专利名称：人趋化因子β－13的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴别的多核苷酸，由这些多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸及多肽的用途及多核苷酸及多肽的生产。更具体地，本发明的多肽是人趋化因子β-13，有时后文中称为“Ckβ-13”。本发明还涉及抑制该多肽的作用。
趋化因子，也称内分泌(intercrine)细胞因子，是一类结构和功能相关的细胞因子亚家族，这些分子大小为8-10kd。一般地，趋化因子在氨基酸水平呈20-70％的同源性且特征在于四个保守的半胱氨酸残基形成两个二硫键。基于头两个半胱氨酸残基的排列，趋化因子被分成两个亚家族α和β。在α亚家族，头两个半胱氨酸被一个氨基酸分开因此称作“C-X-C”亚家族。在β亚家族，两个半胱氨酸位置相邻因此称作“C-C”亚家族。迄今为止，已在人体内鉴别出至少9个这一家族的不同成员。
内分泌细胞因子显示有许多功能。一个特点是其能诱导不同的细胞类型包括单核细胞、嗜中性白细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和成纤维细胞做趋化性游走。许多趋化因子有促炎活性且涉及炎症期间的多个步骤。这些活性包括刺激组胺的释放，溶酶体酶类和白三烯释放，提高免疫靶细胞对内皮细胞的粘连，增强补体蛋白质的结合，诱导粒细胞粘附分子和补体受体的表达及呼吸爆发。除了其涉及在炎症中，还发现某些趋化因子呈现其它活性。例如，巨噬细胞炎性蛋白质1(MIP-1)能抑制造血干细胞增殖，血小板因子4(PF-4)是内皮细胞生长的有效抑制物，白细胞介素3(IL-3)促进角化细胞增殖，GRO是黑素瘤细胞的自泌生长因子。
根据其多种生物活性，趋化因子与各种生理或病理状态，包括淋巴细胞运输，伤口愈合，造血机能调节及免疫失调如变态反应，哮喘和关节炎相关是毫不惊奇的。
“C-C”分支的成员在下述细胞上发挥其功效嗜酸性细胞可杀灭寄生虫以减轻寄生虫感染，嗜酸性细胞也能引起呼吸系统的气道慢性炎症；单核细胞和巨噬细胞可抑制脊椎动物肿瘤的形成；T淋巴细胞可吸引T细胞；嗜碱性粒细胞可释放在变态反应炎症中起重要作用的组胺。
尽管C-C分支的成员主要作用于单核细胞而C-X-C分支成员主要作用于嗜中性白细胞，但是不能基于此准则把独特的化学引诱物的性质归于一个趋化因子。来自一个家族的一些趋化因子呈现与其它家族的特点。
本发明的多肽具有保守的半胱氨酸“C-C”区，并与已知趋化因子具有氨基酸序列同源性。
根据本发明的一个方面，提供了新的多肽及其生物活性的并且诊断或治疗有用的片段，类似物和衍生物。
根据本发明的另一方面，提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA及其生物活性的并且诊断或治疗有用的片段，类似物和衍生物。
根据本发明的另一方面，提供了核酸探针，其包含长度足以与编码本发明的多肽的核酸序列特异杂交的核酸分子。
根据本发明的再一方面，提供了通过重组技术生产这些多肽的方法，包括在促进所述蛋白表达和所述蛋白的后续回收的条件下培养包含编码本发明的多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
根据本发明的又一方面，提供了为治疗目的而使用这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸的方法，如治疗实体瘤、慢性感染、白血病、T细胞介导的自身免疫疾病、寄生虫感染、银屑病，调节造血功能、刺激生长因子活性、抑制血管生成及促进伤口愈合。
根据本发明的再一方面，提供了抗这些多肽的抗体。
根据本发明的又一方面，提供了这些多肽的拮抗剂，其可用于例如在治疗自身免疫疾病，动脉粥样硬化，慢性炎症及感染性疾病，组胺和IgE介导的变态反应，不依赖于前列腺素的发热，骨髓功能低下，矽肺，结节病、风湿性关节炎和嗜酸性细胞增多综合征时抑制这些多肽的作用。
根据本发明的另一方面，提供了用于诊断与本发明的核酸序列中的突变及与由此核酸序列编码的蛋白的改变水平相关的疾病和疾病的易感性的方法。
根据本发明的又一方面，提供了为科学研究、DNA合成和DNA载体的生产相关体外目的使用这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸的方法。
本发明的这些及其它方面根据本文的教导对本领域技术人员将是显而易见的。
下述附图旨在说明本发明的实施方案，并非限制本发明的范围。
图1示出Ckβ-13的cDNA序列及相应的推导的氨基酸序列，开头的28个氨基酸代表前导序列，由此推定的成熟多肽包含65个氨基酸，使用了标准的单字母氨基酸缩写。使用373自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.)进行测序。
图2示出Ckβ-13(顶行)与人MIP-1α多肽(底行)间氨基酸序列同源性。
根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或编码由1995年4月28日保藏的ATCC保藏号97113的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
编码Ckβ-13的多核苷酸从激活的单核细胞cDNA文库中分离。Ckβ-13是趋化因子C-C分支的一个成员。其含有一编码93个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，该蛋白质大约开始28个氨基酸是推定的前导序列，如此成熟蛋白质包括65个氨基酸。该蛋白质与趋化因子多肽有结构同源性，并且其在整个序列上与人MIP-1α多肽呈33％相同性及53％相似性仅仅是举例性的。
在趋化因子中的4个空间保守的半胱氨酸残基在本发明的多肽中也被发现，如图1所示。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列(SEQ ID NO1)相同，或与保藏克隆的编码序列相同，或者也可以是不同的编码序列，该编码序列由于遗传密码的丰余性或简并性，与图1(SEQ ID NO1)的DNA或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和另外的编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)和非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1(SEQ IDNO2)的推导的氨基酸序列的多肽或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸的变异体可以是天然发生的该多核苷酸的等位基因变异体，或是该多核苷酸的非天然发生的变异体。
因此，本发明包括编码图1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物，这些核苷酸变异体包括缺失变异体、取代变异体和添加或插入变异体。
如上所述，多核苷酸可以具有为图1(SEQ ID NO2)所示的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列，或保藏克隆的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸序列的另一种形式，其可以取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，但基本上不改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框内与有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸融合，例如前导序列，其是用于控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白(preprotein)，前导序列可以由宿主细胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸还可编码一种蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白为蛋白原并是蛋白质的非活性形式，一旦原序列被切掉，则保留活性成熟蛋白。
因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或编码具有序列原的蛋白或具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et a1.，Cell，37767(1984))。
术语“基因”指的是生产多肽链中涉及的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)及各个编码区段(外显子)间的间插序列(内含子)。
本发明的全长Ckβ-13基因的片段可用作与cDNA文库杂交的杂交探针以分离全长cDNA并分离与基因有高序列相似性或有相似生物活性的其它cDNA。此型探针优选具有至少30个碱基且可含如50个或更多个碱基。此探针也可用于鉴别对应于全长转录本的cDNA克隆和含有包括调节基因和启动子区、外显子和内含子的完整Ckβ-13基因的基因组克隆。筛选的一个例子包括用已知DNA序列合成一寡核苷酸探针以分离出Ckβ-13基因的编码区。具有与本发明的基因互补的序列的标记的寡核苷酸用于筛选人cDNA，基因组DNA或mRNA文库以确定探针与文库的哪些成员杂交。
本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少70％、优选90％、更优选95％的相同性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％相同性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。
或者，多核苷酸可以具有至少20个碱基，优选30个碱基、更优选至少具有50个碱基，其与本发明的多核苷酸杂交且具有上述的相同性，并且可保持或不保持活性。例如，如此的多核苷酸可用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探针，如用于多核苷酸的回收或作为诊断探针或作为PCR引物。
如此，本发明涉及与编码SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸及其片段具有至少70％相同性，优选至少90％相同性、更优选至少95％相同性的多核苷酸，所述片段具有30个碱基、优选50个碱基。本发明还涉及由该多核苷酸编码的多肽。
本文所指的保藏物将根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定期限保藏。这些保藏仅为本领域技术人员提供方便，而不是对根据35 U.S.C 112索取保藏物的许可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及该序列编码的多肽的氨基酸序列引入本文作参考，并且在与本文的序列描述有抵触时，其是参照。制造、使用或销售保藏物需经许可，而本文不授予这种许可。
本发明还涉及具有图1(SEQ ID NO.2)的推导的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的趋化因子多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1(SEQ ID NO.2)的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。衍生物或片段可以包括，例如具有少于图1的多肽的氨基酸残基数但仍保留人趋化因子多肽的生物学活性特征的剪接变体。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1(SEQ ID NO.2)的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的一或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的一或多个氨基酸残基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均质。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2所示的多肽(尤其是成熟多肽)，及与SEQ ID NO2的多肽有至少70％相似性(优选至少70％相同性)、优选与SEQ ID NO2的多肽有至少90％相似性(更优选至少90％相同性)、更优选与SEQ ID NO2的多肽有至少95％相似性(更优选95％相同性)的多肽；也包括这些多肽的通常至少含30个氨基酸优选至少50个氨基酸的部分。
本领域已知两多肽间的“相似性”的测定是通过将一种多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代物与另一种多肽的序列相比较测定的。
本发明的多肽的片段或部分可通过肽合成法用于生产对应的全长多肽；因而所述的片段可用作生产全长多肽的中间物。本发明的多核苷酸的片段或部分可用于合成本发明的全长多核苷酸。
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体基因工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞用本发明的载体基因工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。基因工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增Ckβ-13基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。
可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。
表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40启动子，E.colilac或trp启动子，λ噬菌体PL启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有一用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。
另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。
可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。
作为合适的宿主的例子，可以提及的有细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇S2和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phage script，psiX174，pBluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。
启动子区可以选自使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体的任何所需基因，两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。
在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建物的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建物导人宿主细胞。
可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建物以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建物衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，et al，Molecular ClonningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引入本文作参考。
高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10-300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100-270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，异源结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，异源序列可以编码一包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。
用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。
作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madi son，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。
典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂，这些方法是本领域熟练技术人员熟知的。
也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接体和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。
可通过硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析羟基磷灰石层析和凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收并纯化Ckβ-13多肽。如果需要，可使用蛋白质重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型，最后，可采用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)而生产。根据在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括一起始的甲硫氨酸残基。
本发明的多核苷酸和多肽可用作研究试剂和研究材料以揭示对人类疾病的疗法和诊断剂。
本发明的多肽可用于抑制骨髓干细胞集落形成以作为在肿瘤化疗及白血病治疗期间的辅助保护性治疗手段。Ckβ-13多肽可以抑制造血细胞如骨髓干细胞的增殖和分化。对定型祖细胞(如粒细胞和巨噬细胞/单核细胞)的抑制作用可治疗性地用于抑制白细胞的增殖。
由于发现皮肤中的郎氏细胞可产生趋化因子，因此本发明的多肽也可用于抑制表皮角化细胞增殖以治疗以角化细胞过度增殖为特征的银屑病。
本发明的多肽也可通过趋化性刺激宿主防御细胞如胞毒性T细胞和巨噬细胞的侵入及活化及抑制肿瘤的血管生成用以治疗实体肿瘤如Karposi肉瘤。
其也可用于增强宿主抗慢性及急性感染的抵抗力，如经诱导和激活杀菌性白细胞抗分支杆菌的感染。
本发明的多肽也可通过抑制IL2生物合成来抑制T细胞增殖以治疗T细胞介导的自身免疫疾病和淋巴细胞型白血病。
Ckβ-13也可用于刺激伤口愈合及在伤口愈合期间防止瘢痕形成，都是通过清除碎屑及结缔组织促炎细胞的募集，也通过其对过量的TGFβ介导的纤维化的控制来完成。以这种相同方式，Ckβ-13可用于治疗其它纤维性疾病，包括肝硬化，骨关节炎和肺纤维化。
本发明的多肽也可提高嗜酸性细胞数量，这些细胞具有独特的杀死侵入组织中寄生虫的幼虫的功能，如在血吸虫病，毛线虫病和蛔虫病中。
本发明的多肽也可通过调节各种原始造血细胞的活化和分化来调节造血机能。例如，在化疗后从骨髓释放成熟白细胞。
本发明的多肽还可用于靶向不希望的细胞，如在癌症治疗中的编程性细胞死亡。
多核苷酸及由多核苷酸编码的多肽还可用于与科研，DNA合成和DNA载体的制备及设计治疗人体疾病的治疗剂及诊断剂等相关的各种体外目的。
多肽也可用于将骨髓干细胞移至外周血中，使干细胞易于分离。分离的干细胞可在大剂量化疗后用于骨髓集落化。
本发明还涉及Ckβ-13基因用作检测与编码本发明的多肽的核酸序列中存在突变相关的疾病或疾病的易感性的诊断分析的一部分。此类疾病与人趋化因子多肽的低表达相关，如肿瘤和癌症。
携带本发明的基因的突变的个体可通过各种技术在DNA水平上加以检测。用于诊断的核酸可从病人的细胞中获得，如从血液、尿、唾液、活组织检查及尸体剖检中获得。基因组DNA可直接用于检测或可在分析前使用PCR(Saiki et al.，Nature，324163-166(1987))进行酶扩增。RNA或cDNA也可用于同一目的。例如，互补于编码Ckβ-13的核酸的PCR引物可用于鉴别及分析Ckβ-13突变。如通过与正常基因型相比扩增产物的大小的变化能检测缺失或插入。点突变可通过将扩增的DNA与放射标记的Ckβ-13RNA或放射标记的Ckβ-13反义DNA序列杂交加以鉴别。完全匹配的序列可通过RNaseA消化或通过解链温度的不同与错配的双螺旋区分开。
基于DNA序列的不同的遗传测试可通过检测在带有或不带有变性剂的凝胶中的DNA片段的电泳迁移率的改变来完成。通过高分辨率凝胶电泳可观察小的序列缺失及插入。不同序列的DNA片段可通过在变性甲酰胺梯度凝胶中区分，其中不同DNA片段根据其特异的解链温度或部分解链温度在凝胶中的不同位置停留(例见，Myers etal.，Science，230-1242(1985))。
特异位置的序列的改变通过核酸酶保护分析如RNase和S1保护或化学裂解法加以揭示(例如，Cotton etal.，PNAS，USA，8543934401(1985))。
因此，特异性DNA序列的检测可经如杂交、RNase保护、化学裂解、DNA直接测序或使用限制性酶(例如，限制性片段长度多态性(RFLP))及基因组DNA的Southern印迹分析等方法来完成。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序，也可经原位分析检测突变。
本发明还涉及一种检测各种组织中本发明的多肽变化水平的诊断分析法，因为与正常对照组织样品相比该多肽的过量表达可检测疾病或疾病的易感性的存在，如肿瘤。用于检测衍生自宿主的样品中的本发明的多肽水平的分析法已为本领域技术人员所熟知，包括放射免疫分析、竞争-结合分析、Western印迹分析、ELISA分析及“夹心”分析。ELISA分析(Coligan，et al.，Current Protocols inImmunology，1(2)，Chapter 6(1991))最初包括制备一种特异于Ckβ-13抗原的抗体，优选一种单克隆抗体。另外制备一种抗单克隆抗体的报道抗体。该报道抗体与可检测的试剂如放射活性、荧光或本实施例中的辣根过氧化物酶相连。从宿主取出样品且在结合样品中的蛋白质的固相载体中如聚苯乙烯皿中保温，然后用非特异性蛋白如牛血清白蛋白温育而覆盖皿中的任何游离蛋白质结合位点。接着，在皿中温育单克隆抗体，在此期间单克隆抗体与同聚苯乙烯皿结合的任何Ckβ-13蛋白结合，用缓冲液洗去所有未结合的单克隆抗体。将与辣根过氧化物酶连接的报告抗体置入皿中导致报道抗体与同Ck -13多肽相结合的任何单克隆抗体结合，然后洗去未结合的报道抗体。将过氧化物酶底物加入皿中，当与标准曲线相比时在一定时间内的显色量是一定体积的病人样品中ckβ-13蛋白量的测量尺度。
竞争分析的使用方法是将特异于Ckβ-13多肽的抗体与固相支持物相连，将标记的Ckβ-13多肽及衍生自宿主的样品流过固相支持物，通过例如液闪层析检测的标记量与样品中Ckβ-13多肽的量相关。
“夹心”分析与ELISA分析类似，在“夹心”分析中，将Ckβ-13多肽流过固相支持物而结合于同固相支持物连接的抗体。然后将第二抗体与Ckβ-13多肽相结合。将标记的并特异于第二抗体的第三抗体流过固相支持物并结合于第二抗体，然后定量。
本发明提供了一种鉴别本发明的多肽的受体的方法。编码受体的基因可经许多本领域技术人员已知方法如配体淘选和FACS分选(Coligan，et al.，Current Protocols in Immun.，1(2).Chapter 5，(1991))进行鉴别。优选地，采用表达克隆法，其中从对多肽有应答的细胞中制备多腺苷酸化RNA，将产自该RNA的cDNA文库分成各集合体用于转染COS细胞或对多肽无应答的其它细胞。将在玻片上生长的转染细胞暴露于标记的多肽。可用多种方法包括碘化或引入位点特异性蛋白激酶的识别位点将多肽标记。在固定和温育后，对玻片进行放射自显影分析。鉴别出阳性集合体并使用重复的亚集合和重筛选方法制备亚集合体，最后产生编码推测的受体的单一克隆。
作为受体鉴别的另一种方法，可将标记的多肽与细胞膜或表达受体分子的提取制备物光亲和性连接。经PAGE分析将交联材料分解并在X线下曝光。切下含多肽受体的标记复合物，分解成肽片段并进行蛋白质微量测序。由微量测序得到的氨基酸序列用于设计生成一套寡核苷酸探针以筛选cDNA文库从而鉴别编码推测的受体的基因。
本发明提供了一种筛选化合物用以鉴别本发明的多肽的激动剂或拮抗剂的方法。激动剂是一种与本发明的多肽的受体结合并使其活化的化合物，而拮抗剂与这种受体结合并抑制受体或与Ckβ-13竞争受体。趋化性的检测可通过将被本发明的多肽化学引诱的细胞置于具有足够的孔径(约5μm)以容纳细胞的滤膜上。将可能的激动剂的溶液置入小室的底部，而在上部分隔间中带有合适的对照培养基，因此通过计数在一段期间内迁移进入或通过多孔膜的细胞测定激动剂的浓度梯度。
当分析拮抗剂时，将本发明的多肽置入小室底部并加入潜在的拮抗剂以测定细胞的趋化性是否被抑制。
或者，将表达多肽受体的哺乳细胞或其膜制备物在化合物的存在下与如放射性标记的本发明的多肽进行温育，则可检测该化合物阻断此相互作用的能力。
潜在的本发明的多肽的拮抗剂包括与多肽结合的抗体，或在某些情况下，寡核苷酸。潜在的拮抗剂的另一例子是多肽的显性失活突变体。显性失活突变体是与野生型多肽的受体结合但不能保持其生物活性的多肽。
用反义技术制备的反义构建物也是可能的拮抗剂。反义技术通过三螺旋形成或反义DNA或RNA可用于控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，用编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码区设计长度为10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计一DNA寡核苷酸以互补于转录涉及的基因的某区域(三螺旋-见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney etal，Science，241456(1988)；and Dervan et al，Seience，2511360(1991)，从而防止趋化因子多肽的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并阻断mRNA分子翻译成多肽。(反义-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上述的寡核苷酸也可输送至细胞，从而反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制Ckβ-13多肽的生产。
另一种潜在的拮抗剂是多肽的肽衍生物，其是失去生物学功能但仍能识别并与多肽受体结合从而有效地阻断受体的多肽的天然或合成的修饰的类似物，肽衍生物的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
拮抗剂可用于在自身免疫疾病、慢性炎症及感染性疾病当中抑制巨噬细胞及其前体、嗜中性白细胞、嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞及一些T细胞亚型如活化的CD8细胞毒性T细胞及天然杀伤细胞的趋化性和活化作用。自身免疫疾病的例子包括多发性硬化症及胰岛素依赖型糖尿病。
拮抗剂还可通过阻止单核噬细胞的增生及激活治疗如矽肺、结节病、原发性肺纤维化等感染性疾病。也可通过阻止嗜酸性细胞的产生和迁移治疗原发性嗜酸性细胞增多综合症，并可通过阻止巨噬细胞的迁移及其生产本发明的多肽而用拮抗剂治疗内毒性休克。
拮抗剂也可通过阻止在动脉壁的单核细胞的侵润用于治疗动脉硬化。
拮抗剂也可通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒并释放组胺用以治疗组胺介导的变态反应和免疫失调包括晚期变态反应，慢性荨麻疹和特应性皮炎。也可治疗IgE介导的变态反应如过敏性哮喘、鼻炎及湿疹。
拮抗剂也可通过阻止单核细胞对伤口区域侵润治疗慢性和急性炎症。由于急性和慢性肺部炎症与肺内单核吞噬细胞的隔绝有关，因而拮抗剂也可用于调节正常肺吞噬细胞数量。
拮抗剂也可通过阻止单核细胞对患者关节内滑液的侵润用以治疗风湿性关节炎。单核细胞的侵入及激活是退化性和炎症性关节病的一个重要致病因素。
拮抗剂也可用于干扰主要是IL-1和TNF引起的损害性级联作用，其能阻止其它炎性细胞因子的生物合成。由此拮抗剂可用于预防炎症。拮抗剂也可用于抑制趋化因子诱导的前列腺素不依赖型发热。
拮抗剂也可用于治疗骨髓机能低下疾病，如再生障碍性贫血和骨髓发育不良综合症。
拮抗剂还可通过防止嗜酸性细胞积聚在肺内用于治疗哮喘及变态反应。拮抗剂还可用于治疗上皮下基底膜纤维化，其是肺气肿的一个显著特征。
拮抗剂还可与如下所述药学可接受的载体一起形成组合物而应用。
本发明的多肽及激动剂和拮抗剂可以与合适的药物学载体联合应用。如此的组合物包括治疗有效量的多肽和药物学可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其结合物。配制品应适合给药的方式。
本发明还提供了一种药物包装盒或试剂盒，其包括一或多个填充有一或多种本发明的药物组合物成分的容器。与这种容器在一起的还有由控制药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构出具的通知，该通知反应了该机构许可其为人体用而生产、使用或销售。另外，本发明的多肽和激动剂和拮抗剂可以与其它药物化合物结合应用。
此药物组合物可以诸如局部，静脉，腹膜内，肌内，肿瘤内，皮下，鼻内，或皮内途径的传统方式给药。药物组合物的给药量是足以治疗和/或预防特定的病症。一般来说，多肽的给药量至少为大约每天每千克体重10微克，大多数情况下给药量不超过每天每千克体重约8毫克。大多数情况下，考虑到给药途径、症状等，药剂量为每天每千克体重约10微克至1毫克。
根据本发明，本发明的多肽和也是多肽的激动剂或拮抗剂也可以用于体内表达多肽，即经常被称为“基因治疗”的方法。
因此，例如，可用编码来自体内的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对患者的细胞进行工程化，随后将工程化的细胞再提供给需用多肽治疗的患者，这些方法是本领域公知的。例如，可用含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒利用本领域熟知的程序对细胞进行工程化。
类似地，例如也可通过本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化以在体内表达多肽。如本领域所公知的，可将生产含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产者细胞给予患者以在体内进行细胞的工程化并在体内表达多肽。通过这种方法给予本发明的多肽的这些和其它方法对于本领域熟练技术人员根据本发明的教导是显而易见的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其在与合适的输送载体结合后可用于在体内工程化细胞。
可以衍生上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于反转录病毒LTR；SV 40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller，等，生物技术，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或者其它任何启动子(例如真核细胞启动子，如包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述，合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。
编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括，但不限于腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。
使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VI-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN细胞系(Miller，人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，反转录病毒质粒载体可以包在脂质体中，或者和脂类偶联，然后施用到宿主中。
生产细胞系产生感染性的反转录病毒载体颗粒，这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或者体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于胚干细胞、胚癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。
简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用3’-非翻译区的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增片段。
体细胞杂交体的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体特异cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至500或600个碱基的cDNA。此技术的综述见Verma et al.，Human ChromosomesaManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中发现(可在线从JohnsHopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。
接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。
应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。
抗对应于本发明的序列的多肽的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。
为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生产单链抗体的技术(USP4,946,778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。另外，转基因小鼠也可用于表达本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。
以下将参照实施例进一步描述本发明，但是应理解的是，本发明不受这些实施例的限制。除非另有说明，所有的份或量均为重量份或重量。
为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。
“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μg DNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic AcidsRes.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。
“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。
除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法进行转化。
实施例1 Ckβ-13的细菌表达和纯化用对应于加工的Ckβ-13蛋白(减去推测的信号肽序列)的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码Ckβ-13的DNA序列，ATCC#97113。将对应于Ckβ-13基因的附加的核苷酸分别加入到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物序列为5’CCCGCATGCCCAACATGGAAGACAG 3’(SEQ ID NO.3)，其含有一SphI限制性酶位点(黑体字)，后接起自编码成熟蛋白序列的第二个核苷酸的16个Ckβ-13编码序列的核苷酸。ATG密码子包含在SphI位点内，ATG后的下一个密码子，其第一个碱基来自SphI位点，剩下两个碱基对应于推定的成熟蛋白的第一个密码子(残基29)的第二个和第三个碱基。3’序列为5’AAAGGATCCTTGGCTCAGCTTATTGAG3’(SEQ ID NO.4)，其含有互补于BamHI位点的序列(黑体字)，后接18个在终止密码子前的基因特异性序列的核苷酸。限制性酶位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，OA，91311)上的限制性酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr’)，一个细菌复制点(ori)，一个IPTG可调控启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-组氨酸标记(6-His)及限制性酶位点。用SphI和BamHI消化pQE-9。将扩增序列连到pQE-9中并插入有编码6-组氨酸标记的序列及RBS的框架中。然后通过Sambrook，J.et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)所述步骤，用连接混合物转化E.coli菌株M15/rep4(来自Qiagen，Inc.)。M15/rep4含有多拷贝的表达1acI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr’)的质粒pREP4。在LB平板上鉴别转化子并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并经限制性分析确定。在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液体LB培养基中将含有所需构建物的克隆培养过夜(O/N)，O/N培养物以1∶100-1∶250的比例接种到大体积培养基中。培养细胞至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。随后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导激活P/O，使基因表达水平提高。再培养细胞3-4小时，随后离心收集细胞。将细胞沉淀溶解到离液剂6M盐酸胍pH5.0中，澄清后，在使得与含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过镍-鳌合柱层析(Hochuli，E.et al.，J.Chromatography 411177-184(1984)，从溶液中纯化溶解的Ckβ-13。在6M盐酸胍pH5.0中从柱中洗脱Ckβ-13(纯度＞98％)。蛋白质由GnHCl中复性出来可以各种方案进行(Jaenicke，R.andRudolph，R.，Protein Strueture-A Practical Approach，IRL Press，NewYork(1990)。首先使用透析步骤以除去GnHCl。或者从镍-鳌合柱中分离出的纯化的蛋白质结合到第二个柱中，在第二个柱中具有下降的线性GnHCl梯度。在结合到柱中时使蛋白质复性，随后用含250mM咪唑，150mM氯化钠，25mM Tris-HCl pH7.5及10％甘油的缓冲液洗脱。最后，将溶解的蛋白质对含5mM碳酸氢铵的贮存缓冲液透析。
实施例2 重组Ckβ-13在COS细胞中的表达表达质粒Ckβ-13 HA衍生自载体pcDNAI/Amp(Initrogen)，含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)E.coli复制起点，4)CMV启动子，后接多接头区、SV40内含子和多腺苷酸化位点。编码完整Ckβ-13前体和在框内融合到其3’末端的HA标记的DNA片段被克隆至载体的多接头区，从而重组蛋白质直接在CMV启动子下表达。HA标记对应于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA标记与靶蛋白质融合使得用识别HA表位的抗体很容易检测重组蛋白质。
下面阐述质粒构建策略使用两种引物由PCR构建编码Ckβ-13的DNA序列，ATTC#97113，5’引物序列为5’AAAAAGCTTAACATAGGCTCGCCTACAGACT 3’(SEQ ID NO.5)，其含有一HindIII位点，后接18个起自相应于起始密码子-3位的Ckβ-13编码序列的核苷酸；3’序列为5’CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTGGCTCAGCTTATTGAGAAT 3’(SEQ ID NO.6)，其含有互补于XbaI位点，转译终止密码子、HA标记及Ckβ-13编码序列的最后21个核苷酸(不包括终止密码子)的序列。因此PCR产物含有一HindIII位点，Ckβ-13编码序列，后接框内融合的HA标记，HA标记后的转译终止密码子及XbaI位点。将PCR扩增的DNA片段和载体，pcDNAI/Amp，用HindIII和XabI限制性酶消化并连接。用连接混合物转化E.coli菌体SURE(得自Strategene CloningSystems，La Jolla，CA 92037)，在氨苄青霉素培养平板上培养转化的培养物并筛选抗性克隆。从转化子中分离出质粒DNA并用限制性分析检测正确的片段的存在。为表达重组Ckβ-13，将COS细胞通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringLaboratory Press，(1987)。用放射标记和免疫沉淀法检测Ckβ-13HA蛋白的表达(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)。转染二天后，将细胞用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM氯化钠，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))将细胞裂解，将细胞裂解物和培养基用HA特异性单克隆抗体沉淀。将沉淀的蛋白质用SDS-PAGE分析。
实施例3 利用杆状病毒表达系统克隆和表达Ckβ-13利用PCR寡核苷酸引物扩增编码全长Ckβ-13蛋白质的DNA序列，ATCC#97113，所说引物相应于该基因的5’和3’序列Ckβ-135’引物具有序列5′AAAGGATCCGCCACCATGGCTCGCCTACAGACT3′(SEQ ID NO7)，包含BamHI限制位点(粗体)，后接类似真核细胞中起始翻译的有效信号的6个核苷酸(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))，以及Ckβ-13基因的头18个核苷酸(翻译起始密码子“ATG”以下划线示出)。
3’引物具有序列5′AAAGGTACCCCTCATTGGCTCAGCTTATT3’(SEQ ID NO8)，包含限制性内切酶Asp718的切割位点和互补于Ckβ-13基因3’-非翻译序列的18个核苷酸。用市售试剂盒(“Geneclean”BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的序列。然后将所说的片段用核酸内切酶BamHI和Asp718消化，并在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。此片段指定为F2。
载体pRG1(由pVL941载体修饰而成，见下文讨论)用于表达Ckβ-13蛋白质，这种表达使用杆状病毒表达系统(综述参见Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)强多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶BamHI和Asp718的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替pRG1，所说的载体如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，17031-39)。
用限制酶BamHI和Asp718消化所说的质粒，并用本领域已知的方法利用小牛肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后用市售试剂盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA命名为V2。
用T4 DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌HB101细胞并利用限制酶BamHI和Asp718鉴别含有带Ckβ-13基因的质粒(pBac Ckβ-13)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。
用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，847413-7417(1987))将5μg质粒pBac Ckβ-13与1.0tg市售的线性杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。
将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pBac Ckβ-13在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。在添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s的培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1毫升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。
4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑(“噬斑测定”的详尽的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。
四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于包含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。
使Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-Ckβ-13感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减去甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前，将细胞进一步培养16小时，标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。
实施例4 通过基因治疗的表达成纤维细胞得自皮肤活组织检查的材料，将所得组织置入组织培养物培养基并分成小片。将小体积组织放在组织培养瓶的湿表面上，在每瓶中放置大约10片组织。将瓶倒转，密封并在室温下过夜。在室温下24小时后，将瓶颠倒，组织仍固定在瓶底，加入新鲜培养基(如含有10％FBS、青霉素及链霉素的Ham”S F12培养基)。然后在37℃温育大约一周。此时加入新鲜培养基，每几天换一次。又培养两周后，成纤维细胞的单层形成。将该单层胰蛋白酶化并量入较大的烧瓶。
将两侧具有Moloney鼠肉瘤病毒的长末端重复序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.，DNA，7219-25(1988))用EcoRI及HindIII消化，随后用牛肠磷酸酶处理。用玻璃珠在琼脂糖凝胶中将线性载体分离并纯化。
编码本发明多肽的cDNA用分别对应于5’和3’末端序列的PCR引物扩增。5’引物包括一EcoRI位点而3’引物还包括一个HindIII位点。将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性骨架及扩增的EcoRI和HindIII片段在T4 DNA连接酶的存在下加到一起。在使两片段连接的合适条件下保持所得混合物。该连接混合物用于转化细菌HB101，然后将其在含卡那霉素的琼脂上铺板用以确定载体具有正确插入的感兴趣的基因。
兼嗜性pA 317或Gp+am12包装细胞在含10％牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dvlbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)中组织培养生长至铺满密度。然后将含基因的MSV载体加入培养基并用MSV载体转导包装细胞。包装细胞现能生产含基因的感染性病毒颗粒(现将包装细胞称为生产者细胞)。
将新鲜培养基加入转导的生产者细胞，随后自铺满的生产者细胞的10cm平板中收集培养基。将含感染性病毒颗粒的失效培养基经微孔滤膜过滤以除去脱落的生产者细胞，然后该培养基用于感染成纤维细胞。自成纤维细胞的一个亚铺满平板中除去培养基并迅速用取自生产者细胞的培养基代替。除去该培养基并替以新鲜培养基。如果病毒的滴度较高，则所有成纤维细胞都被感染且不需筛选。如果病毒的滴度很低，则需要使用具有选择标记如neo或his的反转录病毒载体。
随后将工程化的成纤维细胞注射入宿主，或者将将工程化的成纤维细胞在cytodex 3微载体珠上培养至铺满后再注射入宿主。现在成纤维细胞可以生产蛋白质产物。
依据上述教导对本发明可做各种修改及变动，因此在权利要求范围内本发明可以与具体描述的不同方法实施。
序列表(1)一般信息(i)申请人LI，ET AL.(ii)发明名称人趋化因子β-13(iii)序列数8(iv)联系地址(A)联系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新泽西州(E)国家美国(F)邮编07068(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号(B)申请日(viii)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36，134(C)案号/文档号325800-(ix)通讯信息(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度282个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGCTCGCC TACAGACTGC ACTCCTGGTT GTCCTCGTCC TCCTTGCTGT GGCGCTTCAA60GCAACTGAGG CAGGCCCCTA CGGCGCCAAC ATGGAAGACA GCGTCTGCTG CCGTGATTAC 120GTCCGTCACC GTCTGCCCCT GCGCGTGGTG AAACACTTCT ACTGGACCTC AGACTCCTGC 180CCGAGGCCTG GCGTGGTGTT GCTAACCTTC AGGGATAAGG AGATCTGTGC CGATCCCAGA 240GTGCCCTGGG TGAAGATGAT TCTCAATAAG CTGAGCCAAT GA 282(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度93氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Arg Leu Gln Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu-25 -20 -15Ala Val Ala Leu Gln Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn-10 -5 1Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu5 10 15Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser Cys20 25 30Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu Ile35 40 45Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu Asn Lys50 55 60Leu Ser Gln65(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCGCATGCC CAACATGGAA GACAG 25(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4AAAGGATCCT TGGCTCAGCT TATTGAG 27(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AAAAAGCTTA ACATAGGCTC GCCTACAGAC T31(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT TGGCTCAGCT TATTGAGAAT 60(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7AAAGGATCCG CCACCATGGC TCGCCTACAG ACT 33(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8AAAGGTACCTC ATTGGCTCAG CTTATT 2权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的成员(a)编码包括SEQ ID NO2所示的-28位氨基酸至65位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)编码包括SEQ ID NO2所示的1位氨基酸至65位氨基酸的多肽的多核苷酸；(c)能与(a)或(b)的多核苷酸杂交且与其有至少70％相同性的多核苷酸；(d)(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。
3.权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO2的-28位氨基酸至65位氨基酸的多肽。
4.权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO2的1位氨基酸至65位氨基酸的多肽。
5.一种分离的多核苷酸，包括选自如下一组的成员(a)编码具有由ATCC保藏号97113所含的DNA表达的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)能与(a)所述多核苷酸杂交且与其至少有70％相同性的多核苷酸；(c)(a)或(b)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
6.一种含有权利要求2的DNA的载体。
7.用权利要求6的载体基因工程化的宿主细胞。
8.一种生产多肽的方法，包括用权利要求7的宿主细胞表达由所述DNA编码的多肽。
9.一种生产能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求6的载体对细胞进行基因工程化。
10.一种多肽，选自如下一组(i)具有SEQ ID NO2的推导的氨基酸序列的多肽及其片段、类似物及衍生物；以及(ii)由ATCC保藏号97113的cDNA编码的多肽及所述多肽的片段、类似物及衍生物。
11.一种模拟权利要求10的多肽的活性的化合物。
12.一种拮抗权利要求10的多肽的活性的化合物。
13.一种权利要求10的多肽的抗体，包括选自单克隆抗体和多克隆抗体组成的一组的成员。
14.一种治疗需要Ckβ-13的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求10的多肽。
15.权利要求13的方法，其中通过提供给患者编码所述多肽的DNA并在体内表达所述多肽而给予治疗有效量的多肽。
16.一种治疗需要抑制Ckβ-13多肽的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求12的化合物。
17.一种诊断与权利要求10的多肽低表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，包括检测编码所述多肽的核酸序列中的突变。
18.一种诊断方法，包括分析衍生自宿主的样品中权利要求10的多肽的存在。
19.一种鉴别作为权利要求10的多肽的激动剂有活性的化合物的方法，包括(a)在细胞应答权利要求13的多肽而正常迁移的条件下将待筛选的化合物与所述细胞接触；(b)确定细胞迁移的程度以鉴别该化合物是否是有效的激动剂。
20.权利要求18的方法，其中将Ckβ-13多肽加到步骤(a)的结合物中，并且迁移程度的确定能鉴别化合物是有效的拮抗剂。
全文摘要
本发明公开了人趋化因子多肽和编码这种趋化因子多肽的DNA(RNA),以及通过重组技术生产这种多肽的方法。还公开了利用该趋化因子多肽用于治疗白血病、肿瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纤维化疾病、伤口愈合及银屑病的方法,以及抗此趋化因子多肽的拮抗剂及其作为治疗剂治疗风湿性关节炎、自身免疫和慢性和急性炎症及感染性疾病、变态反应、前列腺素不依赖型发热及骨髓功能低下的应用。还公开了用于检测与核酸序列中的突变和多肽的改变浓度相关的疾病诊断方法,以及用于检测编码趋化因子多肽的多核苷酸中的突变以及检测宿主中多肽的改变水平的诊断方法。
文档编号C12N15/63GK1183807SQ95197843
公开日1998年6月3日 申请日期1995年6月6日 优先权日1995年6月6日
发明者李浩东, 乔治·塞贝尔 申请人:人体基因组科学有限公司, 史克比彻姆公司