耐低温抗噬菌体的短乳杆菌及其在泡菜中的应用的制作方法

本发明属于食品领域，尤其涉及泡菜制备技术领域，具体为耐低温抗噬菌体的短乳杆菌在泡菜中的应用。

背景技术：

泡菜是我国传统发酵食品的典型代表之一，历史悠久，文化深厚。其以新鲜蔬菜等为主要原料，添加或不添加辅料，经食用盐或食用盐水渍制，利用蔬菜表面携带的乳酸菌发酵而成。目前报道与泡菜发酵相关的乳酸菌主要包括明串珠菌、乳杆菌、魏斯氏菌、乳球菌、片球菌等。四川泡菜企业常在冬季收取青菜等原料进行盐渍发酵，由于温度较低，乳酸菌生长缓慢，导致泡菜成熟周期长，伴随着亚硝酸盐、生物胺等安全隐患。因此有必要筛选一些能在低温条件下发酵产酸的乳酸菌，调控泡菜发酵。目前报道从泡菜中筛选的耐低温发酵菌株主要为肠膜明串珠菌，其耐酸能力较差。

家庭式泡菜成熟周期较短，一般发酵5-10天即可食用，当泡菜坛里的泡菜消耗完，又会重新加入新鲜蔬菜，制备新一轮泡菜，这是家庭式泡菜常见的多轮发酵模式。研究发现，多轮发酵泡菜母水会积累丰富的有机酸、游离氨基酸、醛类、酮类、酯类等风味物质。然而，家庭式泡菜一般超过10轮发酵，泡菜水往往会出现粘稠、异味，甚至泡菜表面出现“生花”等现象，此时，只能清洗泡菜坛，重头开始制备泡菜，导致积累的风味和营养物质丧失。多轮发酵不稳定的原因主要是发酵乳杆菌受到了噬菌体的浸染。

噬菌体是感染细菌或真菌等微生物的病毒总称，噬菌体污染已成为全球性的问题困扰着发酵业。乳杆菌作为发酵剂或附属发酵剂在发酵过程中遭到烈性噬菌体侵染时，会呈现：发酵缓慢，发酵周期延长；产酸量减少或完全抑制产酸作用；乳酸菌活菌数下降，发酵液变清，镜检时，菌体形态改变；发酵产物形成缓慢或产品产量、质量下降；用双层琼脂平板法检查时，出现大量噬菌斑；用电镜能观察到大量噬菌体粒子存在。一旦噬菌体感染，将很难根治，给发酵行业带来巨大的经济损失。由此可见，筛选出一些能抵抗噬菌体侵染的发酵菌株，才能提高泡菜发酵稳定性。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一株可在低温和常温条件下都生长快速，产酸能力强的短乳杆菌。该菌株能抵抗3种乳杆菌噬菌体(lactobacillusphagelp65、lactobacillusphagesha1、lactobacillusphageatcc8014-b2)的污染，保证了发酵的稳定性；该菌株不能形成生物胺，能抑制泡菜中常见的革兰氏阴性菌生长，对亚硝酸盐具有降解作用。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：

耐低温抗噬菌体的短乳杆菌在泡菜中的应用，将短乳杆菌pcyty-7以10⁷cfu/ml的浓度接种于泡菜中，低温或常温培养，抵抗乳杆菌噬菌体lactobacillusphagelp65，lactobacillusphagesha1和lactobacillusphageatcc8014-b2的污染，降解亚硝酸盐，不产生生物胺。

短乳杆菌pcyty-7已于2016年7月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为短乳杆菌lactobacillusbreris，保藏号为cgmccno.12792，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述的低温培养是指温度低于10℃。

该短乳杆菌pcyty-7在泡菜中能抵抗常见污染噬菌体的侵染，抵抗时间高于72h，常见污染噬菌体包括乳杆菌噬菌体lactobacillusphagelp65，lactobacillusphagesha1和lactobacillusphageatcc8014-b2。

该短乳杆菌pcyty-7用于泡菜发酵，重复发酵20次(发酵1次是指家庭用户将泡菜泡制成熟一次)未见乳杆菌出现异常，泡菜仍然能稳定发酵。

该短乳杆菌pcyty-7调控泡菜发酵中的亚硝酸盐含量，发酵1d即使亚硝酸盐降低于国家标准。

具体应用方法：将短乳杆菌pcyty-7接于mrs液体培养基中，37℃培养24h，待浓度为10⁷cfu/ml时取培养后的液体进行离心，去除上清液，取出沉淀物，加入保护剂进行冷冻干燥制得泡菜发酵菌剂(制备泡菜发酵菌剂为常规操作)，再将该泡菜发酵菌剂用于泡菜中。

本发明的积极效果体现在：

(一)、本申请中提供的短乳杆菌pcyty-7可在低温或常温条件下正常快速生长，产酸能力强，解决泡菜冬季发酵缓慢的问题。

(二)、能抵抗3种乳杆菌噬菌体(lactobacillusphagelp65、lactobacillusphagesha1、lactobacillusphageatcc8014-b2)的污染，保证了发酵的稳定性，提升产品质量。

(三)、该菌株不能形成生物胺，能抑制泡菜中常见的革兰氏阴性菌生长，对亚硝酸盐具有降解作用，应用于泡菜发酵具有较好的效果，食用安全性能提高，对调控泡菜发酵具有积极意义。

附图说明：

图1为od值对应菌落数的标准曲线构建图

图2为菌株pcyty-7菌落形态及镜检结果图

图3为自然泡菜和接种pcyty-7的泡菜中噬菌体的基因序列数对比图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

耐低温抗噬菌体短乳杆菌的具体筛选步骤：

1、耐低温乳酸菌的初筛：

收集拉萨家庭式泡菜样品20份，称取25g泡菜置于盛有225ml灭菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。根据对样品状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1ml样品倾注于添加1.5％caco3的mrs培养基中，10℃培养72h，选取溶钙圈明显外观形态不一样的优势菌落，划线纯化，记录各菌株的菌落特征并编号，并做革兰氏染色和油镜观察。将纯化菌株进行接触酶试验，选择符合乳酸菌生理特性的菌株—革兰氏阳性、接触酶阴性菌株接种于mrs斜面上，10℃培养96h，保存于4℃冰箱中，待进一步筛选、鉴定。

2、od值对应菌落数的标准曲线构建

将初筛的乳酸菌接于mrs固体培养基37℃培养48h，分别全部刮取到18ml的0.85％生理盐水中制成原菌液，吸取1ml做梯度稀释，选适宜的三个连续稀释度，每个稀释度三个平行，进行平板计数。分别取0.5ml、1ml、2ml、4ml、5ml原菌液于0.85％生理盐水，并定容到10ml，混匀制成菌悬液，在od600nm下测定原菌液和菌悬液的吸光度，根据拟合结果选择r2值最接近于1的曲线。结果如图1所示。

3、耐低温乳酸菌的复筛及产酸能力测试

根据步骤2构建的标准曲线，将各菌株保持整体10⁷cfu/ml的浓度接种于蔬菜汁培养基中，每株菌3个平行，不接菌的蔬菜汁培养基作为空白，10℃培养48h，培养结束后测定培养基的ph和总酸，实验结果如表1所示。

表1部分筛选菌培养72h后的ph和总酸

从表1可以得出，筛选乳酸菌以相同含量接种在蔬菜培养基中，菌株编号pcyty-7的产酸能力最强，能在发酵72h就能让蔬菜培养基的ph降至3.91，因此筛选菌株pcyty-7作为低温发酵菌株。

4.耐低温菌株的分子鉴定

将筛选的耐低温乳酸菌接入mrs液体培养基，在37℃恒温箱中过夜培养24-48h，用以进行dna提取。菌株活化后参照bacterialdnaisolationkit进行总dna的提取。总dna经过16srdna扩增，pcr反应体系：25ul2×pcrmix(loadingbuffer、taqdnapolymerase、dntps、tris-hcl、kcl、mgcl2)，1.5uldna模板，引物27f和1492r各2ul，19.5ulddh2o。反应条件为：95℃预变性10min，93℃30s，65℃30s，72℃1min，10个循环；93℃30s，60℃30s，72℃1min，10个循环；93℃30s，55℃30s，72℃1min，10个循环；72℃保持5min。扩增反应完毕后，利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将pcr扩增产物送往上海生工生物技术有限公司进行测序，利用blast软件将测定的各菌株16srdna序列与genbank数据库中已知的16srdna基因序列进行比对。鉴定结果如表2所示。

表2筛选菌分子鉴定结果

5.菌株抗噬菌体能力测试

将pcyty-7以10⁷cfu/ml接于mrs液体培养基中，同时接入moi为0.1的lactobacillusphagelp65、lactobacillusphagesha1、lactobacillusphageatcc8014-b2三种泡菜中筛选的噬菌体，37℃恒温培养72h，重复试验3次，每培养24h进行计数，同时划线与mrs培养基，镜检观察是否出现变形。试验结果如表3和图2所示。

表3菌株pcyty-7抗噬菌体测试

由表3可以得出，菌株pcyty-7在含有3种噬菌体的mrs培养基中培养72h后仍然具有活性，且含量较培养24h时有所增加，且从图2也可看出，菌株菌落形态较好，镜检发现菌体未出现变形。因此，菌株pcyty-7能抵抗lactobacillusphagelp65、lactobacillusphagesha1、lactobacillusphageatcc8014-b2的浸染。

6.菌株亚硝酸盐降解能力及生物胺形成能力测试

将pcyty-7以10⁷cfu/ml接于添加了100mg/l亚硝酸钠的mrs液体培养基中，不接菌的mrs培养基作为空白，37℃恒温培养72h，，每培养24h测定培养基中亚硝酸盐的含量。将pcyty-7以10⁷cfu/ml接于baf培养基中，不接菌的baf培养基作为空白，37℃恒温培养72h，每培养24h测定培养基中生物胺的含量，结果如表4所示。

表4菌株pcyty-7亚硝酸盐降解能力及生物胺形成能力

由表4可以得出，菌株pcyty-7的亚硝酸盐降解能力较强，且不会将培养基中的氨基酸脱羧形成生物胺。

7.菌株抑菌能力测试

将pcyty-7以10⁷cfu/ml接种于蔬菜汁培养基中，同时将阿式肠杆菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、变形假单胞菌以10⁷cfu/ml分别接入蔬菜汁培养基中，37℃培养24h后，采用mrs培养基对乳酸菌进行计数、采用vrba培养基对大肠菌群进行计数、采用cfc培养基对假单胞菌进行计数，结果如表5所示。

表5菌株pcyty-7的抑菌能力测试

由表5可得，菌株pcyty-7分别与5株革兰氏阴性菌共同培养与蔬菜汁培养基中，培养24h后，菌株pcyty-7的的数量出现增长，而革兰氏阴性菌的数量都出现下降。因此，菌株pcyty-7对泡菜常见革兰氏阴性菌均有抑制作用。8.菌株pcyty-7在泡菜中的应用

将菌株pcyty-7以10⁷cfu/ml接种于自制泡菜中，平行重复3次，不接菌的自制泡菜作为空白，分别10℃和25℃恒温培养，在培养1、3、5、7、10、15、20天时进行取样，测定泡菜的ph、总酸、亚硝酸盐、生物胺的含量。将菌株pcyty-7以10⁷cfu/ml接种于自制泡菜中，每2天更换一次菜，检测多轮发酵时候稳定，同时取发酵20代的泡菜样品进行宏基因组测序，探究噬菌体的含量。实验结果如表5和图3所示。由图3可得，多轮发酵第20代后，将泡菜样品进行宏基因组测序，接种菌株pcyty-7发酵的泡菜的噬菌体基因序列数少于自然发酵泡菜，且接菌发酵泡菜在发酵20代后，泡菜液体仍无出现液体变粘稠，产生异味等现象，发酵较稳定。

表5菌株pcyty-7的抑菌能力测试

由表5可得，菌株pcyty-7分别与5株革兰氏阴性菌共同培养与蔬菜汁培养基中，培养24h后，菌株pcyty-7的的数量出现增长，而革兰氏阴性菌的数量都出现下降。因此，菌株pcyty-7对泡菜常见革兰氏阴性菌均有抑制作用。

表6菌株pcyty-7在泡菜发酵中的应用

由表6可以得出，接种菌株pcyty-7发酵的泡菜无论在10℃还是在25℃培养，成熟周期较短，发酵迅速，且亚硝酸盐和生物胺含量较低。

以上所述实例仅是本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围之内。