脂质体复合物及其应用和降低鲭鱼鱼露中生物胺含量的方法与流程

本发明属于食品质量安全领域，涉及sirna(小干扰核糖核酸)与脂质结合形成一种稳定并能包裹核酸的脂质体，并将其用于降低鲭鱼为原料的鱼露中生物胺含量的方法。

背景技术

作为一种具有特殊风味的棕色液体调味品，鱼露在东南亚大部分地区受到了欢迎，它是当地人日常饮食中蛋白质摄入来源之一。由于其所具有的特殊风味，在日本的欧洲各国鱼露已被广泛用于多种预制食品、自制食品和酱料之中。由于鱼体内所含的蛋白酶乃至有益微生物的共同作用下对原料中所含的蛋白质等物质进行发酵分解所得。由于鱼露的生产过程属于开放式发酵的过程，其复杂的微生物群落非常容易引起生物胺的产生。相关研究表明，鱼露中所含的多种生物胺会对消费者的健康造成明显的不良影响，因此如何降低鱼露中的生物胺也是近年来鱼露生产相关的研究重点。前期研究表明，以鲭鱼为原料的鱼露中生物胺的主要来源是产胺菌阴沟肠杆菌(enterobactercloacaeatcc13047)，如何控制鲭鱼鱼露生产过程中阴沟肠杆菌产生物胺含量成为能否控制鱼露质量和安全的关键。

生物胺是一种低分子量的含氮有机碱，包括脂肪族、芳香族和杂环结构，属于极性或半极性化合物。生物胺主要是由细菌产生的氨基酸脱羧酶对氨基酸的作用或细菌对醛和酮类物质转氨基作用所产生的。其在发酵食品中较为常见，研究表明，鱼露中主要含有组胺、腐胺、尸胺酪胺等。当人体摄入过量的生物胺时会引起头痛，恶心，低血压，高血压，偏头痛，皮肤过敏和食物中毒的消化问题等。并且，生物胺是亚硝胺的前体，其与致癌和致突变活性具有一定的关系。生物胺性质稳定，在高温下不易降解，目前降低生物胺的主要方法有超高压法、辐照法、外源添加添加剂等，这些方法存在着操作要求高，成本高，效果不明显，易降低食品品质等缺点，难以在生产中应用和推广。

rna干扰技术即通过具有同源性的sirna诱导序列特异的目标基因的沉默，阻断其基因活性。因为碱基互补配对的原则所在，sirna有着很高的特异性，只对同源的靶基因起到干扰作用，对不相关的序列不起作用。同时sirna又具有高效性，少量的sirna就对基因表达沉默有着很高的效率。脂质体具有较好的生物相容性，它用于核酸转染已有多年历史，是目前最有效的载体之一。在阳离子脂质体包裹下的sirna能够通过电荷之间的作用与细胞膜融合，使sirna进入细菌体避免溶酶体的破坏。且阳离子脂质体具有可降解的特性，且实验证明其添加对人体无毒。剖析国内外相关研究，本发明将sirna运用于降低发酵鱼露生物胺含量进而改善其品质具有原始创新。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种脂质体复合物l-ecl-si-luxr，能够对以鲭鱼为原料的鱼露发酵过程中产胺菌产胺相关基因luxr的表达起抑制作用，从而降低鱼露中生物胺的含量。针对以鲭鱼为原料鱼露目前所存在的质量安全问题提供了一种高效、易操作的生物胺含量降低方法，提高鱼露产品的食用安全性。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种脂质体复合物，采用以下方法制得：

(1)根据鲭鱼鱼露中主要产胺菌阴沟肠杆菌(enterobactercloacaesubsp.cloacaeatcc13047)(nc_014121)产胺相关基因(ecl_04308geneid:9126783)luxr基因序列(seqno:1)，设计并合成sirna分子si-luxr；

(2)以si-luxr为包封物，与空白阳离子脂质体形成脂质体复合物l-ecl-si-luxr。

进一步，步骤(1)中所述si-luxr为双链，其序列为：

正义链：5'-uuaacacgucuauuugucgcg-3'；

反义链：5'-cgacaaauagacguguuaaau-3'。

进一步，所述空白阳离子脂质体的制备方法为：取一定量大豆磷脂，n-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)溶解于溶剂中，旋转蒸发成膜得到薄脂质膜；将薄脂质膜在葡萄糖溶液中水合，得到约10mg/ml的阳离子脂质体溶液。

进一步，所述空白阳离子脂质体由以下质量百分数的成分组成：n-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)20～40％；大豆磷脂25～40％；胆固醇25～40％；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(peg)5～20％。

进一步，步骤(2)中所述的脂质体复合物l-ecl-si-luxr的粒径为200-300nm。

进一步，步骤(2)中所述的脂质体复合物l-ecl-si-luxr包封率大于或等于75％。

进一步，所述方法包括以下步骤：

(1)根据鲭鱼鱼露中主要产胺菌阴沟肠杆菌(enterobactercloacaeatcc13047)的产胺相关基因luxr设计并合成干扰luxr基因的分子si-luxr；

si-luxr为双链，其序列为：

正义链：5'-uuaacacgucuauuugucgcg-3'；

反义链：5'-cgacaaauagacguguuaaau-3'

t7启动子模板dna为5'-taatacgactcactataggagacagg-3'；

(2)体外转录法合成si-luxr：取sirna分子正义链和t7启动子引物模板混合，90～100℃预变性2～5分钟，冰浴15～30分钟，再加入10xklenow缓冲液，三磷酸脱氧核苷，双蒸水，klenow酶，30℃～40℃水浴20～40分钟；取反应液，加入缓冲液，三磷酸核苷混合物，双蒸水和t7rna聚合酶，30～40℃水浴1～4h；相同的方法制备反义链dna产物，将两种dna转录产物混合，30～40℃下水浴16～24个小时，通过转录试剂盒的方法消化dna模板，并纯化sirna分子，备用；

(3)空白阳离子脂质体的制备：称取大豆磷脂，n-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)，溶解于氯仿-甲醇，旋转蒸发成膜。将薄脂质膜在5％葡萄糖溶液中水合，随后振荡并将所得脂质体通过100nm聚碳酸酯膜过滤器挤出8～12次，得到粒径大小在100nm左右的脂质体混合液，获得约10mg/ml的阳离子脂质体溶液；

(4)脂质体复合物l-ecl-si-luxr制备：将si-luxr与空白阳离子脂质体分别溶于1％焦碳酸二乙酯水中，混匀过夜；阳离子脂质体所带的总正电荷与si-luxr所带的总负电荷之比为1:1～10:1，涡旋处理5～10min，室温下孵育15～20min，形成脂质体复合物l-ecl-si-luxr。

本发明还提供前述脂质体复合物的应用，将所述脂质体复合物可加入至鲭鱼鱼露中，降低鲭鱼鱼露中的生物胺含量。

进一步，在鱼露发酵前期，取脂质体复合物l-ecl-si-luxr8～25mg溶于7％蔗糖溶液中充分混匀制得脂质体复合物l-ecl-si-luxr溶液，将制得的溶液加入1kg鱼露发酵醪中，充分搅拌混匀后继续发酵。

本发明还提供一种降低鲭鱼鱼露中生物胺含量的方法，在鱼露发酵前期，取上述的脂质体复合物l-ecl-si-luxr8～25mg溶于7％蔗糖溶液中充分混匀制得脂质体复合物l-ecl-si-luxr溶液，将制得的溶液加入1kg鱼露发酵醪中，充分搅拌混匀后继续发酵。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

经过大量实验证明，使用本发明的方法对鲭鱼为原料的鱼露产品生物胺的含量具有显著的降低作用，在相同的发酵加工条件下，得到的鱼露产品，与对照组比较，处理后的鱼露样品中腐胺含量下降了65％-80％，尸胺下降了40～50％，组胺下降了50％-70％，完全符合国家相关产品标准。根据鱼露制品卫生标准(gb10132-2005)中感官指标要求，处理后的鱼露产品在色泽、滋味和气味等方面没有显著下降和变化。

研究表明，本发明的显著效果如下：一是脂质体复合物l-ecl-si-luxr作为阳离子脂质体具有可降解的特性，在鱼露发酵的过程中可随着发酵过程的进行及时降解；二是脂质体复合物l-ecl-si-luxr具有显著降低鲭鱼为原料的鱼露中腐胺、组胺、亚静胺含量的效果，可显著降低65％-80％的腐胺，40～50％的尸胺，50％～70％的组胺；三是脂质体复合物l-ecl-si-luxr的添加不会影响鲭鱼为原料的鱼露产品应有的色泽、气味等感官特征。

附图说明：

图1sirna-阳离子脂质体的结构示意图。

图2实施例1中实施例1鲭鱼鱼露处理组(treated)和对照组(control)生物胺含量变化。

图3实施例2鲭鱼鱼露处理组(treated)和对照组(control)生物胺含量变化。

图4实施例1中鱼露处理前后感官品质的变化。

图5实施例2中鱼露处理前后感官品质的变化。

具体实施方式：

实施例1

脂质体复合物的制备：

(1)si-luxr根据鱼露中主要产胺菌阴沟肠杆菌的产胺相关基因luxr(参见附录)设计并合成干扰luxr基因的分子si-luxr。si-luxr序列为：

正义链：uuaauaugcaaguuuagcgag；

反义链：cgcuaaacuugcauauuaaga。

t7启动子模板dna为5'-taatacgactcactataggagacagg-3'。

(2)体外转录法合成si-luxr：取3μlsirna分子正义链(100μmol/l)和3ult7启动子引物模板(100μmol/l)混合，95℃预变性3分钟，冰浴25分钟，再加入3μl10xklenow缓冲液，8μl三磷酸脱氧核苷(dntp)(10μmol/l)，2μlddh2o,2.5μlklenow酶(2u/ul)，37℃水浴30分钟。取6μl反应液，加入4μl缓冲液，5μl三磷酸核苷(rntp)混合物(25mmo1/l)，2.5μlddh2o和2.5μlt7rna聚合酶，37℃水浴2.5h。相同的方法制备反义链dna产物。将两种dna转录产物混合，37℃下水浴18个小时。通过转录试剂盒的方法消化dna模板，并用酚-氯仿法纯化sirna分子，于-80℃下保存备用。

(3)空白阳离子脂质体的制备：称取大豆磷脂30mg，n-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)40mg，胆固醇30mg，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)10mg，溶解于溶于氯仿-甲醇溶液(体积比3:2),旋转蒸发成膜。将薄脂质膜在5％葡萄糖溶液中水合，随后振荡并将所得脂质体通过100nm聚碳酸酯膜过滤器挤出9次，获得约10mg/ml的阳离子脂质体溶液。

(4)脂质体复合物l-ecl-si-luxr制备：将si-luxr与空白阳离子脂质体分别溶于1％焦碳酸二乙酯水中，混匀过夜。阳离子脂质体所带的总正电荷与si-luxr所带的总负电荷之比为3：1涡旋7min，室温下孵育15min，形成脂质体复合物l-ecl-si-luxr。经马尔文粒度分析仪测得粒径为232nm，离子交换法测得脂质体的包封率为77％。

(5)将制得的脂质体复合物l-ecl-si-luxr高压均质，冻干，制成干燥物，其结构图如图1所示。

脂质体复合物的应用：

将鲭鱼搅碎制成鱼糜后和盐以3：1的比例搅拌，并制得的脂质体复合物l-ecl-si-luxr22mg溶于50ml7％蔗糖溶液中充分混匀制得脂质体复合物l-ecl-si-luxr溶液，加入1kg发酵醪中，于30℃下恒温发酵240天，定期搅拌。

发酵成熟后，过滤、灭菌装瓶制得鱼露产品，并用高效液相色谱法测量生物胺含量，样品测量三次取平均值。并取20ml鱼露室温静置15min后对用蒸馏水稀释5倍后进行滋味评价。对每个样品的风味特征进行评分，根据滋味和气味的强弱给分，最强给9分，“未感觉到”给0分，平均分为样品得分。

如图2所示，加入脂质体复合物l-ecl-si-luxr，能够极显著地降低鲭鱼鱼露中组胺、腐胺和尸胺的含量，显著降低鲭鱼鱼露中酪胺的含量。

如图4所示，加入脂质体复合物l-ecl-si-luxr后，不会影响鱼露的风味。

表1经本发明处理和未经本发明处理鲭鱼鱼露中生物胺的含量

实施例2

脂质体复合物的制备：

其中si-luxr制备与实施例1相同。

(1)空白阳离子脂质体的制备：称取大豆磷脂25mg，n-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)35mg，胆固醇25mg，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg2000)15mg，溶解于溶于氯仿-甲醇(体积比3:2)，旋转蒸发成膜。将薄脂质膜在5％葡萄糖溶液中水合，随后振荡并将所得脂质体通过100nm聚碳酸酯膜挤出8次，获得约10mg/ml的阳离子脂质体溶液。

(2)脂质体复合物l-ecl-si-luxr制备：将si-luxr与空白阳离子脂质体分别溶于1％焦碳酸二乙酯水中，混匀过夜。并以阳离子脂质体所带的总正电荷与si-luxr所带的总负电荷之比为(2：1)涡旋处理一段时间，形成脂质体复合物l-ecl-si-luxr。经马尔文粒度分析仪测得粒径为252nm，离子交换法测得脂质体的包封率为83％。

(3)将制得的脂质体复合物l-ecl-si-luxr高压均质，冻干，制成干燥物。

(4)将鲭鱼搅碎制成鱼糜后和盐以3：1的比例搅拌，并取制得的脂质体复合物l-ecl-si-luxr20mg溶于50ml7％蔗糖溶液中充分混匀制得脂质体复合物l-ecl-si-luxr溶液，加入1kg发酵醪中，于30℃下恒温发酵240天，定期搅拌。

(5)采用高效液相色谱法，对所得鱼露产品生物胺含量进行测定，样品测量三次取平均值。并取20ml鱼露室温静置15min后对用蒸馏水稀释5倍后进行滋味评价。对每个样品的风味特征进行评分，根据滋味和气味的强弱给分，最强给9分，“未感觉到”给0分，平均分为样品得分。

表2经本发明处理和未经本发明处理鱼露中生物胺的含量

如图3所示，脂质体复合物l-ecl-si-luxr的添加能够极显著地降低鲭鱼鱼露中腐胺、组胺和尸胺含量，能够显著降低鲭鱼鱼露中酪胺的含量。

如图5所示，加入脂质体复合物l-ecl-si-luxr后不会影响鲭鱼鱼露的风味。

sequencelisting

<110>浙江工商大学

<120>脂质体复合物及其应用和降低鲭鱼鱼露中生物胺含量的方法

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