专利名称：改良型人肿瘤坏死因子的基因及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程生产多肽药物技术领域。
肿瘤坏死因子(TNF)主要是由巨噬细胞、单核细胞分泌的蛋白质，具有多种生物功能，如抗肿瘤、抗病毒、调节血管内皮应答性、刺激血管新生、介导免疫反应和炎症反应、诱导其他细胞因子的产生等。最受到人们关注的是杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无影响的特性。
TNF由Carswell等在1975年发现，从此，众多研究者进行TNF的研究，他们观察到TNF对实验动物的肿瘤有戏剧性治疗效果，当从尾静脉注射一微克TNF后，竟使肿瘤消退，因此引起轰动。进入80年代，首先从培养的人白血病细胞HL-60培养液中提取并纯化了人TNF；1984年Pennica和Shirai等人在大肠杆菌中成功地表达了重组的人TNF，并制成纯品，1985年开始了第一例抗癌临床试验，十年来，美、日、欧洲都已相继开展了临床研究，现已进入II期临床研究，在美国尚未获FDA的批准，至今还未成为上市商品。经过了漫长的临床观察，积累了很多有益的经验，首先他们摸索了给药途径和剂量，对于大多数病例都是全身给药，即静脉滴注、肌肉注射或皮下注射，少数病例为瘤体内直接注射。全身用药治疗剂量为10-200微克，局部用药剂量10微克左右，结果表明瘤内直接注射有效率大大提高。某些医疗机构，如日本高野医院试验了90余例，约有50％病例有症状改善，生存期延长。但在日本另外19个医疗单位对晚期癌症进行的试验中则很少有效，由此可见，全身用药时治疗效果不稳定，报道的病例大多无效，而瘤内注射以及合并其他抗癌药使用，使有效率稳定在50％以上，个别病例经治疗获痊愈。在治疗中发现TNF毒性较强，用药后病人普遍出现发冷、发热、有些病例为寒战高烧达40℃，伴有恶心，呕吐，少数病人有血压下降。
在国内，1987年开始，南京大学和复旦大学协作接受了国家“863”任务—TNF的基因工程，至1990年完成了实验室试验，我们双方均独立地完成了在大肠杆菌中的TNF表达，近年来，南京大学初步观察了少数病例，和国外情况一致。
到目前为止，TNF的临床疗效远不及对动物的抑瘤效果，其主要原因是按公斤体重折算，使用的TNF剂量相差甚远，20克体重的小鼠用1μg TNF，抑瘤效果很强，按此推算，对人体的有效剂量应为2-3mg，但这种高剂量伴随的毒性病人无法耐受，因此，研制高活性、低毒性的改良型TNF势在必行。为此，国内外研究者纷纷设计不同的TNF突变体，至今突变体已逾百种，但真正达到此目的的仅少数几种。
本发明的目的在于创造一种抗癌效果好，毒性低的药物；另外，考虑到大规模生产时经济效益，我们构建了一种高效表达体系，发酵时间短，培养基成分较普遍，分离纯化步骤少，最后得率高。
本发明的技术方案包括1.改良型TNF基因构建2.改良型TNF基因在大肠杆菌中高效表达3.表达产物分离纯化我们设计的改良型TNF，缺失了N-端四个氨基酸，即删除第三、四位的丝氨酸和第七、八位的苏氨酸、脯氨酸，另外，将第五位的丝氨酸改为碱性氨基酸-赖氨酸，最后产生的TNF变体为153个氨基酸组成的蛋白，分子中由于多了一个赖氨酸，碱性较强。本发明按照上述设计思想，合成了引物，以PCR法扩增了长度为160bp基因片段，经酶切，再替换天然TNF基因的相应片段。将改造过的TNF基因经NcoI和BamHI双酶切插入表达载体PET-11d中转化至大肠杆菌BL-21，经筛选获得阳性克隆，经过培养，SDS-PAGE检测，表明在分子量17KD处新出现一条很粗条带为表达产物，扫描结果，表达的蛋白占菌体总蛋白约50％。
将工程菌培养过夜，收集菌体，超声破菌，离心收集上清液，再用硫酸铵沉淀，经透析，上DEAE-纤维素(DE52)柱层析，收集洗脱峰，用SDS-PAGE检测，将含纯品的部分合并。
本发明优点是创造了一种活性高、毒性低的新型抗癌药。其关键是改造天然TNF的N-端结构。TNF的活性是通过其受体而发挥作用的，凡影响TNF和受体结合的因素，都会影响活力。现在已经知道在TNF分子中，5，31-35，84-87，117-119和143-148位氨基酸和活性密切相关，另外，TNF的N-端对活力也有影响，缺失N-端几个氨基酸往往使活力增加，因为TNF的N端游离于分子三级结构表面，对邻近的受体结合区有干扰作用。也就是说N-端虽不直接和受体结合，但可调节和修饰生物学活性。
构建了高效基因表达体系，使表达蛋白占菌体总蛋白约50％。这种表达产物为可溶性的活性形式，而不是包涵体。
摸索一条适用于大规模生产的简便生产工艺。发酵时间短(12-16小时)，不需任何诱导，分离纯化步骤较少，最后得率高，每立升发酵液可获纯品30-40mg。因此，经济效益巨大。
本发明所述改良型肿瘤坏死因子，可用做治疗恶性肿瘤的药物。
下面是
具体实施例方式(一)改良型TNF基因的构建，具体如下1.天然TNF基因克隆至M13中，抽提M13/TNFF重组DNA以此作为模板。
2.合成一对PCR引物5′-引物总长度为44个核苷酸，其中15个核苷酸和天然TNF基因匹配，另外，含有BamHI、HindIII和NcoI的酶切位点，还将Ser的密码子改为Lys的密码子。
具体序列如下5′-ATT CCT CTT CGA AGG TAC CAA GCA TTT GCA AGA CTG TTT GGT CA-33′-引物和天然TNF基因中编码44-51位氨基酸密码序列相同，含有kpnI酶切位点。
具体序列为5′—GCC ATG GTG TTC GAC CAA CAG TGC GTC-3′3.PCR以10ng M13/TNF重组DNA为模板，用上述一对引物扩增30个周期(45℃-72-℃-92℃)，扩增产物经1％agarose电泳检查，主要为160bp一个条带，与预期结果一致。从凝胶中回收此条带，用BamHI和KpnI双酶切，再从凝胶中回收。
4.将M13/TNF(天然)重组双链DNA，经BamHI和KpnI双酶切，用1％agarose电泳，回收大片段。
5.将以BamHI和KpnI切后的PCR片段和M13/TNF(天然)大的片段，加T4DNA连接酶使这二个片段连接，再转化至TG1中，经杂交筛选(用5′-引物为探针)，选出所需的克隆，再制备DNA，用NcoI和BamI切出改良后的TNF基因。经DNA序列测定，证明N-端的序列和预计的序列一致。
(二)改良型TNF基因在大肠杆菌中的表达将表达载体PET-11d用NcoI和BamI双酶切，加入改良的TNF基因(用同两种酶切)，加连接酶转化至BL-21(DE3)用32P标记该基因作探针，选出阳性克隆。
将阳性克隆接种于2ml LB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培养8小时，接种入200ml LB/Amp(50μg/ml)培养液中，37℃振荡培养16小时。
(三)产物的分离纯化1.将培养液5,000rpm离心15分钟，4℃，收集菌体。
2.超声破菌将收集的1克菌体悬于pH8.2 10mM磷酸缓冲液中，超声10分钟(超声15秒，间歇15秒)。
3.12,000rpm，4℃离心15分钟，收集上清。用SDS-PAGE检测上述细胞裂解液，在分子量17,000处有一条很粗条带，经扫描含量约50％，由此可见，表达产物主要为可溶性而不是包涵体。
4.硫酸铵分部在细胞裂解液中加固体硫酸铵至60％饱和度(0℃)，放置过夜(0℃)，12,000rpm，4℃离心15分钟，保留沉淀部分，用pH8.220mM磷酸缓冲液10ml溶解沉淀，并对此缓冲液透析24小时。离心10,000rpm，4℃10分钟，丢弃沉淀，上清进一步作柱层析。
5.DEAE-纤维素(DE-52)柱层析将处理后的DE-52装柱(Φ2.6×20cm)，用pH8.210mM磷酸缓冲液平衡，透析后的样品上柱，并用此缓冲液充分洗涤，穿过峰丢弃。再用pH8.220mM磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
经蛋白定量测定，洗脱峰总蛋白为8mg，即200ml发酵液获纯蛋白10mg，若以每立升发酵液计算可得40mg，经SDS-PAGE检测，银染或考马斯亮蓝染色主要为一条带，另在分子量三万左右有一细带，含量约5％，经Western印迹分析，SDS-PAGE上显示的两个条带均呈阳性，说明分子量三万的条带为TNF的二聚体。
用HPLC凝胶柱分析出现一个单峰。
活力测定用L929方法，并测蛋白，计算比活。
纯品比活为3-8×107u/mg。
权利要求
1.一种改良型人肿瘤坏死因子基因特征是删除TNF第三、四位的丝氨酸和第七、八位的苏氨酸、脯氨酸的密码子，将第五位的丝氨酸改为赖氨酸密码子，经基因表达产生由153个氨基酸组成的TNF变体蛋白。
2.根据权利要求1所述的改良型TNF基因，其特征是改造过的TNF基因经NcoI和BamHI双酶切插入表达载体PET-11d中转化至大肠杆菌BL-21，经筛选得阳性克隆，将阳性克隆接种于2ml LB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培养8小时，接种入200ml LB/Amp(50μg/ml)培养液中，37℃振荡培养16小时。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征是将培养液过夜，收集菌体，超声破菌，离心，收集上清液，再用硫酸铵沉淀，经透析，上DEAE-纤维素(DE52)柱层析，收集洗脱峰，用SDS-PAGE检测，将含纯品的部分合并。
4.根据权利要求1所述的改良型TNF基因，其特征是可用做治疗恶性肿瘤的药物。
全文摘要
本发明属于基因工程生产多肽药物领域，用于治疗恶性肿瘤。本发明所述改良型TNF为删除TNF第三、四位的丝氨酸和第七、八位的苏氨酸、脯氨酸，将第五位的丝氨酸改为赖氨酸，由153个氨基酸组成的TNF变体蛋白。改良后的TNF基因在大肠杆菌中高效表达并分离纯化成单一组分纯品，比活为3-8×10
文档编号C12N15/70GK1123326SQ9411149
公开日1996年5月29日 申请日期1994年11月9日 优先权日1994年11月9日
发明者徐贤秀 申请人:南京大学