制剂的mrs培养基中培养得到菌液即为饲用抗生素替代复合制剂。

上述方法，步骤（1）混合时，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和布拉迪酵母的体积配比为1:1:1:1，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和布拉迪酵母的菌液有效活菌数均为1.0×10⁶-1.0×10⁸cfu/ml，具体混合时，所述干酪乳杆菌菌液有效活菌数为1.0×10⁶cfu/ml、粪肠球菌菌液有效活菌数为1.0×10⁷cfu/ml、枯草芽孢杆菌菌液有效活菌数为1.0×10⁶cfu/ml、布拉迪酵母的菌液有效活菌数均为1.0×10⁷cfu/ml。

步骤（2）添加时，将所述混合菌液添加至含有小檗碱的mrs培养基中培养得到菌液，菌液与小檗碱的添加质量配比为（2：0.005）、（2：0.01）、（2：0.02）、（2：0.03）、（2：0.04）或（2：0.05）。

所述饲用抗生素替代复合制剂在饲料中的应用，具体应用方面在于抑制致病性大肠杆菌，应用时，按照上述方法中的配比取复合微生态制剂和中草药制剂混合即得。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供了一种复合菌液以及中草药小檗碱复配制成的饲用抗生素替代复合制剂及其制备方法，所述制剂配方无需化学物质的添加，也无需过多工艺，不会产生对环境污染的有害气体、液体，同时能够有效降低饲料的处理成本，减小能量的消耗。

2、本发明制备的复合制剂能够有效抑制致病性大肠杆菌等有害菌群，试验的结果表明培养基中干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌k4和布拉迪酵母有效活菌数组合为1×10⁶、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁷cfu/ml时，对致病性大肠杆菌的抑菌效果最好（p<0.05）；试验结果可以看出，不同浓度的小檗碱对复合益生菌的活菌数的没有明显的抑制作用，其中培养基中添加0.01%浓度的小檗碱与复合益生菌配伍使用对复合益生菌的抑制作用最小，因此选择含有浓度为0.01%小檗碱的培养基培养复合益生菌得到的菌液作为替代抗生素的菌剂；试验表明本发明的复合菌剂对大肠杆菌生长的抑制作用与金霉素相当，表现出了良好的抑菌效果，本发明的制剂配方为饲料中的抗生素的替代奠定了基础。

附图说明

图1所示为干酪乳杆菌和粪肠球菌对大肠杆菌的影响；

图2所示为干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌k4对大肠杆菌的影响；

图3所示为干酪乳杆菌和布拉迪酵母菌对大肠杆菌的影响；

图4所示为粪肠球菌和枯草芽孢杆菌k4对大肠杆菌的影响；

图5所述为粪肠球菌和布拉迪酵母菌对大肠杆菌的影响；

图6所述为枯草芽孢杆菌k4和布拉迪酵母菌对大肠杆菌的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1复合益生菌体外抑菌试验

1.1菌种选择

选用粪肠球菌（enterococcusfaecalis，cgmcc1.125）、干酪乳杆菌（lactobacilluscasei，cgmcc1.29）、枯草芽孢杆菌k4（bacillussubtilisk4，cgmcc1.439）、布拉迪酵母（saccharomycesboulardii，cgmcc2.3951），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），并由河南农业大学动物营养与生物技术实验室保存，大肠杆菌k88（escherichiacolik88）作为指示菌，由河南农业大学微生物研究室惠赠。

1.2仪器设备

电热恒温隔水培养箱（上海跃进医疗器械厂），高速冷冻离心机（湖南湘仪h-1850r），生物净化工作台（苏州净化），双层汽浴振荡器（江苏金坛杰瑞尔电器），phs-2c酸度计（天津赛得利斯试验分析仪器），79-1磁力搅拌器（金坛市中大仪器），立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），牛津杯（内径为6.0±0.1mm，外径为8.0±0.1mm），冰箱（海尔），电热鼓风干燥箱（中兴101）。

1.3试剂

葡萄糖，氯化钾，胰蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，伊红美蓝，乙酸钠，柠檬酸铵，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钠，吐温80等，均为国产分析纯。

1.4培养基

培养干酪乳杆菌和粪肠球菌的mrs培养基（g/l）：柠檬酸铵2g、硫酸镁0.2g、胰蛋白胨15g、酵母浸粉1g、葡萄糖20g、吐温-801ml、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、硫酸锰0.05g，固体培养基加入2%的琼脂，用蒸馏水定容至1l，在121℃、0.15mpa高压蒸汽灭菌20min备用。

培养布拉迪酵母的ypd培养基(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，固体培养基加入2%的琼脂，用蒸馏水定容至1l，在121℃、0.15mpa高压蒸汽灭菌20min备用。

培养枯草芽孢杆菌k4和大肠杆菌的lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，固体培养基加入2%的琼脂，用蒸馏水定容至1l，在121℃、0.15mpa高压蒸汽灭菌20min备用。

伊红美蓝鉴别培养基（emb，）(g/l)：称取emb42.5g，加入1l蒸馏水，在121℃、0.15mpa高压灭菌20min备用。

1.5试验方法

1.5.1益生菌的活化

将实验室保存的干酪乳杆菌、粪肠球菌接种到mrs液体培养基中，37℃培养至浑浊，再按2%的接种量接种于新鲜的培养基中，培养24h后测定活菌数，放到4℃冰箱待用。

将枯草芽孢杆菌k4接种到lb液体培养基中，37℃培养至浑浊，再按2%的接种量接种于新鲜的培养基中，培养24h后测定活菌数，放到4℃冰箱待用。

将布拉迪酵母接种到ypd液体培养基中，30℃培养24h后测定活菌数，再按2%的接种量接种于新鲜的培养基中，培养24h后测定活菌数，放到4℃冰箱待用。

1.5.2复合益生菌菌剂体外抑菌试验的响应面设计

采用牛津杯法进行体外抑菌试验，将上述益生菌活菌数调整为1×10⁶cfu/ml、1×10⁷cfu/ml、1×10⁸cfu/ml三个浓度水平，使用响应面法进行四因素三水平试验设计，寻找复合益生菌抑菌效果最佳的活菌数组合配比。大肠杆菌活菌数调整为1×10⁷cfu/ml。

利用design-expert8.0.5软件，采用box-behnken设计、模型拟合和数据分析。将所述四种益生菌进行活化培养，采用响应面进行优化，试验因素及水平见表1。为了体现自变量和因变量的关系，采用二次多项方程进行拟合，预测二次多项方程式如下：

r1=k+a+b+c+d+ab+ac+ad+bc+bd+cd+a²+b²+c²+d²；

式中：r1是益生菌组合对大肠杆菌的抑菌圈直径（mm），k为常数；a、b、c、d是自变量，分别对应粪肠球菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌k4、布拉迪酵母。

表1试验设计。

本试验采用牛津杯法进行抑菌试验，将固体培养基高压后，均匀的倒在玻璃平皿上，等到它完全凝固后，将大肠杆菌的培养液用移液枪吸取400μl，然后将其均匀的涂抹在已经加入了固体伊红美蓝培养基的玻璃平皿中，等到其完全的吸收后，轻轻地将牛津杯垂直放入，静置，接着向牛津杯内加入100μl的复合益生菌菌液（按表1中水平进行配比），每个处理包含4个重复，用空白培养基作为对照组，向牛津杯内加完复合益生菌菌液之后，将平板拿出，先放置到4℃冰箱中进行扩散4h，然后置于37℃的恒温培养箱当中，培养24h后，测量抑菌圈的直径（mm）。

1.5.3最优复合益生菌菌剂的响应面回归设计

所有结果均以平均值±标准差表示，试验数据经microsoftexcel初步整理后，采用spss20统计分析软件对各数据进行方差分析和duncan多重比较，差异显著用p<0.05表示。

根据design-expert8.0.5软件中，box-behnken进行试验设计，设计了27个试验点的响应面，进行试验分析，对试验获得预处理后抑菌圈直径进行回归，建立响应面二次回归模型，寻求最优因素水平，试验因素的水平编码、试验结果与回归方程方差分析见表2、3、4。利用design-expert8.0.5对数据进行多元二次回归拟合，得出回归模型方程及方差分析结果如下：

r1=8.19-0.57a+0.13b-0.19c-0.67d+0.077ab+0.19ac+0.58ad+0.24bc+0.48bd+0.078cd+1.32a²+0.48b²+1.27c²+0.73d²。

表2因素水平编码(cfu/ml)。

表3box-behnken设计参数与结果（抑菌圈直径（mm））。

1.5.4响应面回归设计方差分析

从表4响应面回归方程系数的方差分析结果可知，模型prob>f值小于0.01，表明该模型可信度高。

表4响应面回归方程系数的方差分析。

注：prob>f小于0.05说明模型或考察的因素有显著影响。

响应面分析的结果如图1-6所示，从图1可以看出，干酪乳杆菌和粪肠球菌的交互作用对大肠杆菌的抑制作用没有影响。从图2可以看出，干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌k4的交互作用对大肠杆菌的抑制作用没有影响。从图3可以看出，干酪乳杆菌和布拉迪酵母菌的交互作用对大肠杆菌的抑制作用有显著影响，干酪乳杆菌和布拉迪酵母菌活菌数均为1×10⁶cfu/ml时，抑菌圈最大。从图4可以看出，粪肠球菌和枯草芽孢杆菌k4的交互作用对大肠杆菌的抑制作用没有影响。从图5可以看出，粪肠球菌和布拉迪酵母菌的交互作用对大肠杆菌的抑制作用有显著影响，粪肠球菌活菌数为1×10⁶cfu/ml、布拉迪酵母活菌数为1×10⁷cfu/ml时抑菌圈最大。从图6可以看出，枯草芽孢杆菌k4和布拉迪酵母菌的交互作用对大肠杆菌的抑制作用没有影响。

结论，试验的结果表明干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌k4和布拉迪酵母有效活菌数组合为1×10⁶、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁷cfu/ml时，对致病性大肠杆菌的抑菌效果最好（p<0.05）。

2益生菌组合与小檗碱配伍体外抑菌试验

2.1不同浓度小檗碱对益生菌活菌数的抑制作用

将小檗碱设置为0、0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%不同浓度梯度，并分别称取相应的固体小檗碱加入装有100mlmrs液体培养基的三角瓶中，121℃高压灭菌20min。将不同的菌种活化，活化方法同1.5.1。

将复合益生菌培养液（活菌数分别为1×10⁶cfu/ml干酪乳杆菌、1×10⁷cfu/ml粪肠球菌、1×10⁶cfu/ml枯草芽孢杆菌k4、1×10⁷cfu/ml布拉迪酵母）按2%接种量接种到含有不同浓度小檗碱的mrs液体培养基中，放入37℃恒温培养箱中静置培24h，测定活菌数，每个浓度梯度五个重复。益生菌活菌数采用每ml菌液中所含菌的对数值（lg）表示（cfu/ml）。

将试验测得的数据采用spss软件进行anova方差分析，结果用“平均数±标准差”表示，以p<0.05表示差异显著。

由表5可知，当小檗碱浓度为0.01%时，所述复合益生菌活菌数的常用对数值为9.14cfu/ml（p>0.05），此时小檗碱的浓度对复合益生菌的抑制效果最弱，选择小檗碱添加浓度为0.01%为最优添加量。

表5不同浓度小檗碱对益生菌的抑制作用（lgcfu/ml）。

注：同列小写字母相同或无标记表示差异不显著（p>0.05），同列小写字母不同表示差异显著（p<0.05），下同。

2.2含有不同浓度小檗碱的复合益生菌菌剂对致病性大肠杆菌的抑制作用

①取400μl大肠杆菌培养液，均匀涂抹在伊红美蓝固体培养基上；

②待涂布到固体平板上的大肠杆菌菌液被完全吸收后，在平板上均匀地放置四个牛津杯，3分钟后各吸取100μl的上述7种不同浓度小檗碱复合益生菌培养液，加入到牛津杯中，将其从工作台中取出，放置到4℃冰箱中扩散4h；同时做培养基中金霉素添加量为0.01%的对照。

③将平板从4℃中取出平稳的放置到37℃恒温培养箱中静置培养24h后观察抑菌圈，并用游标卡尺进行测定。

由表6可知，当小檗碱浓度为0.01%时，抑菌直径为12.56mm(p<0.05)，0.01%与0.02%、0.03%相比抑菌直径差异不显著（p>0.05），与其他组相比差异显著（p<0.05）。从小檗碱与复合益生菌配伍使用以及小檗碱对益生菌的抑制作用方面的考虑，可以看出随着小檗碱浓度的增加复合益生菌活菌数呈现递减趋势，因此选择0.01%作为最佳小檗碱添加浓度。在小檗碱浓度为0.01%的培养基中，培养上述复合益生菌得到的菌液，其对大肠杆菌的抑制作用与金霉素的抑菌作用相近似，可以替代金霉素等抗生素在饲料中进行添加，为复合益生菌与小檗碱复配制剂在饲料中的应用奠定了一定的基础，同时本发明的制剂为抗生素的替代提供一种新的思路。

表6不同浓度小檗碱的复合益生菌培养液对大肠杆菌的抑制作用。

结论，试验结果可以看出，不同浓度的的小檗碱对复合益生菌的活菌数的没有明显的抑制作用，其中0.01%浓度的小檗碱与复合益生菌配伍使用对复合益生菌的抑制作用小，因此选择0.01%小檗碱与复合益生菌；而且这种组合对大肠杆菌生长的抑制作用与金霉素相当。

综上所述，（1）当干酪乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌k4和布拉迪酵母的组合为1×10⁶、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁷cfu/ml时，对大肠杆菌的体外抑制效果最好；（2）不同浓度的小檗碱对复合益生菌的生长和繁殖有一定的抑制作用，其中0.01%浓度的小檗碱与复合益生菌配伍使用对大肠杆菌生长的抑制作用，与金霉素相当，本发明的制剂配方为替代饲料中的抗生素奠定了基础。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。