专利名称：加酶洗涤剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及加酶洗涤剂和清洁剂领域。更具体地说，本发明涉及含有具有脂解活性酶的加酶洗涤剂组合物。
已知各种类型的酶作为洗涤剂组合物的添加剂。例如，在文献中已经描述了含有蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶及其各种混合物的洗涤剂组合物，并且市场上已出现几种这样的产品。本发明涉及含有脂解酶或脂肪酶的洗涤剂组合物。这样的酶可以有助于通过水解三甘油脂中的一个或多个酯键从织物上除去脂肪污垢。
EP-A-214761(Novo Nordisk)公开了从Pseudomonas cepacia类有机体得到的脂肪酶，EP-A-258068(Novo Nordisk)公开了从Thermomyces(以前名称是Humicola)属有机体得到的脂肪酶。这两篇专利申请也描述了这些脂肪酶作为洗涤剂添加剂的应用。
EP-A-205208和EP-A-206390(二篇都是Unilever的)提供了另外的含有脂肪酶的洗涤剂组合物的例子，它们公开了一类按照它们的免疫关系定义的脂肪酶，并描述了在洗涤剂组合物和纺织品洗涤中它们的应用。优选的脂肪酶是那些从Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas gladioli和Chromobacter物种得到的脂肪酶。
EP-A-331376(Amano)描述了一些脂肪酶、它们的应用及它们的使用重组DNA(rDNA)技术的生产方法，并包括一种从Pseudomonas cepacia得到的脂肪酶的氨基酸序列。在WO-A-89/09263和EP-A-218272(二篇都是Gist-Brocades的)中给出了用重组DNA技术生产的脂肪酶的另外的例子。
尽管公开了大量的脂肪酶和它们的改进，但是，至今已发现仅仅从Humicola lanuginosa得到的及在Aspergillus Oryzae作为宿主中生产的脂肪酶广泛用作织物洗涤产物的添加剂。其可以以商标Lipolase(TM)从Novo-Nordisk买到。
在化学和工业杂志，1990，第183-186页Henrik Malmos的文章中，Henrik Malmos指出，人们知道在洗涤过程中脂肪酶的活性一般是低的，Lipolase(TM)并不例外。在干燥过程中，当织物的水含量减少时，该酶恢复了它的活性，脂肪活斑水解。在其后的洗涤周期中，除去该水解的物质。这也解释为什么在第一洗涤周期之后脂肪酶的作用是低的，但在后面的周期中是明显的。Aaslyng等人(1991)在“Mechanistic studies of proteases and Lipases for the Detergent Industry”(J.Chem Tech.Biotechnol.50，321-330)中也描述了这些发现。
本申请的发明人把其作为含有脂肪酶的现有洗涤剂产品的缺点，即当用这些产品洗涤在这之前没有与该洗涤剂产品接触的织物时，可以预计用脂解酶没有明显的优越性。
另外，在欧洲和美国，在自动洗衣机的用户当中，使用滚筒干燥机来干燥洗涤的织物有增长的趋势。在这些机器中，湿的衣服通过与热空气接触迅速地干燥。使用滚筒干燥机可以把在室温下通常需要干燥6-48小时的干燥过程减少到少于1小时。如上所述，在干燥过程中，当织物的水含量减少时，脂肪酶恢复它的活性。当用滚筒干燥机时，对于脂肪酶来讲最佳水含量的周期大大缩短。因此，当在滚筒干燥机中包括干燥步骤的洗涤过程中使用含有通常的脂肪酶的洗涤剂产品时，消费者从这样的产品得到的好处很少。
因此，本发明的一个目的是提供一种加酶洗涤剂组合物，该组合物在自动洗衣机中洗涤过程的主要周期中显示出明显地脂解活性，因此，当其用于洗涤在此之前没有与该洗涤剂产品接触的织物时其将显示出脂解活性。提供特别适用于与滚筒干燥机结合使用的加酶洗涤剂组合物也是本发明的一个目的。
本发明的另一个目的是提供一种生产在自动洗衣机中的洗涤过程的主要周期中显示明显地脂解活性的这样酶的方法。
现在我们惊奇的发现存在可用于配制在洗涤过程的主要周期中显示明显的脂解活性的洗涤剂组合物的脂解酶。此外，我们已发现在洗涤过程的主要周期中显示这样的脂解活性的能力和用氟代磷酸二异丙基酯(DFP)时它们的失活性能之间有一种很好的关系。于是，合适的脂解酶通常可以根据DFP时它们失活性能来选择。特别是发现真核来源的角质酶是在洗涤过程的主要周期中显示这样一种脂解作用的合适的酶。
WO-A-88/09367(Genencoy)提出把表面活性剂与基本上纯的微生物的角质酶混合来配制有效的清洁剂。公开了含有从(原核生物)Pseudomonas putida ATCC 53552得到的角质酶的洗涤剂组合物。但是，在更近期的欧洲专利申请EP-A-476915(Clorox)中，公开了同样的酶(当时称为脂肪酶)，当用通常的方法使用时，在从织物上除去油垢方面该酶不比其他的脂肪酶更有效。换句话说，不认为这样酶显示洗涤效果。
WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)描述了从Fusarium solani pisi在大肠杆菌(E.Coli)中克隆和生产真核角质酶，并特别提到这种角质酶可以用于生产清洁剂，如洗衣用洗涤剂和其他特殊的脂肪溶解的制剂，如化妆组合物和洗发剂。没有公开或提出特殊的加酶洗涤剂组合物，因此技术熟练的人不会受到启发来选择这种特殊酶以配制用于织物洗涤的洗涤剂组合物。
根据本发明的第一个方面，提供一加酶洗涤剂组合物，包括(a)0.1-50%(重量)活性体系，该体系含有(a1)0-95%(重量)一种或多种阴离子表面活性剂和(a2)5-100%(重量)一种或多种非离子表面活性剂;和(b)每克洗涤剂组合物10-20000LU酶，在洗涤过程的主要周期中该酶能够显示出明显的脂解活性。
根据本发明的第二个方面，提供一种根据用氟代磷酸二异丙基酯(DFP)酶失活的性能鉴别和选择在自动洗衣机中在洗涤过程的主要周期中显示明显的脂解活性的酶的方法。
根据本发明的另一个方面，提供一种生产这样酶的方法。
(a)表面活性剂体系本发明的一个方面是提供一种加酶洗涤剂组合物，含有0.1-50%(重量)活性体系，其依次含有0-95%(重量)一种或多种阴离子表面活性剂和5-100%(重量)的一种或多种非离子表面活性剂。该表面活性剂体系另外可以含有两性或两性离子洗涤化合物，但是，由于它们的费用比较高，所以通常这是不需要的。
一般，该表面活性剂体系的非离子和阴离子表面活性剂可以选自下列文献中描述的表面活性剂Schwartz和Perry，“Surface Active Agent”Vol.1，Schwartz，Perry和Berch，Interscience，vol.2;Interscience，1958;由Manufacturing Confectioners Company出版的最近版本的“McCutcheon′s Emulsifiers and Detergents”，或H.Stache，Carl Hauser Verlag，1981，第二版的“Tenside Tanschenbuch”。
可以使用的合适的非离子化合物特别是包括带有疏水基的化合物与活性氢原子的反应产物，例如脂肪醇、酸、酰胺或烷基酚与烯化氧，特别是单独的环氧乙烷或与环氧丙烷一起的反应产物。特定的非离子洗涤剂化合物是C6-C22烷基酚-环氧乙烷缩合物，一般是5-25EO，即每个分子5-25个环氧乙烷单元，及脂族C8-C18伯或仲直链或支链醇与环氧乙烷的缩合产物，一般5-40EO。
可以使用的合适的阴离子洗涤化合物通常是带有含约8-22个碳原子的烷基的有机硫酸和磺酸的水可溶的碱金属盐，所用的术语烷基包括高级酰基的烷基部分。合适的合成阴离子洗涤化合物的例子是烷基硫酸钠和烷基硫酸钾，特别是通过硫酸化由动物脂或椰子油生产的高级C8-C18醇得到的那些，C9-C20烷基苯磺酸钠和钾，特别是直链仲C10-C15烷基苯磺酸钠，和烷基甘油醚硫酸钠，特别是从动物脂或椰子油得到的高级醇和由石油得到的合成醇的那些醚的硫酸钠。优选的阴离子洗涤化合物是C1-C15烷基苯磺酸钠和C12-C18烷基硫酸钠。
也可以用的是表面活性剂，如在EP-A-328177(Unilever)中描述的那些表面活性剂，它们能耐盐析，在EP-A-070074中描述的烷基聚苷表面活性剂和烷基单苷。
优选的表面活性剂体系是阴离子与非离子洗涤活性物质的混合物，特别是在EP-A-346995(Unilever)中指出的阴离子和非离子表面活性剂的种类和例子。特别优选的表面活性剂体系是C16-C18伯醇硫酸碱金属盐与C12-C15伯醇3-7EO乙氧基化物的混合物。
非离子洗涤剂的存在量优选的是大于表面活性剂体系10%，例如25-90%(重量)。阴离子表面活性剂的存在量例如可以约为表面活性剂体系的5%-40%(重量)。
(b).酶本发明的加酶洗涤剂组合物还含有每克洗涤剂组合物10-20000LU，优选50-2000LU酶，该酶在洗涤过程的主要周期中可显示显著的脂解活性。在本说明书中，LU或脂肪酶单位是按EP-A-258068(Novo Nordisk)的单位定义的。
由于在洗涤过程中的主要周期中显著的脂解活性或洗涤的效果，就意味着含有酶的洗涤剂组合物能够在欧洲型的自动洗衣机中，在单一洗涤过程中，就浓度、水硬度、温度而言使用通常的洗涤条件，能从污染的织物中除去大量的油垢。应该记住，在同样的条件下，通常的市场上可以从Novo Nordisk买到的脂解酶Lipolase(TM)似乎没有任何对油垢的有效的洗涤效果。
酶对油垢的洗涤效果可以用下面的分析方法评定。用无酶的洗涤剂产品(如下面给出的)预洗涤含棉33%的新的聚酯/棉试验织物，接着彻底地漂洗。然后将这样的未污染的织物用橄榄油或其他合适的可水解的油垢弄污。把每一试验织物(重约1g)在100ml聚苯乙烯瓶中的30ml洗液中保温。洗液含有下面给出的每升1克剂量的洗涤剂产品。将这些瓶子放在装水的Miele TMT洗衣机中并用正常的30℃主洗涤程序搅拌30分钟。把有脂解活性的酶以3LU/ml预先加到洗液中。对照组不含任何酶。该洗粉有下列组成(重量%)乙氧基化的醇非离子表面活性剂 9.5硫酸钠 38.6碳酸钠 40.4硅酸钠(Na2O∶Si2O＝2.4) 7.3水 4.2作为非离子表面活性剂，我们用10.5-13EO乙氧基化的C12-C15醇，但是发现乙氧基化的醇非离子表面活性剂的性质可以在很宽范围内变化。
洗涤之后，用冷水彻底漂洗这些织物，并在滚筒干燥机中用冷空气干燥，并评估残余的脂肪的量。这可以用几种方法进行，通常的方法是在Soxhlet萃取设备中用石油醚萃取试验织物，蒸出溶剂，并测定残余的脂肪物质作为织物上初始脂肪量的百分数(重量)。
根据第二个更敏感的方法，用溴化橄榄油弄脏试验织物(Richards，S.，Morris，M.A.和Arklay，T.H.1968)，Textile Research Journal 38，105-107)。然后，把每一试验织物放在100ml聚苯乙烯瓶中的30ml洗液中保温。然后把这些瓶子放在装水的洗衣机中并用正常的30℃主洗涤程序搅动。主洗之后，仔细把试验织物用冷水漂洗5秒钟。漂洗之后，立即在干燥机中用冷空气干燥试验织物。干燥之后，可以用X-射线荧光光谱法测定织物的溴含量来确定残留的脂肪的量。可以确定脂肪的除去量，其作为开始存在于试验织物上的量的百分数，计算如下
除去的污物%＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ×100%其中，溴bw表示洗涤前织物上的溴的百分数，溴aw表示洗涤之后溴的百分数。
评估酶的活性的另一种方法是按照标准的方法在460nm测定反射率。
按照本发明，该洗涤剂组合物包括一种酶，该组合物与没有酶的同样的洗涤剂组合物相比，可以除去至少多于5%，优选至少多于10%的油污(按初始油污计量)，其用本说明书中介绍的试验方法测定。
确定酶活性的另一种方法是把其与市场上可买到的Lipolase(TM)，即可以从Novo/Nordisk得到的脂肪酶的活性进行比较。按照本发明，用此处所介绍的试验方法，由酶除去的酶油垢与由Lipolase(TM)除去的酶油垢的比值至少3，优选至少5。除去的酶油垢的意思是可以归因于酶的存在除去的污垢，即减去作为本底的在不存在酶时观察到的除去的污垢。
既然本申请已经公开了可以配制具有明显洗涤效果的洗涤剂组合物，技术熟练的人会很清楚怎样选择用于本发明的合适的酶。但是，我们已发现一种非常方便的方法来选择本发明组合物的合适的脂解酶，该方法是根据我们发现的脂解酶的洗涤效果紧密地与用氟代磷酸二异丙基酯(DFP)时它们的失活性能相关。一般都知道，这种化合物与脂解酶中的活性部位丝氨酸残基迅速反应，因此其就失去它们的酶活性。我们发现，被DFP迅速失活的即具有可以使用的活性部位丝氨酸残基的脂解酶一般有很好的洗涤效果。另一方面，较慢地被DFP失活即具有不可以使用的活性部位的丝氨酸残基的脂解酶一般没有或有很少的洗涤效果。我们发现在室温下pH为10时用DFP保温10分钟后，显示出残留活性小于50%，优选小于40%的脂解酶具有很好的洗涤效果。发现用具有残留活性小于25%的脂解酶的洗涤效果甚至更好，用具有残留活性小于15%的脂解酶的洗涤效果最好。DFP失活试验的详细情况可以在实施例中找到。
本发明的组合物合适的酶可以在酯酶和脂肪酶类中找到，(EC3.1.1.＊，其中＊表示任意数)。
根据本发明，显示洗涤效果的更优选型的酶是真核角质酶。角质酶是酶的小类(EC3.1.1.50)，蜡酯水解酶。这些酶能够减少角质，即酯化的长链脂肪酸和在植物中纯在的作为叶子和茎的保护涂层的脂肪醇的网状物。另外，它们具有一些脂解活性，即它们能水解三甘油脂。因此，可以把它们看作特殊种类的脂肪酶。
脂肪酶的特征是它们呈现界面活化作用。这就意味着在已形成界面或胶束的底物上的酶活性比在完全溶解的底物上的酶活性要高得多。当底物浓度增加到高于底物的临界胶束浓度(CMC)并且形成时，界面活化作用就使得脂解活性突然增加。通过实验，可以观察到这种现象，其是酶活性与底物浓度的不连续的关系曲线图。但是，与脂肪酶相反，角质酶不显示任何明显的界面活化作用。
因为这一特征，即不存在界面活化作用，对本专利申请来说，我们规定角质酶作为脂解酶，其基本上不显示界面活化作用。因此，角质酶不同于古典的脂肪酶，它们不具有复盖催化结合部位的螺旋形的盖。
由于它们的脂肪降解性能，一般提出角质酶作用加酶洗涤剂组合物的组分。例如，WO-A-88/09367(Genencor)提出把表面活性剂与基本上纯的微生物角质酶混合配制成有效的清洁剂。所公开的是含有一种从Gram阴性细菌Pseudomonas Putida ATCC 53552得到的(原核生的)角质酶的洗涤剂组合物。但是，如上所述，在较近期的欧洲专利申请EP-A-476915(Clorox)中，公开了同样的酶(后来称为脂肪酶)，当用常规方法使用时，在从织物上除去油垢方面，与其他脂肪酶比较，其没有更好的作用。
已经从Fusarium solani pisi克隆出角质酶基因并已测定顺序(Ettinger等，(1987)，Biochemistry 26，7883-7892)。WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)描述了在大肠杆菌(E.Coli.)中克隆和生产这种基因。在含水和非水介质中该角质酶可以有效地催化酯的水解和合成，但是，在角质酶和底物之间不存在和存在界面。根据它的一般的稳定性，提出这种角质酶可以用于生产清洁剂，如洗衣用洗涤剂和其他特殊的脂肪溶解的制剂，如润肤组合物和洗发剂。以经济可行的方式生产这种酶的方法没有公开，二者都不是含该角质酶的特殊的加酶洗涤剂组合物。
可以从许多来源如植物(例如花粉)、细菌和真菌得到角质酶。用于本发明的角质酶选自真核角质酶类。这样的真核角质酶可以从各种来源如植物(例如花粉)或真菌得到。
(真核)真菌角质酶类好像包括具有不同特性即叶特性和茎特性的两个家族。具有叶特性的角质酶往往有酸性或中性pH最佳值，而具有茎特性的角质酶往往有碱性pH最佳值。具有碱性pH最佳值的角质酶更适用于碱性助剂的洗涤剂组合物，如重役织物洗粉和洗液。有酸性到中性pH最佳值的角质酶更适合于轻役产品或漂洗调理剂，但是也适合于工业清洁产品。
在下面的表Ⅰ中，列出了四种不同的茎特性角质酶，同时列出了它们的pH最佳值。
表Ⅰ具有茎特性的角质酶的例子 pH最佳值Fusarium solani pisi 9Fusarium roseum culmorum 10Rhizoctonia solani 8.5Alternaria brassicicola(PNBase Ⅰ) 9在本发明中特别优选的是可以从野生的Fusarium Solani Pisi(Ettinger等，1987)得到的角质酶。当用于合适的洗涤剂组合物中时，这种角质酶显示明显的洗涤效果。
本发明另外优选的是比从Fusarium solani pisi得到的对其具有高度同系现象的氨基酸序列的角质酶。例子是从Colletotrichum capsici，Colletotrichum gloeosporiodes和Magnaporthe grisea得到的角质酶。
不适于本发明的是Humicola lanuginosa脂肪酶，其在EP-A-305216(Novo Nordisk)中作了描述，其是以Lipolase(TM)可从市场卖到的。但是，可以想像到，这种酶可以用rDNA技术改性，这样，在洗涤过程的主要周期中其也显示出明显的脂解活性。这样的改性会影响脂肪酶的结构。因此，需要进行实验，以找到该酶的结构的不可避免的损坏和活性方面的优点之间的平衡。一般优选的改性是其不影响活性部位周围电荷太多。
本发明的脂解酶可以以任何合适的形式，即以颗粒组合物的形式、酶的浆液的形式或与载体物质结合的形式(例如在EP-A-258068中和Novo Nordisk的Savinase(TM)和lipolase(TM)产品)有效地加入到洗涤剂组合物中。把酶加到液体洗涤剂产品中的一种好的方式是以在乙氧基化的醇非离子表面活性剂中含有0.5-50%(重量)的酶的浆液的形式，例如在EP-A-450702(Vnilever)所描述的。
用于本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过克隆酶的基因成为一种合适的生成有机物，如Bacilli或Pseudomonaceae，酵母如Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula或Pichia或真菌如Aspergillus来生产。
产生微生物的天然产生的角质酶通常是植物病原体，这些微生物不是非常适合作为角质酶基因的宿主细胞，因此，(原)角质酶编码基因就整合到rDNA载体上，可转移到rDNA技术的优选的宿主微生物中。为此，可以用基本类似于WO-A-90/09446中所描述的rDNA载体那样的rDNA载体。
为了改善发酵过程的产率，编码角质酶的基因应该转移到在便宜的培养基中快速生长的微生物中，并且能够合成及分泌大量的酶。按照本发明，这样的合适的改善的rDNA(宿主微生物)是细菌，其中包括Bacilli，Corynebacteria，Staphylococci，和Streptomyces，或低级真核生物如Saccharomyces cerevisiae和有关的物种，Kluyveromyces marxianus和有关的物种，Hansenula polymorphagn和有关的物种，和Aspergillus属的物种。优选的宿主微生物是低级的真核生物，因为在发酵过程中这些微生物能很好的产生并分泌酶，并能够糖酵解(glycolysate)角质酶分子。糖基化作用可能归于洗涤剂体系中的再质酶的稳定性。
本发明也提供遗传物质，遗传物质是从引入真核角质酶基因例如由Fusarium solani pisi得到的基因到克隆的rDNA载体中而得到的，使用它们转变新宿主细胞并表达新宿主细胞中的角质酶的基因。
本发明也提供由rDNA技术制得或改善的多核苷酸，其编码这样的角质酶，含这样的多核苷酸的rDNA载体和含这样的多核苷酸和/或这样的rDNA载体的rDNA改善的微生物。本发明也提供相应的编码真核角质酶的多核苷酸，例如具有编码成熟的角质酶的碱基序列的多核苷酸，多核苷酸中最后的转移的密码子接着一个停顿密码子并任意地具有恰恰在编码成熟角质酶的核苷酸序列的上游编码该角质酶的前原序列或原序列的核苷酸序列。
在这样的多核苷酸中，从初始的生物体中得到的角质酶编码核苷酸序列可以以这样一种方式加以改良，即制得至少一个密码子最好是尽可能多的密码子，使得静静地变化形成编码等量氨基酸残基并且是被新宿主优选的密码子，因此，在这种宿主细胞中使用时提供改善稳定性的诱导基因的信使RNA。
编码原角质酶或成熟角质酶的核苷酸序列的上游可以确定编码适合于选择的宿主的信号或分泌顺序的核苷酸序列。因此，本发明的一个实施方案涉及一种rDNA载体，在该rDNA载体中已插入一个编码角质酶或其前体核苷酸序列。
该核苷酸序列例如可以从以下几种序列得到(a)天然存在的核苷酸序列(例如，编码由Fusarium solani pisp产生的原前角质酶或原角质酶的初始的氨基酸序列);
(b)化学合成的由密码子组成的核苷酸序列，这些密码子被新宿主优先选择，并且在新宿主中在稳定的信使RNA中形成核苷酸序列，仍然编码该初始的氨基酸序列;
(c)由在上面的a或b段提到的编码具有不同氨基酸序列的而且在洗涤剂体系中有优异稳定性和/或活性的Fusarium solani pisp角质酶的一种核苷酸序列得到的遗传工程核苷酸序列。
概括地说，rDNA载体能够直接的表达如上所述的在一种优选的最好包含如下组分的宿主中的编码角质酶基因的核苷酸序列(a)编码成熟的角质酶或前角质酶或相应的前角质酶的双链(ds)DNA，其中至少部分前序列恰恰在分泌信号(选择的宿主细胞所优选的)的下游已被除去。在部分应该被转移的基因不是从密码子ATG开始的情况下，ATG密码子应该放在前方。该转移的部分基因总应该以合适的停止密码子完结;
(b)位于编码该角质酶(组分(a))的ds DNA正链的上游的表达调节子(适于选择的宿主有机物);
(c)位于编码角质酶(组分(a)的ds DNA正链下游的终止密码子序列(适于选择的宿主有机物);
(d1)促使ds DNA整合或选择的宿主的基因组的核苷酸序列，或(d2)适于选择的宿主的原始复制品;
(e1)任意地一种(营养缺陷型)选择标记物。该营养缺陷型标记物可以用营养缺陷型标记物的编码区域和缺陷的启动子组成;
(e2)任意地一种包括在选择的宿主中的成熟和/或分泌的一种母体形式的角质酶中的编码蛋白质的ds DNA序列。
这样一种rDNA载体也可以移至如以前所定义的多核苷酸的上游和/或下游，另外的序列便于角质酶的功能表达。该营养缺陷型标记物可以由营养缺陷型标记物的编码区域与缺陷启动子区域组成。
本发明也提供一种生产能够显示洗涤作用的脂解酶的方法，其包括发酵培养人工改性的含有由编码具有洗涤活性的脂解酶的rDNA技术制得的基因的微生物的一些步骤，通过分离由发酵培养液得到的微生物生产的酶或通过从发酵培养液中分离微生物细胞生产的酶，分裂分离的细胞，用物理或化学的浓缩或提纯方法部分提纯，由所述培养液或所述细胞得到的酶。这样的发酵可以是通常的间歇式发酵、进料-间歇式发酵或连续发酵。使用的方法的选择取决于宿主种系，优选下流加工方法(已知方法)。
选择的优选条件是这样的，即通过微生物分泌该酶成发酵培养液，通过过滤或离心分离除去细胞之后从培养液中回收该酶。然后，任意地可以浓缩和提纯该酶到所需要的程度。
除了特定性能的微生物外，发酵过程可以按照公知的发酵方法及通常用的发酵和下流加工设备。
另一方面，本发明提供人工改性的含有具有此处所定义的脂解活性的酶基因并能够生产由所述基因编码的酶的微生物。
本发明还提供带有编码此处所介绍的具有洗涤活性的脂解酶的核苷酸序列的重组DNA载体。
(c)其他组分本发明的加酶洗涤剂组合物另外可以含有5-60%优选20-50%(重量)的洗涤助洗剂。这种洗涤助剂可以是任何能够降低洗涤液中游离钙离子含量并优选提供该组合物具有其他有益性能如产生碱性pH、从织物上除去污垢的悬浮物及软化织物的白土物质的悬浮物的物质。
洗涤助洗剂的例子包括沉淀助洗剂，如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、正磷酸盐;螯合助洗剂，如碱金属三聚磷酸盐或次氮基三乙酸盐;或离子交换助洗剂，如无定形碱金属硅铝酸盐或沸石。
如果本发明的洗涤剂组合物含有助洗剂物质使游离钙的浓度降低到小于1mM，发现对本发明的洗涤剂组合物的脂解活性是特别有利的。
在另外的实施方案中，本发明的加酶洗涤剂组合物也可以包括酶和其他通常用于洗涤剂体系中其他组分的混合物，这些组分包括洗涤剂组合物的添加剂。这些其他组分可以是例如下述文献中所介绍的很多公知的物质的任一种，这些文献是GB-A-1372034(Unilever)、US-A-3950277、US-A-4011169、EP-A-179533(Procter和Gamble)、EP-A-205208和EP-A-206390(Unilever)、JP-A-63-078000(1988)和1988年6月的Research Disclosure 29056，以及这里所述几个说明书的每一个。本发明的洗涤剂组合物的制剂也可以通过参考EP-A-407225(Unilever)的例D1-D14加以说明。
在其中也存在蛋白水解酶或蛋白酶的这样的洗涤剂组合物可以得到特殊的优点。EP-A-271154(Unilever)描述了许多适合的具有PI低于10的蛋白酶。在某些情况下与脂肪酶一起用的蛋白酶可以包括文献中公开的例如BPN型或很多其他型的枯草杆菌蛋白酶，已提出其中某些可用于洗涤剂，例如在下述文献中公开的突变型蛋白酶，这些文献是EP-A-130756或EP-A-251446(Genentech)、US-A-4760025(Genencor)、EP-A-214435(Henkel)、WO-A-87/04661(Amgen)、WO-A-87/05050(Genex)、Thomas等，(1986)，Nature 5，316和5，375-376和J.Mol.Biol.(1987)193，803-813.Russel等(1987)，Nature 328，496-500及其他。
本发明现在将进一步用下面的实施例加以说明。附图有
图1A合成的Fusarium Solani pisi角质酶基因及指定的寡核苷酸的盒1的核苷酸序列。在该盒序列中表明寡核苷酸转换。下部的盒信息指的是开放的译读码(reading frame)外部的核苷酸部位。
图1B合成的Fusarium.solani pisi角质酶基因及指定的寡核苷酸的盒2的核苷酸序列。在该盒序列中表明寡核苷酸转换。
图1C合成的Fusarium solani pisi角质酶基因及指定的寡核苷酸的盒3的核苷酸序列，在该盒序列中表明寡核苷酸转换。下部的盒信息指的是开放译读码外部的核苷酸部位。
图1D编码Fusarium solani pisi前原角质酶的合成的角质酶基因的核苷酸序列。表明了该角质酶前序列、原序列和成熟序列。也表示了用于克隆的部位和寡核苷酸转移。下部的盒信息指的是开放的译读码外部的核苷酸部位。
图2连接Fusarium solani pisi原角质酶编码序列与编码大肠杆菌(E.Coli)PhoA前序列的衍生物的序列的DNA片段的合成的核苷酸序列。表明用于克隆的核糖体的结合部位(RBS)和限制酶部位。也用一个信息密码表明编码的PhoA信号序列和部分角质酶基因的氨基酸序列。
图3盒8的核苷酸序列，SacI-BclI片段，其编码转化酶前序列和成熟Fusarium solani pisi角质酶的编码序列的接合点。
图4通过从PUR2740缺失0.2kb SalⅠ-NruⅠ得到的质粒PUR 2741是一种E.Coli-S.cerevisiae穿梭载体，其包含部分PBR322、由2μm质粒得到的在酵母细胞中的原始复制品、酵母leu2D基因和在控制酵母ga17启动子下，具有植物d-半乳糖苷酶基因编码部位的接合的酵母转化酶信号序列。
图5质粒PUR7219是E.Coli-S.Cerevisiae穿梭载体，其包含部分PBR322、由2μm质粒得到的在酵母细胞中的原始复制品、酵母Leu2D基因和在控制酵母ga17启动子下具有编码成熟的Fusarium Solani Pisi编码部位的接合的酵母转化酶信号序列。
图6质粒PUR2740是E.Coli-S.cerevisiae穿梭载体，其包含部分PBR322、从2μm质粒得到的在酵母细胞中的原始复制品、酵母Leu2D基因和在控制酵母ga17启动子下具有植物-d-半乳糖苷酶基因编码部位的接合的酵母转化酶信号序列。
图7盒5、6和7核苷酸序列，包括不同类型的exla前序列的编码序列和成熟Fusarium solani pisi角质酶的连接。
图8通过在PUC19的SalⅠ部位插入Aspergillus niger Var.awamori基因组的DNA的5.3kb SalⅠ片段得到的质粒PAW14B。
图9通过用含有Fusarium solani pisi前原角质酶编码序列的BSP HI-Af1 Ⅱ片段代表在PAW14B中含有的exlA开放译读码的BSPHI-Af1 Ⅱ片段得到的质粒PUR 7280。于是，在控制A.niger Var.awamori启动子和终止剂下质粒PUR7280含有Fusarium solani pisi前原角质酶基因。
图10通过在PUR7280中诱发A.nidulans amds和A.niger var.awamori pyrG选择标记物得到的质粒PUR7281。
图11DFP-失活后残留活性和各种脂解酶除去污垢的百分数的关系。用下面的缩写Lipolase(TM，ex Novo Nordisk) lipFusarium Solani Pisi Cutinase (例2) CTCandida cylindracea脂肪酶(sigma) candidaChromobacterium viscosum 脂肪酶(sigma) Chrom猪胰脏脂肪酶(sigma) pancrGenencor脂肪酶(Pseudomonas putida的变种ATCC 53552 GenAKG脂肪酶30B(Amano) AKGSDL 195脂肪酶(Showa Denko) SDL
PS.pseudoalcaligines CBS 473.85脂肪酶 PS.ALK图12由Fusarium solani pisi得到的角质酶和脂解酶(TM)的脂解活性的比较。
图13Fusarium Solani Pisi角质酶和脂解酶(TM)对不同类型的污垢的单洗效果。
图14A在几个洗涤周期之后测定的在酶量为1LU/ml下，由Fusarium Solani Pisi得到的角质酶和脂解酶(TM)的效果。
图14B同上，在酶含量3LU/ml。
图14C同上，在酶含量5LU/ml下。
图14D同上，在酶量10LU/ml下。
图15在PAS/非离子型制剂中，用Lipolase(TM)、Pseudomonas gladioli脂肪酶和Fusarium solani pisi角质酶的多周期洗涤试验。
图16在另外的PAS/非离型制剂中，用Lipolase(TM)、Pseudemonas gladioli脂肪酶和Fusarium solani pisi角质酶的多周期洗涤试验。
图17同图16，但是每一周期后重弄脏。
参考文献Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989).Molecular Cloninga laboratory manual(2nd ed).Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.ISNB 0-87969-309-6.
Fürste，J.P.，Pansegrau，W.，Frank，R.，Bloecker，H.，Scholz，P.Bagdasarian，M.and Lanka，E.(1986).Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacp expression vector.Gene 48119-131.
Michaelis et al.(1983).J.Bacteriol 154366-Tartof and Hobbs(1988).Gene 67169-182.
Soliday，C.L.，Flurkey，W.H，Okita，T.W.and Kolattukudy，P.E.(1984).Cloning and structure determination of cDNA for cutinase，an enzyme involved in fungal penetration of plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813939-3943.
Noqi，Y.and Fukasawa，T.(1983).Nucleotide sequence of the transcriptional initiation region of the yeast GAL7 gene.
Nucleic Acids Res.118555-8568.
Taussiq，R.and Carlsson，M.(1983).Nucleotide sequence of the yeast SUC2 gene for invertase.Nucleic Acids Res.111943-1954.
Erhart，E and Hollenberg，C.P.(1981)Curing of Saccharomyces cerevisiae 2-μm DNA by transformation.Curr.Genet.383-89.
Verbakel，J.A.M.V.(1991)Heterologous gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Ph.D.thesis.RijksUniversiteit Utrecht，The Netherlands.
Maat，J.，Roza，M.，Verbakel，J.，Stam，J.，Santos da Silva，M.J.，Bosse，M.，Egmond，M.R.，Hagemans，M.L.D.，v.Gorcom，R.F.M.，Hessing，J.G.M.，v.d.Hondel，C.A.M.J.J.and v.Rotterdam，C.(1992).Xylanases and their application in bakery.InVisser，J.，Beldman，G.，Kusters-van Someren，M.A.and Voragen，A.G.J.(Eds)，Xylans and Xylanases.
Progress in Biotechnology Volume 7，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam.ISBN 0-444-89477-2.
de Graaff，L.H.，van den Broek，H.C.，van Ooijen，A.J.J. and Visser，J.(1992).Structure and regulation of an Asperqillus xylanase gene.InVisser，J.，Beldman，G.，Kusters-van Someren，M.A. and Voragen，A.G.J.(Eds)，Xylans and Xylanases.Progress in Biotechnology Volume 7，Elsevier Science Publishers，Amsterdam.ISBN 0-444-89477-2.
Hankin，L.and Kolattukudy，P.E.(1968).J.Gen.Microbiol.51457-463.
Ettinger，W.F.，Thukral，S.K.and Kolattukudy，P.E.(1987).
Structure of cutinase gene，cDNA，and the derived amino acid sequence from phytopathogenic fungi.Biochemistry 267883-7892.
Huse，W.D.and Hansen，C.(1988).Strategies 11-3.
De Graaff，L.H.，H.W.J. van den Broek and J.Visser(1988).
Isolation and expression of the Asperqillus nidulans pyruvate kinase gene.Curr.Genet.13315-321.
实施例1编码Fusarium solani pisi前原角质酶的合成基因的建造。
基本上按照EP-A-407225(Unilever)所述的方法建造编码Fusarium solani pisi前原角质酶的合成基因。根据公开的Fusarium solani pisi基因的核苷酸序列(Soliday等，(1984)和WD-A-90/09446，Plant Genetic Systems)，设计完整的合成DNA片段，其包括一个编码Fusarium solani pisi前原角质酶多肽的区域。比较原始的Fusarium solani pisi基因的核苷酸序列，该合成角质酶基因包含几个核苷酸变种，通过它在不影响编码的氨基酸序列的基因内在方便的部位引入限制酶识别部位。完整的合成核苷酸基因的核苷酸序列表示于图1D。
通过结合三个起始于合成DNA寡核苷酸的分离的盒完成合成角质酶基因的建造。每一个合成的DNA盒在起点带有一个Eco RⅠ部位，在终点带有一个Hin dⅢ位点。用一种应用的生物体系380A DNA合成器合成寡核苷酸，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯。为了建造每一个盒，下面给出其大概的方法。将等摩尔量(50pmol)构成给定盒的寡核苷酸混合，在它们的5′一端磷酸化，按照标准方法退火和连接。用Eco RⅠ和Hin dⅢ切割产生的双链DNA分子的混合物，用琼脂糖凝胶电泳分级分馏，通过电析从凝胶中回收。用PUC9的2.7kb Eco RⅠ-Hin dⅢ片段连接生成的合成DNA盒，并转换成Escherichia coli。在两个方向用合适的寡核苷酸引物鉴别合成盒的序列来完全排列一些克隆的Eco RⅠ-Hin Ⅲ插入物序列。用这种方法建造PUR7207(包括盒1，图1A)、PUR7208(包括盒2，图1B)和PUR7209(包括盒3，图1C)。最后，通过混合PUR7207的2.9kb Eco RⅠ-APa Ⅰ片段与PUR7208的0.2kb APa Ⅰ-NheⅠ片段的和PUR7209的0.3kb Nhe Ⅰ-Hin dⅢ片段，产生PUR7210，结合该合成角质酶基因。这种质粒包含一种编码Fusarium solani pisi(图10)的完整的前原角质酶的开放译读码。
实施例2Fusarium solani pisi(原)角质酶在Escherichia coli中的表达。
关于该合成角质酶基因，建造一种大肠杆菌的表达载体，其作用类似于WO-A-90/09446(Plant Genetic Systems)所介绍的情况。设计一种结构，其中编码Fusarium solani pisi原角质酶的部分合成基因在合知的大肠杆菌表达信号之前，大肠杆菌表达信号即(ⅰ)一种可诱导的启动子，(ⅱ)核糖体结合位点和(ⅲ)信号序列，该序列提供转移起始密码，并提供跨越细胞质膜输出原角质酶所需要的信息。
设计一种合成连接子(见图2)，以接合E.Coli phoA信号序列的衍生物(Michaelis等，1983)成为合成角质酶基因的原序列。为了优化信号肽的裂解和原角质酶的分泌，该连接子的核苷酸序列是这样的，即PhoA信号序列(Thr-Lys-Ala)的三C终端氨基酸残基变成Ala-Asn-Ala，该角质酶原序列(Leu 1，见图1D)的N-末端氨基酸残基变成Ala。这种结构保证角质酶分泌成为围膜空隙(见WO-A-90/09446，Plaxt Genetic Systems)。
为了得到这样一种结构，将含有角质酶前序列和部分原序列的69bp Eco RⅠ-Spe Ⅰ片段从PUR7210除去，并用提供E.Coli PhoA前序列的衍生物和改变的角质酶原序列的N-末端氨基酸残基(图2)的合成DNA连接子序列(Eco RⅠ-SPe Ⅰ片段)代替。生成的质粒命名为PUR 7250并用于含有核糖体结合位点和接合到PhoA信号序列编码区域的原角质酶编码区域的0.7kb Bam HⅠ-Hin dⅢ片段的离析。这种片段与PMMB67EH的8.9kb Bam HⅠ-Hin dⅢ片段连接(Furste等，1986)，得到PUR7220。在这种质粒中，编码原角质酶的合成基因接合到PhoA信号序列的改变形式中，并置于可诱导的启动子控制下。
在装有0.5升IXTB培养基(Tartor和Hobbs 1988)的2升摇瓶中培养包含PUR 7220的大肠杆菌菌株WK6，该培养基的组成为0.017M KH2PO40.017M K2HPO412g/l Bacto-胰化胨24g/l Bacto-酵母提取物0.4% 甘油(v/v)在25℃-30℃，在100μg/ml氨必西林存在下，在剧烈摇动(150rpm)下培养培养物一夜，至610nm下光密度(OD)10-12。然后加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最终浓度过度10μM，并再继续保温12-16小时。当根据从培养液取出的样品分析判断，可以观察到所产生的脂解活性的量不再明显增加时，通过离心法收集细胞，并在0℃再悬浮到含有20%蔗糖的缓冲液的原始体积培养液中。通过离心法收集细胞并再悬浮在原始培养液体积的冰冷水中，使通过渗透震动溶解该细胞。通过离心除去细胞碎片，无细胞提取物用乙酸酸化到pH4.8，在4℃放置过夜，并除去生成的沉淀。在这一步，用超滤和冷冻干燥无细胞提取物，得到纯度大于75%基本上无内生的脂肪酶的角质酶制剂。另外，可以通过将酸化的无细胞提取物载到SP-交联葡聚糖上，在pH8.0用缓冲液洗脱该酶，浓缩的碱性溶液通过合适体积的DEAE纤维素(Whatman DE-52)，并直接用DEAE通过Q-琼脂糖HP(Pharmacia)柱，来提纯角质酶到均一性的(即纯度大于95%)。用盐梯度洗脱，得到一般总产率大于75%的均相角质酶制剂。
实施例3Fusarium solani pisi解质酶在Saccharomyces cerevisiae中的表达。
为了表达在Saccharomyces cerevisiae中的合成Fusarium solani pisi角质基因，建造一种表达载体，其中，编码成熟角质酶的合成基因在S.cerevisiae转化酶(Taussig和Carlsson，1983)的前序列和强的可诱导的ga17启动子(Nogi和Fukasawa，1983)之后，为了制备这样一种接合物的合成的角质酶基因，合成一种接合体片段，其中转化酶前序列的编码序列接合到编码成熟角质酶的N-末端的序列上。基本上如实施例1所述(盒8，见图3)，接合该片断作为在PUC9中的Eco RⅠ-Hin dⅢ盒，产生PUR7217，质粒PUR7210和PUR7217转化成E.Coli JM110(一种缺乏dam甲基化酶活性的菌珠)，并将PUR721的2.8kb Bcl Ⅰ-Hin dⅢ片段与PUR7210的0.6kb Bcl Ⅰ-Hin dⅢ片段连接，生成PUR7218，其中编码成熟角质酶多肽的核苷酸序列与部分S.cerevisiae转化酶前序列编码区域接合。
通过分离PUR2740的8.9kb Nru Ⅰ-SalⅠ片段用Klenow聚合酶充填在SalⅠ多孔，并重复循环该片段，就从PUR 2740(Verbakel，1991，见图6)得到表达载体PUR2741(见图4)。PUR2741的7.3kb SacⅠ-Hin dⅢ片段与PUR7218的0.7kb SacⅠ Hin dⅢ片段接合，产生PUR7219(见图5)。任意地将S.cerevisiae polⅡ终止剂放在角质酶基因的后面，在Hin dⅢ位点，其原来基本不是角质酶基因的有效的表达。E.Coli-S.cerevisiae穿梭质粒PUR7219在含有2μ质粒(Cir+菌株)的S.cerevisiae菌珠中含有一种原始复制品，S.cerevisiae Leu2基因的缺乏启动子形式允许在S.cerevisiae Leu2-菌株中选择大量复制转化体，编码成熟部分的Fusarium solani pisi角质酶的合成基因可以在严格控制下连到S.cerevisiae转化酶前序列上，可诱导S.cerevisiae ga17启动子。
把与菌株YT6-2-1L(Erhart和Hollenberg，1987)相同的S.cerevisiae菌株SUSO(a，Ciro，Leu2，his4，Canl)与2μ S.cerevisiae质粒和PUR7219的等摩尔混合物用对酵母细胞电沉积(electroporation)的标准的方案共同转化。对亮氨酸质子移变选择转化体，并从许多转化体中分离全部DNA。所有的转化体的似乎含有2μ质粒和PUR7219，举例来说，当以高复制数存在时由于同时存在2μ酵母质粒，含在PUR7219上的Leu2基因的启动子缺陷形式仅仅可以功能性补充Leu2缺陷菌株。通过在完全培养基中培育40多代，接着在选择培养基和完全固体培养基中平板复制培养来处理PUR7219质粒的一种转化体，产生S.cerevisiae菌株SU51(a，Cir+，Leu2，His4，Can1)。
在1升含有0.2升MM培养基的摇瓶中培养含有PUR7219的S.cerevisiae菌株SU51，该培养基的组成为无氨基酸的酵母氮碱(yNB) 6.7g/l组氨酸 20mg/l葡萄糖 20g/l在剧烈震动(150rpm)和在30℃培养培养物一夜，到在601nm下光密度(OD)2-4。通过离心法收集细胞并再悬浮于2升摇瓶中的1升yPGAL培养基中，该培养基组成为酵母提取物 10g/lbacto-蛋白胨 20g/l半乳糖 50g/l再继续培育12-16小时。接规定的间隔从培养物中取样，并离心除去生物量。用橄榄油作为底物，用滴定分析法分析上清液的角质酶活性。将100和200μl之间的滤液的每一样品加入到5.0ml脂肪酶底物(sigma，含有橄榄油作为脂肪酶的底物)和25.0ml缓冲液(5mM Tris-HCl pH9.0，40mD NaCl，20mM CaCl2)的搅拌的混合物中。在30℃进行试验，用Mettler DL25滴定计用0.05M NaOH自动滴定到pH9.0来测定释放的脂肪酸。得到滴定剂的量对时间的曲线。从该曲线的最大斜率计算样品中所含的脂肪酶活性的量。一个单位酶活性定义为在上面规定的条件下1分钟内从橄榄油释放1μmol脂肪酸的酶的量。这样的测定方法本领域熟练的技术人员是知道的。
当产生的角质酶活性不再增加时，用离心法除去细胞，用乙酸酸化无细胞提取物到pH4.8，按实施例1所述方法回收角质酶。
实施例4Fusarium solani pisi角质酶在Aspergilli中的表达。
为了表达在Aspergillus niger var.awamori中的合成的Fusarium角质酶基因，建造一种表达载体，其中在控制A.niger var.awamori强有力的可诱导的exlA启动子的情况下放置编码Fusarium solani pisi前原角质酶的合成基因(Maat等，1992，de Graaff等，1992)。
由质粒PAW14B构建前角质酶表达质粒(PUR7280)，其沉淀于JM190在Gentra-albureau voor schimmel培养液中的E.coli菌株中(Barrn，The Netherlands，在N°CBS 237.90下，1990年5月31日)，并含有约5.3kb SalⅠ片段，在该片段上定位0.7kb endoxylanaseⅡ(exlA)基因与2.5kb的5′一侧面序列和2.0kb的3′一侧面序列(图8)。在PAW14B中，exlA编码区域被前原角质酶编码区代替。含有exlA基因的第一密码子(ATG)的BSPHI位点(5′-TCATGA-3′)和含有exlA基因的终止密码子(TAA)的AflⅡ位点(5′-CTTAAG-3′)促进PUR7280的建造。
如下所述进行建造用BSPHI局部切割PAW14B(7.9kb)，从琼脂糖凝胶中分离线性质粒(7.9kb)。其后，用BSMⅠ切割分离的7.9kb片段，其切割有价值的BSPHⅠ位点的下游的少量核苷酸，除去在其他BSPHⅠ位点的线性质粒。在琼脂糖凝胶上分离该片段，并分离7.9kb BSPHⅠ-BSMⅠ片段。这是用AflⅡ局部切割，并分离形成的7.2kb BSPHⅠ-AflⅡ片段。
将含有编码Fuserium Solani Pisi前原角质酶的完整的开放译读码的PUR7210的0.7kb BSPHⅠ-AflⅡ片段与PAW14B的7.2kb BSPHⅠ-AflⅡ片段接合，生成PUR7280。然后用常规的共同转化方法可以把建造的载体(PUR7280)转化成霉菌(moulds)(例如Aspergillus niger，Aspergillus niger var.awamori等)，然后通过引入endoxylanaseⅡ启动子表达前原角质酶基因。也可以用常规选择标记物(例如amds或pyrG，潮霉素等)得到该建造的rDNA载体，可以用生成的rDNA载体转化霉菌产生所需要的蛋白质。作为一个例子，在该表达载体中引入amds和pyrG选择标记物，生成PUR 7281(图10)。为此，通过用合成寡核苷酸(5′-AATTGCGGCCGC-3′)转化Eco RⅠ位点(前原角质酶基因的AFG密码子的上游存在1.2kb)成为NotⅠ位点，产生PUR 7282。含有完整的A.nidulans ands基因和A.niger var.awamori pyrG基因的合适的DNA片段与它们自己的启动子和终止剂一起配有侧面NotⅠ位点，并引入PUR 7282的NotⅠ位点，产生PUR7281(图10)。
作为另一种在Aspergillus niger var.awsamori中表达该合成的Fusarium solani pisi角质酶基因的方法，建造表达载体，其中编码该成熟角质酶的合成基因不在它自己的前原序列之后，而在A.niger var.awamori exlA的前序列之后。
为了制备用于这种接合的合成角质酶基因，合成几种接受剂片段，其中exlA前序列的编码序列以不同方式连到编码成熟角质酶的N-端的序列上。在盒5中，通过将exlA前序列接合角质酶的原序列上进行这种连接。在盒6中，exla前序列与成熟角质酶的N-端残基相接合。盒7与盒6相同，但是这里编码的成熟角质酶多肽的N-端碱基从初始的甘氨酸变成丝氨酸残基，以便更好的满足信号肽裂解的需要。基本上按实施例1所述，从合成的寡核苷酸组合成盒5.6和7(见图7)。用盒5代替PUR7210 0.1kb Eco RⅠ-speⅠ片段，生成PUR7287。用盒6和7代替PUR的0.1kb Eco RⅠ-BelⅠ片段，分别生成PUR7288和PUR 7289。对于每一种质粒PUR 7287、PUR 7288和PUR 7289，0.7kb BSP HⅠ-AflⅡ片段与PAW14B的7.2kb BSPHⅠ-AfⅡ片段接合，分别生成PUR 7290、PUR 7291和PUR 7292。
然后用常规的共转换方法，把建造的rDNA载体转换成霉菌(moulds)(Aspergillus niger，Aspergillus niger var.awamori)并通过引入endoxylanaseⅡ启动子表达前(原)角质酶基因。用常规的自动控制标记物(例如amds或pyrG，潮霉素)也可以得到建造的rDNA载体，按该实施例中对PUR 7280所述(见上述)用生成的rDNA载体可以转化该霉菌，生产所需要的蛋白质。
在下列条件下培养用表达载体PUR7280、PUR7281、PUR7290、PUR7291、PUR7292转化的Asperigllus菌株(在控制A.niger var.awamori exlA启动子或终止剂的情况下，含有有或没有相应的原序列和角质酶信号序列或exlA信号序列的Fusarium solani pisi成熟角质酶编码区域);用孢子接种有400ml合成培养基(pH6.5)的多个1升摇瓶(最后浓度10E6/ml)。该培养基有下列组成(AW培养基)蔗糖 10g/lNaNO36.0g/lKCl 0.52g/lKH2PO41.52g/lMgSO4·7H2O 0.49g/l酶母提取物 1.0g/lZnSO4·7H2O 22mg/lH3BO311mg/lMnCl2·4H2O 5mg/lFeSO4·7H2O 5mg/lCaCl2·6H2O 1.7mg/lCuSO4·5H2O 1.6mg/lNaH2MoO4·2H2O 1.5mg/lNa2EDTA 50mg/l在30℃，200rpm条件下，在MKx保温震动器中保温24小时。用过滤(0.45μm过滤器)收集生长的细胞，用没有蔗糖和酵母提取物(盐溶液)的AW培养基洗涤两次，再悬浮在50ml盐溶液中并转移到含有50ml盐溶液的300ml摇瓶中，向该瓶中加入木糖到最终浓度10g/l(诱发培养基)。在上述同样的条件下继续保温过夜。用米来布过滤生成的角质酶，除去生物质，基本按照实施例2所述的方法回收角质酶。
实施例5鉴别和分离关于Fusarium solani pisi角质酶基因的基因。
从不同的真菌中分离具有不同的同系度的关于Fusarium solani pisi角质酶的编码角质酶基因。在500ml含有200ml由Hankin和Kolattukudy(1968)所介绍的培养基并附加有0.25%蔗糖的摇瓶中培养真菌培养物，并在28℃于MKx保温振动器(100rpm)中保温4天。在这时已消耗了蔗糖，基本上按照Ettinger等人所述加入角质水解物诱导角质酶产生。在规定的时间间隔从培养液中取样品，并按照标准方法分析存在的脂解活性(见实施例4)。通常诱发后大约两天可以说明脂解活性，在此时用标准方法过滤收集细胞。用标准方法洗涤菌丝、在液氮中冷冻并冷冻干燥。基本上按照Sambrook等人所述方法(1989)用硫氰酸钣盐法分离全部细胞的RNA制剂，并用氯化铯密度梯度离心法提纯。用polyATtract mRNA分离kit(promga)分离polyA(+)mRNA级分。按照标准方法，用从Fusarium solani pisi角质酶基因得到的cDNA片段作为探查物将polyA(t)mRNA级分用于Northern杂化分析，以检验关于角质酶基因的表达。按照提供者的说明，用ZAP cDNA合成的kit(Stratagene，La Jolla)将含有能够同探查物杂化的物质的mRNA的制剂用于合成cDNA，生成但于poly-A区域侧面的粘性末端的XhoⅠ和在另一端的EcoRⅠ接合的cDNA片段。得到的cDNA片段通过在Lambda 2APⅡ载体(Stratagene La Jolla)中有意义定向的克隆用于建造表达库，表达β-半乳糖苷酶接合的蛋白质(Huse等，1988)。这些库用抗Fusarium solani pisi角质酶产生的抗血清筛分。
另外，用角质酶特殊引物将该合成的cDNA级分进行pcR-筛分(见表2)。这些引物由几种真菌角质酶基因的氨基酸序列比较得到(Ettinger等，1987)。用由Fusarium solani pisi角质酶得到的cDNA作对照，对每一组引物都优化PCR反应条件。用这些cDNA的制剂可能产生特殊的PCR片段，该片段的长度类似于(或大于)在相同条件下用从Fusarium solani pisi角质酶得到的cDNA产生的PCR片段的长度，用凝胶电泳提纯该PCR片段并从凝胶中分离。
作为另一种方法，用角质酶特殊引物的PCR筛分技术也直接用于某些真菌菌株的基因组DNA，用Fusarium solani pisi的基因组DNA作为正的对照。用这真菌基因组DNA的制剂，可以产生特殊的PCR片段，其长度类似于(或大于)在相同条件下用从Fusarium solani pisi角质酶得到的cDNA产生的PCR片段的长度，用凝胶电泳提纯该PCR片段，并从凝胶中分离。
对于在表达库的方法中或PCR筛分方法(或用cDNA或用基因组DNA)中为正的菌株及许多其他菌株，分离高分子量的基因组DNA。基本上按Ettinger等(1987)所述方法培养菌株，按cle Graaff等(1988)所述方法分离基因组DNA。用不同的限制酶消化基因组DNA，并且类似的cDNA引入物(表达库方法)或PCR片段(PCR筛分方法)或Fusarium solani pisi角质酶基因(其他菌株)作为探查物通过Southern杂化进行分析，并建造角质酶基因的实体图。适当的吸收的基因组DNA用凝胶电泳分级分馏，从凝胶中分离适当大小的片段并在pUC19中再克隆。用相应的cDNA引入物(表达库方法)或PCR片段(PCR筛分方法)筛分这些基因组库，生成含有角质酶基因复制品的克隆。这些基因在两个方向定序。通过定序相应的cDNA或通过与其他角质酶序列比较(Ettinger等，1987)来鉴别Introns。由这样一种比较也导出成熟角质酶多肽的N-末端。用标准的PCR方法，除去introns，立即在开放译读码的下游建造HindⅢ位点，Saccharomyces cerevisiae转化酶基因的前序列的编码序列(SacⅠ位点在先，比较盒8，图3)接合到编码成熟角质酶的N-末端的序列上。所得到的含有可以连接到编码S.cerevisiae转化酶前序列的序列上的角质酶基因的SacⅠ-Hin dⅢ片段与PUR7241的7.3kb SacⅠ-Hin dⅢ片段(见图4)合并转化成S.cereviiae菌株SU51。表达该真菌角质酶并基本上按实施例4所述方法从培养液中将其回收。
实施例6用氟代磷酸二异丙基(DFP)的失活试验。
在该试验中，将不同来源的脂解酶用各种浓度的DFP进行失活试验达一固定的时间周期。失活周期之后，用pH-Stat试验测定剩余活性的百分数。试验条件是使用的试验脂解酶的浓度是在10mM含有20mM CaCl2·2H2O(Merck)的pH10.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中每ml蛋白质0.5mg。将20μlDFP-抑制剂溶液加入0.5ml这种酶溶液(样品)中，209μl乙醚加到另外的0.5ml酶溶液(空白)中。该DFP-抑制剂溶液是0.5MDFP(氟代磷酸二异丙基酯，Fluka)在乙醚(Baker)中。把两个样品在室温保温10分钟，保温后，用Eppendorf离心机全速(14000rpm)离心该溶液2分钟。使用上清液。在样品和空白试验中，在pH-stat试验中在pH10.0，用脂肪酶底物(Sigma，编号800-1)测定脂肪酶活性。然后按下述方法计算残余活性(RA)RA＝脂肪酶活性(样品)/脂肪酶活性(空白)＊100%该残余活性百分数如下所示
脂解酶 残余活性(%)Lipolase(TM，Novo Nordisk) 86Fusarium solani pisi角质酶(实施例2) 5Candida cylindracea脂肪酶(sigma) 83Chromobacterium viscosum脂肪酶(sigma) 65猪胰脂肪酶(sigma) 60Genencor脂肪酶(pseudomonas putida的变种ATCC 53552，“Lumafast”) 65AKG 脂肪酶30B(Amano) 52SDL 195 脂肪酶(showa Demko) 20PS.pseudoalcaligines CBS 473.85脂肪酶 60实施例7用上述的Br-橄榄油法测定前面的实施例中所试验的酶的脂解活性。洗涤温度是30℃，水硬度是27°FH。在洗涤试验中除去的Br-橄榄油的百分数如下脂解酶 除去的油垢(%)Lipolase (TM，Novo Nordisk) 0Fusarium solani pisi角质酶(实施例2) 19Candida cylindracea脂肪酶(sigma) 0Chromobacterium viscosum脂肪酶(sigma) 1.6猪胰脂肪酶(sigma) 10Genencor 脂肪酶(pseudomonas putida的变种ATCC 53552，“Lumafast”) 11AKG 脂肪酶30B(Amano) 10
SDL 195 脂肪酶(showa Demko) 20PS.pseudoalcaligines CBS 473.85脂肪酶 15借助于线性回归分析使实施例6得到的数据(用DFP失活后的残余活性)和在该实施例中得到的数据彼此互相关联。在图11中用图形表示这种相互关系。由该图可以看出在残留活性的百分数与给定的脂解酶的洗涤性能之间存在一种很好的相互关系。因此，我们的结论是按照实施例6用DFP培育后残留活性的百分数可以作为任意来源的脂解酶在洗涤中性能的简单的预测试验。
实施例8Fusarium solani pisi角质酶和lLipolase(TM)的脂解活性的比较。
按照实施例2，通过分离，将从Fusarium solani pisi得到的角质酶的脂解活性与市场上由Novo Nordisk A/S得到的Lipolase(TM)，一种Humicola Lanuginosa脂肪酶的脂解活性进行比较。
将棉织的和棉编的试验织物被纯橄榄油污染。然后将每一试验织物在100ml聚苯乙烯瓶中的30ml洗涤水溶液中培育。在装水的Miele TMT洗衣机中，使用通常的30℃主洗涤程序下搅动这些瓶子。该洗涤溶液由2g/升(6°FH)的洗粉组成，该洗粉具有以下组成(按%(重量)计)非离子表面活性剂C12C15醇10.5-13EO 9.5硫酸钠 38.6碳酸钠 40.4硅酸钠(Na2O∶Si2O＝2.47 7.3水 4.2在第一次洗涤之后，在室温下在滚筒干燥机干燥该试验织物之后立即测定残留的脂肪。在Soxhlet装置中用石油醚萃取试验织物。然后通过称重测定脂肪物质的量并表示为在织物上脂肪的百分数，结果在图12中给出。
从该图可以看出，在除去橄榄油方面，与对照试验比较，Lipolase(TM)没有什么改进，在所示试验中，该作用略显负的，但是并不认为是明显的。另一方面，角质酶表现出明显的在洗涤中的效果。
实施例9Fusarium solani pisi角质酶和Lipolase(TM)对不同类型的污染的单洗效果。
将棉制的试验织物用花生油、油酸盐油和这二种脂肪50/50的混合物污染。洗涤粉和洗涤条件同实施例8。单洗之后通过在460nm处测定反射率分析洗涤效果。结果在图13中给出。
从该图可以看出，含有角质酶的洗涤剂组合物对几种类型的油垢的洗涤效果始终比含Lipolase(TM)的组合物的洗涤效果好。该效果对纯花生油是最明显的。
实施例10每次洗涤周期之后，测定Fusarium solani pisi角质酶和Lipolase(TM)在不同含量时的效果。
基本上重复实施例9，其试验织物用LS-3油垢污染。这是一种75g花生油、40g乳化剂、125g AS-8和125g奶粉的乳液。第一次洗涤之后，将试验织物再污染并再洗涤，总共重复4次。在酶含量为1、3、5和10LU/毫升洗液的情况下，在每一洗涤周期之后，测定角质酶和Lipolase(TM)的效果，结果在图14A-D中给出。
由这些试验，可以得出几个结论。很显然，在角质酶所有的含量下，均显示明显的单洗效果。而Lipolase(TM)在最高含量10LU/ml下仅显示略微单洗效果。对所有四个洗涤周期，在第一次洗涤之后角质酶都比Lipolase(TM)好。
实施例11Fusarium solani pisi角质酶、脂肪酶ex pseudomonas gladioli和Lipolase(TM)的效果。
将67%聚酯和33%棉的试验织物用下面5g/l洗涤剂产品脱浆，并彻底漂洗。将其剪7.5cm×7.5cm的片并打撮。将10片这样的未污染的织物(总质量约6.5g)放在75ml含有下面给出的洗涤剂产品，剂量为5g/l的洗涤液中在6°FH下洗涤。将脂肪酶ex Pseudomonas gladioli、Lipolase或Fusarium solani pisi角质酶预先加入1LU/ml的洗涤水溶液中。按EP-A-205208和EP-A-206390(都是Unilever)所描述的得到脂肪酶ex pseudomonas gladioli。将洗涤水溶液和织物放在小瓶中，该小瓶放在Lavamat AEGX洗衣机中，在30℃被搅拌30分钟。洗涤粉有下面的组成(%重)椰子伯烷基硫酸盐 5.2非离子表面活性剂C13-C15醇7EO 5.2非离子表面活性剂C13-C15醇3EO 6.6沸石4A 32.00碳酸钠 11.52硅酸钠 0.45硬化牛脂皂 2.00在所有情况下初始pH约为10。洗涤结束后将该织物挤干并在300ml自来水中漂洗约半分钟。该过程重复三次。然后再将该织物挤干并在室温条件下凉干。
将干燥的织物的一半用橄榄油污染并放置三天。通过称重测定初始大约是织物5%(重)的油污的重量。结果在图15中给出。
很显然，单次洗涤后Lipolase(TM)对油污的除去不起作用。Lipolase(TM)的效果仅仅是通过重复洗涤之后才能达到。第一次洗涤之后，P.gladioli脂肪酶得到少的但是明显的洗涤效果，在其后的洗涤周期之后有明显效果。第一次洗涤周期之后，角质酶已把污垢去掉，整个其后的周期都保持这一优点。
实施例12Fusarium solani pisi角质酶、脂肪酶ex pseudomonas gladioli和Llipolase(TM)的效果。
用下面的洗涤剂产品，以5g/l的浓度重复实施例11。
椰子伯烷基硫酸盐 1.7非离子表面活性剂C12-C15醇7EO 6.8非离子表面活性剂C12-C15醇3EO 8.5沸石MAP1) 32.00碳酸钠 11.52硅酸钠 0.45硬化牛脂皂 2.001)沸石MAP代表“最大铝沸石P”;其是在EP-A-384070(Unilever)中描述的一类沸石。
结果在图16中给出。可以看出，两种脂肪酶无论在第一洗涤后，还是在其后的洗涤周期后都没有除去油污。但是，角质酶在第一洗涤周期后已有很大的洗涤效果。
实施例13Fusarium solani pisi角质酶、脂肪酶ex pseudomonas gladioli和Lipolase(TM)的效果。
重复实施例12，但是在洗涤周期之间重新污染。结果在图17中给出。观察到在第二洗涤周期之后，Lipolase(TM)和P.gladioli脂肪酶具有一点效果。在单次洗涤中，质角酶已把油污的量降低到最少。其后的洗涤周期甚至重新污染之后，油垢都进一步减少。
权利要求
1.一种加酶洗涤剂组合物，包括(a)0.1-50%(重)的表面活性剂体系，该体系含有(a1)0-95%(重)的一种或多种阴离子表面活性剂和(a2)5-100%(重)的一种或多种非离子表面活性剂；和(b)10-20000LU酶/每克洗涤剂组合物，在洗涤过程的主要周期中该酶能够呈现明显的脂解活性。
2.根据权利要求1的洗涤剂组合物，其中，按本文所述方法分析，以初始油垢量为基准，与其他不含酶的同样洗涤剂组合物相比较，该酶至少能够除去多于5%，优选至少多于10%的油垢。
3.根据权利要求1的洗涤剂组合物，其中，按本文所述方法分析，由该酶除去的酶催化的油垢与由Lipolase(TM)除去的酶催化的油垢的比至少为3，优选至少为5。
4.根据任一上述权利要求的洗涤剂组合物，其中呈现脂解活性的酶是按本文所述用pH10的氟代磷酸二异丙基酯(DFP)在室温下培育10分钟后具有残余活性小于50%，优选小于40%，更优选小于25%的脂解酶。
5.根据任一上述权利要求的洗涤剂组合物，其中该酶是酯酶或脂肪酶。
6.根据任一上述权利要求的洗涤剂组合物，其中该酶是真核角质酶。
7.根据权利要求6的洗涤剂组合物，其中该酶是真菌角质酶。
8.根据权利要求7的洗涤剂组合物，其中该酶是有茎特性的真菌角质酶。
9.根据权利要求8的洗涤剂组合物，其中该酶是选自Fusarium solani pisi、Fusarium roseum culmorum、Rhizoctonia solani和Alternaria brassicicola(PNBI)的角质酶。
10.根据权利要求7的洗涤剂组合物，其中该酶是可以从Fusarium有机物得到的角质酶。
11.根据权利要求7的洗涤剂组合物，其中该酶是从Fusarium solani pisi得到的角质酶。
12.根据权利要求7的洗涤剂组合物，其中该酶与抑制从Fusarium solani pisi衍生的角质酶而产生的抗体发生免疫交叉反应。
13.根据上述任权利要求的洗涤剂组合物，其中不含有阴离子表面活性剂。
14.根据权利要求1-12的洗涤剂组合物，其中阴离子表面活性剂是伯醇硫酸盐。
15.根据权利要求14的洗涤剂组合物，其中阴离子表面活性剂是C12-C15伯醇硫酸盐。
16.洗涤污染织物的方法，包括的步骤(a)用根据上述任一权利要求的洗涤剂组合物的水溶液洗涤污染的织物，和(b)用热空气干燥织物。
全文摘要
本发明提供一种加酶洗涤剂组合物，其包括(a)0.1—50％(重)的表面活性剂体系，该体系包括(a1)0—95％(重)的一种或多种阴离子表面活性剂和(a2)5—100％(重)的一种或多种非离子表面活性剂；和(b)10—20000LU酶/克洗涤剂组合物，该酶在洗涤过程的主要周期中能够显示明显的脂解活性。
文档编号C12N9/18GK1088256SQ9311743
公开日1994年6月22日 申请日期1993年7月30日 优先权日1992年7月31日
发明者H·T·W·M·范德希, J·F·瓦尔, W·穆斯特斯, J·D·马卢格, J·克卢基斯特, D·H·A·抗德曼 申请人:尤尼利弗公司