本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种蛋清蛋白-植物多酚共价复合物及其制备方法。
背景技术：
鸡蛋蛋清蛋白作为一种天然乳化剂，因乳化性能良好、营养价值高、生物相容性高等优点，正受到研究者的广泛关注。然而，蛋清蛋白对乳液体系的稳定是有条件的，相对的。在蛋清蛋白质乳液储藏过程中，以及乳液的热处理及剪切处理等加工操作容易使蛋清蛋白分子失去表面水化层的保护，进而引起蛋清蛋白的氧化聚集和沉淀，进而影响蛋白质的乳化性能。而来源广泛、抗氧化性强、食用安全的天然抗氧化剂－多酚类化合物由于其分子结构中存在多个反应活性基团和活性部位易与蛋清蛋白质发生共价接枝反应，而研究发现多酚与蛋白质的共价结合能够不可逆地提高蛋白质的乳化特性。
目前，蛋白质-多酚共价复合物的制备方法主要有碱法、酶法和自由基法。其中碱法和酶法的作用机理相似，主要是通过碱或者酶诱导多酚氧化形成醌进而与蛋白质发生反应，但易造成多酚的过度氧化，而生成较多的不良醌类聚合物，进而造成产品色泽的变化和营养质量的下降。与碱法和酶法相比，自由基法反应条件温和，室温下即可进行，且可在一定程度上防止抗氧化剂的降解，适用于生产稳定的功能性蛋白原料。然而传统的自由基法是将蛋白质和多酚制成一定浓度的溶液，然后根据所需的质量(或摩尔比)混合均匀后置于25℃下反应24～48h，反应时间长，能耗高，且在反应时需要严格控制反应温度而不能满足工业化生产中缩短生产周期和节约成本的要求。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明提供了一种蛋清蛋白-植物多酚共价复合物及其制备方法，该方法通过超声波结合植物多酚共价修饰提高蛋清蛋白氧化稳定化和乳化性，具体是以蛋清蛋白为原料，以植物多酚为化学改性试剂，以抗坏血酸/过氧化氢为自由基引发剂，利用逆流超声波处理技术或多频超声处理技术的空化效应加速了蛋清蛋白的自由基氧化进程，进而加速了蛋清蛋白和植物多酚之间的共价交联反应。相比于未经修饰的蛋清蛋白，蛋清蛋白-植物多酚共价复合物同时具有显著的氧化稳定性和高乳化性，通过该方法制备的是一种新型的双功能蛋粉制品。
本发明的技术方案是：一种蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)蛋清蛋白溶液的分离和杀菌；
步骤(2)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备：将经过步骤(1)处理得到的蛋清蛋白溶液，调节ph后加入过氧化氢和抗坏血酸，混合后加入植物多酚，并置于超声波反应系统中进行超声波处理协同自由基改性反应，所述超声波处理为逆流超声波处理或多频超声处理，得到蛋清蛋白-植物多酚共价复合物。
上述方案中，所述步骤(1)蛋清蛋白溶液的分离和杀菌包括以下步骤：
将新鲜鸡蛋浸泡在温水中清洗干净，再用氯水清洗蛋壳，最后再用清水冲洗蛋壳表面的残余氯，晾干后打蛋并分离蛋清和蛋黄，去除蛋清液中的系带，之后在低温下搅拌至蛋清蛋白溶液液均匀，然后将分散均匀的蛋清蛋白溶液进行温度为55～57℃，3～4min巴氏杀菌处理，之后干燥备用。
上述方案中，所述步骤(2)中蛋清蛋白与植物多酚的重量比为10:1。
上述方案中，所述步骤(2)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备具体为：
配置浓度为1％的所述步骤(1)得到的蛋清蛋白溶液100ml，并调节ph至3.0，后加入1ml的5mol/l过氧化氢和0.25g的抗坏血酸粉末，使其充分混合，随后加入0.1g的植物多酚溶液，并置于超声波反应系统中进行超声波处理协同自由基改性反应，反应时间为20～60min，所述超声波处理为逆流超声波处理或多频超声处理模式，得到蛋清蛋白-植物多酚共价复合物。
进一步的，所述步骤(2)中反应时间为50～60min。
上述方案中，所述植物多酚为茶多酚、儿茶素、绿原酸或表没食子儿茶素没食子酸酯。
上述方案中，所述超声波处理为逆流超声波处理；
所述逆流超声波处理的参数为：脉冲宽度5s、超声波间隔时间3s、超声频率40khz、超声功率密度100w/l，料液以逆流循环的方式通过超声探头。
上述方案中，所述超声波处理为多频超声处理模式；
所述多频超声处理模式为三频同步超声处理，或双频同步超声处理，或单频超声处理，多频超声处理参数为：超声功率密度100w/l，超声脉冲工作时间10s，脉冲间歇时间5s，超声时间60min。
进一步的，所述三频同步超声处理的超声波为20/28/40khz；所述双频同步超声处理的超声波为20/40khz，所述单频处理的超声波为40khz。
上述方案中，还包括步骤(3)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的纯化及干燥；
所述蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的纯化及干燥具体为：将所述步骤(2)反应后的蛋清蛋白-植物多酚共价复合物溶液进行透析，去除未反应的游离植物多酚，收集透析液并干燥处理。
本发明还提供一种根据所述的制备方法制备得到的蛋清蛋白-植物多酚共价复合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明相比于传统的自由基法，本发明采用绿色、无污染的逆流超声波技术及多模式超声波技术协同传统自由基法制备兼具抗氧化性及高乳化性的蛋清蛋白-植物多酚共价复合物，该法操作简单，条件温和，而且无有毒有害副产物的产生。
2、本发明基于逆流超声波或多模式超声波技术的空化效应加速蛋清蛋白的自由基氧化进程，加速蛋清蛋白与多酚化合物的共价交联，进而缩短反应时间。
3、本发明与未经修饰的蛋清蛋白相比，基于本发明方法制备的蛋清蛋清-多酚共价复合物其抗氧化性和乳化性均显著提高。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另外说明，一般都能被本领域普通技术人员理解。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。特此说明这些实施例只是为了举例说明本发明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明引入逆流超声波处理技术或多频超声处理技术协同传统自由基法，利用超声波的空化效应，热效应、机械效应和化学效应提高蛋清蛋白与植物多酚的接枝效率，缩短反应时间，同时获得一种抗氧化性和乳化性均显著改善的蛋清蛋白-植物多酚共价复合物。
所述蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)蛋清蛋白溶液的分离和杀菌；(2)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备；(3)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的纯化及干燥；(4)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物抗氧化性的测定；(5)以蛋清蛋白-植物多酚共价复合物为乳化剂的β–胡萝卜素乳液的制备。
(1)蛋清蛋白溶液的分离和杀菌具体为：将经检查且蛋壳完整无损的新鲜鸡蛋浸泡在30℃左右的温水中清洗干净，再用50mg/l的氯水清洗蛋壳，最后再用清水冲洗蛋壳表面的残余氯，室温下晾干后打蛋并分离蛋清和蛋黄，去除蛋清液中的系带，之后在低温下搅拌20min至蛋清液均匀，然后将分散均匀的蛋清溶液，进行55～57℃，3～4min的传统巴氏杀菌处理，之后干燥备用。
所述干燥为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
(2)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备具体为：配置浓度为1％的蛋清蛋白溶液100ml，并调节ph至3.0；后加入1ml5mol/l的过氧化氢和0.25g的抗坏血酸粉末，使其充分混合；随后加入一定比例的植物多酚溶液于上述溶液中，并置于超声波反应系统中协同反应20～60min，得到蛋清蛋白-植物多酚共价复合物，所述超声波处理为逆流超声波处理或多频超声处理模式。
所述物质多酚可以为茶多酚、儿茶素、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯。
当采用逆流超声波处理时，所述逆流超声波处理优选参数为：脉冲宽度5s、超声波间隔时间3s、超声频率40khz、超声功率密度100w/l，料液以逆流循环的方式通过超声探头。
当采用多频超声处理模式，所述多频超声处理模式可以为三频同步超声处理，或双频同步超声处理，或单频超声处理，参数优选为：超声功率密度100w/l，超声脉冲工作时间10s，脉冲间歇时间5s，超声时间60min。
(3)清蛋白-植物多酚共价复合物的纯化及干燥具体为：将反应后的蛋清蛋白-植物多酚共价复合物溶液进行透析，去除未反应的游离植物多酚，收集透析液并干燥处理。所述干燥为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
(4)蛋清蛋白-植物多酚共价复合物抗氧化性dpph·自由基清除能力的测定具体为：
配制浓度为1mg/ml蛋清蛋白-植物多酚共价复合物样品贮液，稀释成浓度为0、0.02、0.04、0.08、0.2mg/ml的样品溶液各2ml，加入0.125mmol/ml的dpph乙醇溶液2ml(0.0049gdpph溶于100ml95％乙醇中，超声5min使其溶解，避光保存)，振荡摇匀，于室温下放置30min后，在517nm处测定吸光值a样品。取上述浓度样品各2ml，加入95％乙醇2ml做对照，于517nm处测定吸光度值a对照，以2ml去离子水和2ml95％乙醇为空白校正。测定2mldpph和2ml蒸馏水于517nm处的吸光值为a空白，dpph·清除率(％)计算公式如下：
(5)以蛋清蛋白-植物多酚共价复合物为乳化剂的β–胡萝卜素乳液的制备具体为：
以步骤(3)制备所得的蛋清蛋白-茶多酚共价复合物作为乳化剂制备水包油型β–胡萝卜素乳液。将所述蛋清蛋白-植物多酚共价复合物冻干粉溶解于10mmol/lph7.0磷酸盐缓冲液中，搅拌过夜确保完全分散和溶解，得到浓度为1％(w/w)的蛋清蛋白-植物多酚共价复合物溶液作为水相，同时加入0.02％(w/w)的抗菌剂。将β–胡萝卜素(0.1％，w/w)分散到大豆油中，50℃超声处理20min至完全溶解，作为油相。然后，将水相与油相以质量比9:1混合，用高速分散器搅拌2min，速度为15000r/min，形成粗乳液，然后用高压均质机进一步均质(60mpa)重复均质3次后立冷却至室温，4℃避光保存以备后续测定。β–胡萝卜素遇光易氧化降解，实验过程中用锡箔纸做好避光处理。
本发明中所述的植物多酚可以为茶多酚、儿茶素、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯，下面仅以茶多酚为例详细描述本发明。
对照组：传统自由基法(不引入超声波)
蛋清蛋白-植物多酚共价复合物的制备方法，按照下述步骤进行：
(1)将经检查且蛋壳完整无损的新鲜鸡蛋浸泡在30℃左右的温水中清洗干净，再用50mg/l的氯水清洗蛋壳，最后再用清水冲洗蛋壳表面的残余氯，室温下晾干后打蛋并分离蛋清和蛋黄，去除蛋清液中的系带，之后在低温下搅拌20min至蛋清液均匀，获得分散均匀的蛋清溶液；
(2)将步骤(1)处理得到的蛋清溶液进行55～57℃，3～4min的巴氏杀菌；
(3)将步骤(2)巴氏杀菌处理后的蛋清溶液进行喷雾干燥处理，具体条件为：进风温度为150℃，出风温度为75℃，喷雾干燥后使其自然冷却，之后将其过30目筛除去粗大颗粒，最后将其进行真空包装，得到蛋清粉成品；
(4)取步骤(3)干燥后的蛋清蛋白粉配置成1％w/v，ph3.0的蛋清蛋白溶液，取100ml加入1.0ml过氧化氢溶液和0.25g抗坏血酸，于室温条件下进行充分混合，随后加入0.1g茶多酚粉末，于25℃条件下继续反应24h。将反应后的溶液进行透析，将透析液喷雾干燥，得蛋清蛋白-茶多酚共价复合物，测定复合物的抗氧化性和乳化特性。
(5)以步骤(4)制备所得的蛋清蛋白-茶多酚共价复合物为乳化剂的β–胡萝卜素乳液制备及表征：
以步骤(4)制备所得的蛋清蛋白-茶多酚共价复合物作为乳化剂制备水包油型β–胡萝卜素乳液。将蛋清蛋白-茶多酚共价复合物冻干粉溶解于10mmol/lph7.0磷酸盐缓冲液中，搅拌过夜确保完全分散和溶解，得到浓度为1％w/w的蛋清蛋白-茶多酚共价复合物溶液作为水相，同时加入0.02％w/w的抗菌剂。将0.1％，w/wβ–胡萝卜素分散到大豆油中，50℃超声处理20min至完全溶解，作为油相。然后，将水相与油相以质量比9:1混合，用高速分散器搅拌2min，速度为15000r/min，形成粗乳液，然后用高压均质机在60mpa下进一步均质，重复均质3次后立冷却至室温，4℃避光保存以备后续测定。β–胡萝卜素遇光易氧化降解，实验过程中用锡箔纸做好避光处理。
β–胡萝卜素乳液ζ–电位和粒径的测定：用蒸馏水将乳液稀释到蛋白质浓度为0.1％，使用zeta电位粒径分析仪测定乳液的电位变化。用蒸馏水按照体积比20:1稀释乳液后通过激光粒度仪测定乳液的粒径。
实施例1-5逆流超声波技术协同传统自由基法
蛋清蛋白-茶多酚共价复合物的制备方法，按照下述步骤进行：
(1)将经检查且蛋壳完整无损的新鲜鸡蛋浸泡在30℃左右的温水中清洗干净，再用50mg/l的氯水清洗蛋壳，最后再用清水冲洗蛋壳表面的残余氯，室温下晾干后打蛋并分离蛋清和蛋黄，去除蛋清液中的系带，之后在低温下搅拌20min至蛋清液均匀，获得分散均匀的蛋清溶液；
(2)将步骤(1)处理得到的蛋清溶液进行55～57℃，3～4min巴氏杀菌。
(3)将步骤(2)巴氏杀菌处理后的蛋清溶液在-20℃，进行48h冷冻干燥处理，最后将其进行真空包装，得到蛋清粉成品。
(4)取步骤(3)干燥后的蛋清蛋白粉配置成1％(w/v)，ph3.0的蛋清蛋白溶液，取100ml加入1.0ml过氧化氢溶液和0.25g抗坏血酸，于室温条件下进行充分混合，随后加入0.1g茶多酚粉末，用40khz的超声波处理蛋清蛋白与多酚的混合溶液，超声处理条件：功率100w，温度25℃，时间20～60min，见表1，脉冲宽度5s、超声波间隔时间3s。将反应后的溶液进行透析，将透析液喷雾干燥，得到蛋清蛋白-茶多酚共价复合物。
(5)以步骤(4)制备所得的蛋清蛋白-茶多酚共价复合物作为乳化剂制备水包油型β–胡萝卜素乳液。将蛋清蛋白-茶多酚共价复合物冻干粉溶解于10mmol/lph7.0磷酸盐缓冲液中，搅拌过夜确保完全分散和溶解，得到浓度为1％(w/w)的蛋清蛋白-茶多酚共价复合物溶液作为水相，同时加入0.02％(w/w)的抗菌剂。将0.1％，w/wβ–胡萝卜素分散到大豆油中，50℃超声处理20min至完全溶解，作为油相。然后，将水相与油相以质量比9:1混合，用高速分散器搅拌2min，速度为15000r/min，形成粗乳液，然后用高压均质机进一步均质重复均质3次后立冷却至室温，4℃避光保存以备后续测定。β–胡萝卜素遇光易氧化降解，实验过程中用锡箔纸做好避光处理，之后测定乳液的电位和多分散系数(pdi)。
表1不同逆流超声波(40khz)处理时间对蛋清蛋白-茶多酚共价复合物抗氧化性和乳液性能的影响
注：表中dpph·清除能力的测定是在蛋清蛋白-茶多酚共价复合物的浓度为0.2mg/ml条件下测定的。
由表1可知，蛋清蛋白经茶多酚共价改性后，其dpph·清除能力从11.8％增加到了46.3％～87.3％，抗氧化性显著提高，其中以超声波协同反应50～60min的效果提升最为显著。此外，乳液的zeta电位的绝对值越高，说明液滴的界面膜强度越大，此种乳状液就越稳定；pdi越小，乳液的粒径分布越窄，而蛋清蛋白质经茶多酚共价修饰后，较高的乳液zeta电位和较窄的乳液粒径分布说明乳液的稳定性也得到了显著改善。
相比于传统自由基改性法水浴24h，逆流超声波技术可以加速蛋清蛋白与多酚化合物的共价交联，反应时间为20～60min，显著地降低蛋清蛋白和茶多酚的共价改性时间。改法操作简单，条件温和，反应结束后采用透析法去除了未反应的自由基引发试剂，因此无有毒有害副产物的存在和产生。
实施例6-10多模式超声波技术协同传统自由基法
除了超声设备和超声参数有所改变，实施例6-10制备过程与实施例1-5相同。表2是不同超声波模式对蛋清蛋白-茶多酚共价复合物抗氧化性、乳液电位和pdi的影响。
表2超声波模式对蛋清蛋白-茶多酚共价复合物抗氧化性和乳液性能的影响
注：表中dpph·清除能力的测定是在蛋清蛋白-茶多酚共价复合物的浓度为0.2mg/ml条件下测定的。
由表2可知，采用上述几种超声波模式协同茶多酚自由基共价改性均可以显著提高蛋清蛋白的dpph·清除能力，进而提高其抗氧化性，其中以超声波40khz单频处理和超声波20/28/40khz三频同步处理的改善效果最为显著。
此外，除20/28khz双频同步超声处理，超声波协同茶多酚共价修饰后较高的乳液zeta电位和较窄的乳液粒径分布说明乳液的稳定性也得到了显著改善。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。