专利名称：人神经肽受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新近鉴别的多核苷酸、由这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途以及这些多核苷酸和多肽的生产方法。本发明的多肽是人7-转膜G-蛋白偶联受体。更具体地说，本发明的多肽是神经肽受体多肽(此后有时称作神经肽受体多肽)。本发明也涉及抑制这些多肽的作用的方法。
肥胖症是在西方社会中最普通的营养性疾病。十个成年的美国人中的三个体重超过他们理想体重的至少20％(Burroa，M.纽约时报，19947月17日)。增加的体重是一个重要的公共卫生问题，因为它与II型糖尿病，高血压，血脂过多和某些癌症有关(Grundy，S.M.和Barnett，J.P.，Disease-a-Month，36645-696(1990))。
在导致肥胖表型的小鼠肥胖基因(ob)中的5个单一基因突变已有描述(Priedman，J.M.&Leibel，R.L，细胞，66217-220(1990))。小鼠ob基因和其人类同系物的克隆与测序已被报道(Zhang，Y.，等，自然，372425-431(1994))。ob基因编码具有高度保守的167个氨基酸的开放读框的4.5-kb脂肪组织mRNA。预测的氨基酸序列在人类和小鼠之间84％相同，并且具有分泌蛋白质的特征。ob基因产物可以作为脂肪组织信号途径的一部分起作用，其为了调节身体脂肪积存而发挥作用(同上，425)。
在牵涉进食行为调节的脑区中，下丘脑的腹内侧核(VMH)被认为是中枢神经系统(CNS)中最重要的饱满中心。因此假定在哺乳动物中的能量平衡被反馈-环控制，在其中所存储的能量的量由下丘脑感知，其调节食物摄入和能量消耗以维持恒定体温(Ombeck，J.R.，Yale生物医学杂志，20545-552(1948)和Kennedy，G.C.，Proc.R.Soc.148578-592(1953))。在脂郁积(lipostasis)理论中，身体脂肪积存的多少由CNS调节，身体脂肪代谢的产物通过与下丘脑相互作用来影响能量平衡(Kennedy，G.C.，Proc.R.Soc.148578-592(1953))。
不能从脂肪鉴别推定的信号障碍了脂郁积理论的证实。至少一种信号系统的组分在血流中循环的可能性最早由Hervey提出(Dietrich，W.等，遗传学，131423-447(1992))，他显示了通过血管移植物将血液从具有VMH损伤的动物转移到未处理的动物中(联体生活实验)导致在无伤的动物中食物摄取的减弱。现在明显的是，具有ob基因产物被分泌的证据，表明ob可以编码这一循环因子。
ob信号可以直接或者间接地作用于CNS上，以作为内环境稳定的机制的一部分抑制食物摄取和/或者调节能量消耗，保持脂肪质量的恒定性(Zhang，V等，自然，372425-431，431(1994))。ob基因显然编码脂肪分泌的蛋白质，并且突变明显地阻止所述基因的翻译或表达(Rink，T.，自然，372406-407(1994))。
联体生活实验表明ob受体由小鼠db(糖尿病)基因编码(Coleman，D.L.，Diabetologia，14141-149(1978))。具有db基因中的突变的小鼠也肥胖，具有可能是受体缺损的缺损(同上，406)。
神经肽Y类似于ob基因产物之处在于它调节进食反应。神经肽Y作用于被称为Y1、Y2、Y3和非典型的Y1受体(其调节由神经肽Y刺激的进食反应)的至少四种类型的神经肽Y受体上。
神经肽Y有各式各样的生物功能。发现神经肽Y广泛分布于中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)中，在PNS中，神经肽Y在血管去甲肾上腺素能交感神经神经分布和其它平滑肌组织中以及肠神经系统内的神经元中发现。神经肽Y免疫反应性纤维也出现在非血管平滑肌中，围绕着外分泌腺和表面上皮。神经肽Y也出现在神经元亚群中，一般与其它神经介质(特定的去甲肾上腺素)共同定位。
在CNS中，神经肽Y包含在更高的中心和优势儿茶酚胺能细胞(其更后地凸出)的GABA能中间神经元中。例如，神经肽Y包含在皮、海马、扁桃体、基部前脑和纹状体中的中间神经元中，而在人脑干中，神经肽Y包含在髓质和蓝斑(locus coeruleus)(LC)中的A1和A2组的去甲肾上腺素能神经元中。在下丘脑中，神经肽Y显著地在弓形核和外侧下丘脑发现。
在外周神经系统内，神经肽Y存在于神经节后部交感神经中，并如上所述，与其它神经介质(包括儿茶酚胺)共同定位。当在药理学上使用时，神经肽Y显示出有效的血管收缩活性，并且戏剧性地加强由许多其它压力剂产生的血管收缩。特别是，发现在交感神经中高浓度的神经肽Y使得冠状、脑部和肾部血管收缩，并且当融合进这些血管床时，神经肽Y导致延长的不被肾上腺素能阻断剂逆转的血管收缩。这些观察结果导致产生这样一种观点神经肽Y是病理学血管痉挛(当涉及冠状和脑部血管时，是主要的发病和死亡因素)的候选介质。
神经肽Y似乎也牵涉与肾素血管紧张素系统的相互作用。在肾皮层近血管小球器官中发现含有交感神经末端的神经肽Y，并且神经肽影响肾素释放。这些信息以及高血压动物模型中神经肽Y浓度的所有持续时间的实证和输注所述肽的压力反应导致得自这样一种结论这种肽牵涉到高血压。
在中枢神经系统中，神经肽Y主要定位在中间神经元之内，在此其似乎具有调节作用。因此，其具有广泛的和不同的作用，包括对记忆的作用和在阿耳茨海默氏病中的可能的作用。神经肽Y是引起增加进食的最有效的已知物质，可以在II型糖尿病的遗传基础中起作用。神经肽Y也可以作为压迫反应和生殖功能中的调节剂和脑垂体功能以及潜在的神经调节功能发挥作用。
按照本发明的一个方面，本发明提供了新的成熟多肽以及其生物活性的和并且在诊断上或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是人类来源的。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了编码本发明的受体多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其反义类似物和其生物学活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段和衍生物。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了经重组技术产生这种受体多肽的方法，该方法包括在促进本发明的受体多肽表达的条件下，培养含有编码所述受体多肽之核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，并且接着回收所说的多肽。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了筛选结合到本发明的受体多肽上并激活该多肽或抑制该多肽的激活的化合物的方法。
按照本发明的另一实施方案，本发明提供了为了刺激神经元生长，调节神经传递，增强活性水平和摄取的食物的利用度，向宿主施用化合物的方法，所述化合物结合到本发明的受体多肽上并激活该多肽，该多肽在预防和/或治疗肥胖、高脂血和某些癌症中是有用的。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了经基因治疗施用所述受体多肽的方法，以治疗与本发明的受体多肽的过量表达或所述受体多肽之配体的表达不足相关的病症。
按照本发明的另一实施方案，本发明提供了向宿主施用化合物的方法，所述化合物结合到本发明的受体多肽上并抑制该多肽的激活，其在预防和/或治疗阿耳茨海默氏病、II型糖尿病、癫痫、紧张、焦虑、高血压，心血管病、精神病和由神经肽Y引起的肥胖中是有用的。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了核酸探针，这种核酸探针包含长度足以特异性地与编码本发明的多核苷酸序列杂交的核酸分子。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了检测与编码本发明的多肽之核酸序列中的突变相关的疾病以及检测受体多肽的可溶形式的改变的水平的诊断测定方法。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了将这些受体多肽，或编码这些多肽的多核苷酸体外用于与科学研究、DNA合成及DNA载体的人工合成有关之目的的方法。
从本文的教导中，本领域技术人员会清楚本发明的这些和其它方面。
下列附图用来说明本发明的实施方案，而无意于用来限制本发明权利要求所包括的范围。
图1显示了本发明的神经肽受体多肽的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。使用了氨基酸标准单字母缩写。采用373自动DNA测序仪(Applied Biosystem公司)进行测序。
图2显示了本发明的神经肽受体剪接变体1多肽的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。使用了氨基酸标准单字母缩写。
图3显示了本发明的神经肽受体剪接变体2多肽的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。使用了氨基酸标准单字母缩写。
图4说明了所述神经肽受体的氨基酸序列和7个转膜区。所述转膜区有下划线，并用TM表示。
图5说明了所述神经肽受体剪接变体1的氨基酸序列和7个转膜区。所述转膜区有下划线，并用TM表示。
图6说明了所述神经肽受体剪接变体2的氨基酸序列和7个转膜区。所述转膜区有下划线，并用TM表示。
图7显示了本发明的人神经肽受体多肽(和人神经肽Y1受体)之间的氨基酸同源性。
本发明的受体多肽是一些已知和未知配体的受体，所说配体调节中枢神经系统和由中枢神经系统调节的外周组织两者中的细胞的活性。这种配体的例子是神经肽Y、物质P、人ob基因产物和神经激肽B。因此，本发明的受体多肽活性的调节会具有广泛的治疗和诊断用途，特别是对糖尿病的治疗而言。
本发明人分离了编码人类神经肽受体多肽的全长cDNA克隆。所述全长cDNA已被定位到人1号染色体位置p31-34上，其相应于发现db基因的小鼠4号染色体上的位置。人们认为小鼠db基因编码肥胖基因产物的受体。
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，这种核酸编码具有图2的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或由1995年4月27日以保藏号ATCC-----保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
本发明的多核苷酸在来源于成人下丘脑的cDNA文库中发现，其在结构上和G蛋白偶联受体家族相关，所述神经肽受体多肽包含一个编码402个氨基酸残基的蛋白质的开放读框。所述神经肽受体蛋白质显示出与人神经肽受体Y1受体蛋白质最高程度的同源性，在整个氨基酸序列上具有52％的相似性和26％的相同性。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。这种DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1所示的编码序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的编码序列相同；由于遗传密码的丰余性或简并性，这种编码序列也可以是一种不同的编码序列，其能和图1的DNA(SEQ ID NO1)或所说保藏物的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图2的成熟多肽(SEQID NO2)或编码由所述所说保藏物的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括仅仅是编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列(和可有可无的附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5′和/或3′非编码序列。
这样，“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体，这种变体编码具有图2的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种多核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。
这样，本发明包括编码如图1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及编码如图1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽的片段、衍生物和类似物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体、取代变体、添加或插入变体。这种变体的特定例子包括SEQ ID NO3和5所示的多核苷酸序列，其分别编码本发明的多肽的剪接变体1和2。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一种编码序列，该序列是图1中所示的编码序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体。本领域已知等位变体是多核苷酸序列的另一种形式，其可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，而实质上不改变所编码的多肽的功能。
所述多核苷酸也可以编码神经肽受体多肽的可溶形式，该多肽是本发明的全长多肽裂解TM和胞内功能域后的多肽的胞外部分。
本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸。在细菌宿主的情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，其用来纯化与标记融合的成熟多肽，或者例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。所说的HA标记相应于来源于流感血细胞凝集素蛋白质的一种表位(Wilson，I.，等，细胞，37767(1984))。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(条件是两个序列之间具有至少70％，优选地具有至少90％，更优选地具有至少95％的等同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语“严格条件”指仅在序列间具有至少95％，优选地具有至少97％的相同性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中，与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上保持与由图1的cDNA(SEQ ID NO1)或所说保藏物的cDNA(s)编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性，即，通过保留结合受体之配体的的能力(即使所述多肽不能作为膜结合神经肽受体起作用)，例如通过引发第二信使反应，作为一种可溶性的神经肽受体起作用。
此外，所述多核苷酸可以具这样一些多核苷酸，其具有至少20个碱基，优选地是至少30个碱基，更优选地是至少50个碱基，其与本发明的多核苷酸杂交，并且如上所述具有与该多核苷酸的相同性，不保留活性。这种多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸或其变体的探针，例如或作为诊断探针或作为PCR引物用于回收多核苷酸。
本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保持。这些保持物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便，并不是35 U.S.C 112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考，并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾。对保藏材料的任何制造、使用或者销售需要经过许可，在此未给予任何这样的许可。
本发明还涉及多肽，其具有图2的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的FGF多肽或具有由所说保藏物的cDNA编码的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的片段、类似物和衍生物。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，当有关图2的多肽(SEQ ID NO2)或由所说保藏物的cDNA编码的多肽时，指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。即，通过保留结合受体之配体的的能力(即使所述多肽不能作为膜结合神经肽受体起作用)。这样，类似物包括蛋白原，这种类似物可以由蛋白原部分切除进而产生活性成熟多肽激活。特定的例子分别是图2和3(SEQ ID NO4和6)的剪接变体1和2。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。
所说的图2的多肽(SEQ ID NO2)或由所说保藏物的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代(优选地是保守氨基酸残基取代)取代并且取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码子编码的氨基酸残基，或者(ii)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(iii)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)这样一种，其中附加氨基酸与成熟多肽融合，例如这样一种序列，其是用来纯化成熟多肽的序列，或者(iv)成熟多肽的剪接变体，该变体可以具有从成熟多肽的一个或多个氨基酸缺失。通过本文的阐述，可以认为这样的片段、衍生物以及类似物在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明优选地是提供分离形式的多肽和多核苷酸，并且优选地是将所述多肽和多核苷酸纯化成同质性的。
术语“基因”是指和产生多肽链有关的DNA区段；其包括编码区之前的区域和之后的区域(前导区和尾随序列)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“分离的”意指所述的物质脱离了其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，其仍然是分离的，这是因为这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明的多肽的方法。
宿主细胞用本发明的载体经基因工程操作(转导、转化或转染)，所说的载体可以是克隆载体或表达载体。该载体可以是例如，质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在修饰得适于激活启动子、选择转化体或扩增人神经肽受体基因的常规营养培养基中培养。培养条件，例如温度和pH值等，是以前用于表达选择的宿主细胞的那些，对普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病病毒)。然而，任何其它载体也可以使用，只要其在宿主中可复制和稳定。
可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。
在表达载体中所说的DNA序列可操作地连接到适当的指导mRNA合成的表达控制序列(启动子)上。这样的启动子的代表性例子可以提到的是LTR或SV40启动子，大肠杆菌的lac或trp、噬菌体λPL启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，其提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征(例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性)。
包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或者控制序列的载体可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的阐述，对适当的宿主的选择在本领域技术人员的知识范围之内。
更具体地说，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒的载体，该载体已正向或反向插入了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下，构建体还包含可操作连接到所述序列上的调节序列，包括例如启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体细菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(St ratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它质粒或载体都可以使用，只要它们在宿主中可复制和稳定。
可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。对适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或者宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法，(1986))。
宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式生产由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成仪合成产生。
本发明的多肽片段可以用于经肽合成产生相应的全长多肽。因此所述片段可以用作产生全长多肽的中间体。本发明的多肽片段可以以类似的方式用于合成本发明的全长多肽。
成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。采用来源于本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来产生这种蛋白质。Sambrook等，分子克隆实验室手册，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
高等真核生物编码本发明的多肽的DNA的转录被插入到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点晚期一侧100至270 bp上的SV40增强子、细胞肥大病毒早期启动子增强子、复制起点晚期一侧上的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。
一般来说，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如，大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列以合适的方式(phase)与翻译起始和终止序列装配，优选地，与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白，这种蛋白质包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽，所需特征例如，表达的重组产物稳定或简化纯化步骤。
通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列及合适的翻译起始和终止信号以可操作阅读方式(reading phase)与具有功能性启动子一起插入来构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以在宿主来保证保持载体和需要时提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种(虽然其它的也可以选择来使用)。
作为一个代表性的但不是限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。
在合适的宿主菌株转化和合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。
典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保持所形成的粗产物用于进一步的纯化。
可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻融循环、声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。这些方法是本领域技术人员公知的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman(细胞，23175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。
本发明的神经肽受体多肽可以用以前所使用的方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换层析、磷纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)作为最后的纯化步骤。
本发明的神经肽受体多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料。
本发明的人类神经肽受体多肽可以用于筛选结合并激活所述受体多肽的化合物的方法中，和用于筛选结合到本发明的受体多肽上并抑制其激活的化合物的方法中。
一般来说，将分离的，固定化的或者细胞结合形式的神经肽受体与多种化合物接触并选择那些与所述受体结合并与其相互作用的化合物。通过采用放射性标记的感兴趣化合物或通过从候选化合物的相互作用和结合产生的第二信使效应可以直接测定所述的结合或相互作用。此外，可以对候选化合物进行竞争筛选测定，其中将已知配体和待试验的化合物一起引入，并测量化合物抑制或者增强标记配体结合的能力，优选的配体是用分析上可检测的试剂标记的，最优选的是放射活性的。就化合物对本发明的受体多肽的增加的亲和性和选择性来筛选化合物。
一种这样的方法涉及使用黑素细胞，该细胞是被转染的以表达本发明的神经肽受体。在1992年2月6日出版的PCT WO 92/01810中描述了这种筛选技术。
例如，为了筛选抑制本发明的受体多肽激活的化合物，将所述化合物和已知结合受体的配体与黑素细胞接触。对配体产生的信号的抑制作用表明所述化合物抑制所述受体的激活。
通过将所述细胞与待筛选的化合物接触并检测这种化合物是否产生信号(即激活受体)，该筛选方法可以用于测定结合并活化本发明的受体多肽的化合物。
其它例子包括在测定由受体激活引起的胞外pH改变的系统中使用表达本发明的受体多肽的细胞(例如，转染的CHO细胞)，例如科学，246卷，181-296(1989年10月)中所描述的。例如，可以将化合物与表达本发明的受体多肽的细胞接触，并可以检测第二信使反应(例如信号转导或pH改变)，以确定所述潜在的化合物作为激活剂或抑制剂是否有效。
另一个例子涉及将编码本发明的神经肽受体的RNA引入到非洲蟾蜍属卵母细胞中以瞬时表达所述受体。然后，可以将卵母细胞与受体配体和待筛选的化合物接触，接着检测胞内钙的抑制或增加。
另一个例子涉及在细胞表面表达本发明的神经肽受体多肽，其中，所述受体多肽连接到磷脂C或D上。作为这些细胞的代表性例子可以提到的是内皮细胞、平滑肌细胞、胚肾细胞等。可以如上所述从磷脂第二信号检测受体激活或受体激活的抑制来完成所述筛选。
另一种方法涉及测定标记配体结合到细胞(在其表面上具有神经肽受体)上的抑制作用。这样一种方法包括用编码本发明的神经肽受体多肽的DNA转染真核细胞以便所述细胞在其表面表达所述受体，并且在标记形式的已知配体存在下使细胞与化合物接触。所述配体可以是例如用放射性标记的。通过例如测定受体的放射性检测连接到受体上的标记配体的量。如果在经结合到受体上的标记配体的减少测得化合物结合到受体上，则标记配体与受体的结合受到抑制。
另一种筛选技术涉及在细胞表面表达本发明的神经肽受体多肽，其中，所述受体多肽连接到第二信使上以增加转染CHO细胞中胞质钙水平。这种方法的例子包括用编码本发明的受体的核酸序列转染CHO细胞，以便所述受体在其表面表达。然后，将转染过的细胞在待筛选的化合物存在下在具有标记钙的反应混合物中培养。然后通过利用标记(例如放射性)检测转运到细胞中的标记钙的量可以测定化合物增加钙摄入或抑制钙摄入的能力。
结合到CNS内的特定亚区上的化合物也可以通过以上方法鉴别，所述亚区对通过与本发明的神经肽受体多肽的间接相互作用的特定行为是重要的。
为了测定胞内环状AMP水平，在用100微摩尔异丁基黄嘌呤(ISMX；西格马)处理15分钟的全细胞中测定环状AMP。将转染细胞(1X106/0.5毫升)用10微摩尔毛喉素和各种浓度的已知或未知受体配体温育。经添加盐酸至0.1M，在室温下温育15分钟，中和并以50mM乙酸钠(pH6.2)进行样品稀释终止反应。采用放射免疫测定法定量环状APM。
为了测定胞内钙水平，将转染细胞悬浮在上样培养基(修饰的RPMI 1640培养基/10mM Hepes/1％新生牛血清)中并在旋转摇瓶中以1X106个细胞/毫升于37℃温育2.5小时。然后于37℃用1微摩尔Fura-2乙氧甲基酯(Fura-2AM；分子探针)处理细胞30分钟，用上样培养基洗涤两次，并以5X106个细胞/毫升再悬浮。在将要荧光分光光度分析之前，在1000 rpm下经离心回收细胞，在含有磺吡酮的修饰的Krebs缓冲液(135 mM NaCl/4.7 mM KCl/1.2 mM MgSO4/1.2mMKH2PO4/5mM NaHCO3/1mM CaCl2/2.8 mM葡萄糖/10 mM hepes，pH7.4)中以1X106个细胞/毫升再悬浮。Bombesin购自西格玛和Auspep。用5nm狭缝宽度和2秒的反应时间在340nm(激发)和505nm(发射)处在Hitachi荧光分光光度计(F4010)上进行荧光记录。采用Grynkiewicz等，生物化学杂志2603440-3450，1985描述的等式定量胞内钙。
本发明也提供了治疗和/或预防肥胖的方法，该方法通过对宿主施用结合并激活本发明的受体多肽的化合物。这样一种化合物不是Zhang，等，自然，372425-431(1994)所公开的ob基因产物。本发明的受体多肽在人染色体上的位置相应于编码ab基因产物之受体的小鼠染色体的位置。人ob基因编码“饱满”(satiety)因子，该因子结合并激活本发明的受体多肽。因此，激活本发明的受体多肽的化合物会降低食欲和阻止肥胖。
以上描述的化合物也可以用于增强活动水平、改善进餐行为、增加消化食物的利用度和调节脂肪贮藏的积存。也可以用结合并激活本发明的受体多肽的化合物治疗与肥胖相关的病症，包括血脂过多、II型糖尿病和某些癌症。
这些化合物也可以用于治疗和/或预防其它与本发明受体多肽或结合到其上的配体的表达不足相关的病症，例如用于刺激神经元生长。
抑制本发明的受体多肽激活的化合物的特定的例子包括抗体，或者在某些情况下包括寡核苷酸，其结合所述受体但不引发第二信使反应从而阻止所述受体的活性。
另一个例子是与受体配体密切相关的蛋白质，即配体片段，其丧失了生物学功能，并且在结合到受体上时不引发反应。
另一个例子是采用反义技术制备的反义构建体。反义技术可以通过三螺旋形成或反义DNA或者RNA来控制基因的表达，这两种方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的结合。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用来设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。一种DNA寡核苷酸被设计成与转录所涉及的基因区互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科学，241456，(1988)；和Dervan等，科学，2511360(1991))，进而阻止本发明多肽的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内和mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译成为本发明的多肽(反义-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以传送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA和DNA，抑制所述多肽的产生。
另一个例子是小分子，这些小分子结合到本发明的神经肽受体上，使得受体不能接近其配体，由此阻止正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子以及神经肽Y片段和/或衍生物。
本发明的神经肽受体多肽的可溶性形式(例如，受体的片段，其结合到配体上并阻止配体与膜结合受体相互作用)也可以抑制本发明的受体多肽的激活。
本发明还提供了将抑制激活的这种化合物用于治疗与本发明的神经肽受体多肽的过量活性相关的异常疾病和治疗肥胖的方法，这是因为本发明的神经肽受体多肽可以结合神经肽Y，后者是引起进食行为增加和II型糖尿病的最有力的已知物质，神经肽Y可以在这一疾病的遗传基础中起作用。
本发明的抑制受体多肽激活的化合物可以用于治疗和/或预防高血压，这是因为神经肽Y刺激肾素释放并且已知神经肽Y在涉及冠状和脑部血管时具有潜在的血管收缩活性。
本发明的化合物也可以用于治疗阿耳茨海默氏病，这是因为神经肽受体在中枢神经系统中普遍存在，并且占优势地定位在内神经元内，此时，它们显得对记忆和阿耳茨海默氏病具有调节作用。
所述化合物也可以用于在海马中抑制神经肽Y的刺激性传递，并因此可以用于治疗癫痫发作、紧张和忧虑。
神经肽受体在中枢神经系统中普遍性表明抑制本发明的神经肽受体多肽的化合物通过调节神经传递可以用作抗精神病的药物。
抑制本发明的受体多肽的化合物也可以用于治疗病理性血管痉挛，包括冠状和脑部血管的血管痉挛。
本发明也提供了测定未知是否能够结合到本发明的神经肽受体上的配体是否可以结合到其上的方法，该方法包括在足以使以前鉴别为结合这样的受体的配体结合到受体上的条件下，把待鉴别的配体与包含神经肽受体编码序列并在其表面上表达该序列的细胞接触。在其它实施方案中，包含受体的细胞膜组分或分离的游离受体或固定在固体支持物上的分离受体可以用于测定待试验的配体的结合。当重组细胞用于受体表达目的时，优选地是使用具有少的或者没有内源性受体活性的细胞，以便结合(如果存在任何结合的话)是由于表达的目的受体的存在所致。优选的细胞包括人类早期肾细胞、猴肾(HEK-293细胞)、成纤维细胞(COS)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、果蝇或鼠L-细胞。优选地采用其中存在受体反应性第二信使系统的细胞为宿主细胞。著名的第二信使系统包括在响应配体结合到胞外受体域中磷酸肌醇水解、腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶或离子通道活性的增加或减少。在另外的实施方案中，可以构建特异设计的受体结合指示剂。例如，融合蛋白可以通过把本发明的受体与对受体配体结合敏感的蛋白质功能域融合来制备。这里称作指示剂功能域的这种功能域自身或者与附加分子一起能够产生分析上可检测的信号，其指示受体配体结合。
本发明也提供了通过检测编码受体的mRNA的存在而检测本发明的神经肽受体多肽在细胞表面上表达的方法，该方法包括从细胞获得总mRNA，将如此获得的mRNA与核酸探针接触(所述探针包含至少10个核苷酸的核酸分子，在杂交条件下其能够与包含在编码所述受体的核酸分子内的序列特异性地杂交)，检测杂交到探针上的mRNA的存在，进而检测细胞对受体的表达。
本发明也提供了用于鉴别与本发明的受体多肽相关的受体的方法。可以由与本发明的神经肽受体多肽的同源性鉴别这些相关受体，其是通过低严格性交叉杂交、或通过鉴别受体进行的，所述受体与相关天然或合成配体相互作用或在本发明的神经肽受体多肽的遗传或药理学阻滞后激发类似的行为。
所述基因片段可以用作cDNA文库的杂交探针，以分离具有与本发明的基因高同源性或者类似生物学活性的的其它序列。这种类型的探针优选地具有50个碱基或者更多。所述探针也可以用于鉴别与全长转录物和基因组克隆或克隆相应的cDNA克隆，其包含包括调节和启动子区、外显子和内含子在内的本发明的完整基因。这种类型的筛选的实例包括通过利用已知DNA序列合成寡核苷酸探针分离所说基因的编码区。具有与本发明的基因的序列互补性的标记的寡核苷酸用于筛选人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针杂交到文库的哪些成员上。
所述神经肽受体多肽和以上鉴别的为多肽的化合物可以依据本发明通过体内表达这样的多肽来利用，这常被称作“基因治疗”。
这样，例如，可以体外对细胞用编码多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)进行基因工程操作，用工程细胞向被治疗的患者提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的，并且由本文的描述也显而易见。例如，可以用本领域公知的方法用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。
同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。如本领域已知的，产生包含编码本发明的多肽之RNA的逆转录病毒颗粒的产生细胞可以施用到患者以便体内经基因工程操作细胞并体内表达所说的多肽。经本发明的描述，通过这种方式施用本发明多肽的这些或其它方法对本领域技术人员是清楚的。例如，经基因工程操作细胞的载体可以不是逆转录病毒，而是例如腺病毒，其可以在与合适的运送载体组合后用于体内经基因工程操作细胞。
可以得自上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于反转录病毒LTR；SV40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller，等，生物技术，Vol.7，No.9,980-990(1989)描述)；或者其它任何启动子(例如真核细胞启动子，如包括但不限于组蛋白、po1 III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述，合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。
编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括，但不限于腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。
使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DNA细胞系(Miller、人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，反转录病毒质粒载体可以包囊在脂质体中，或者和脂类偶合，然后施用到宿主中。
生产细胞系产生感染性的反转录病毒载体颗粒，这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或者体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于胚干细胞、胚癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
可溶性神经肽受体多肽和结合并激活本发明的受体或者抑制其激活的化合物也可以用于与合适的药物载体组合。这种组合物包含治疗有效量的所述可溶性神经肽受体多肽或化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的组合体。配方应适合于施用模式。
本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。这种容器中可以附有管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的告示，这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品得到政府机构的同意。此外，本发明的可溶性神经肽受体多肽或化合物可以与其它治疗化合物结合使用。
所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，考虑用药途径和病症等因素，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。
本发明也涉及本发明的基因作为诊断剂的用途，例如由遗传缺陷基因引起的某些疾病的诊断剂。可以通过比较缺陷基因序列与正常基因序列来检测这些基因。接着，人们可以证实“突变”基因与异常受体活性相关。此外，人们可以在功能性测定系统(例如比色测定、在MacConkey平板上的表达、互补实验，HEK293细胞的受体缺陷株中)中将突变受体基因插入到合适的表达载体中，其作为证实或鉴别突变的另一种方法。一旦“突变”基因被鉴别出，人们就可以筛选“突变”受体基因载体群。
可以用各种技术在DNA水平上检测具有本发明的人基因突变的个体。可以从患者的细胞(包括但不限于例如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子，可以用与编码本发明多肽的核苷酸互补的PCR引物鉴别和分析其突变。例如，可以通过与正常遗传型比较的扩增产物大小上的改变来检测缺失或者插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的RNA或者放射性标记的反义DNA序列杂交鉴别。经核糖核酸酶A消化，或者从熔点温度的不同辨别完美配对的序列和错配双链体。这种诊断剂在潜在的或甚至是新生期试验中会是特别有用的。
可以通过直接DNA测序方法揭示参照基因和“突变”基因之间的序列差异性。此外，克隆的DNA区段可以用作检测特定DNA区段的探针。当与PCR组合时，这一方法的灵敏性得到极大的提高。例如，使用序列引物，其具有双链PCR产物或由修饰的PCR产生的单链模板分子。用放射标记的核苷酸经常规方法或者用荧光标记经自动测序方法完成序列测定。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。也可以由核酸酶保护测定法(如核糖核酸酶保护和S1保护)以及化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，854397-4401(1985))揭示特定位置上的序列变化。
此外，某些疾病起因于基因表达的变化或者以其为特征，这种变化可以由mRNA的变化来检测。另外，本发明的基因可以用作参照用于鉴别表达降低的与这一类型的受体相关之功能的个体。
本发明也涉及用于检测各种组织中本发明的神经肽受体多肽的可溶形式的改变的水平的诊断测定法。用于检测来源于宿主的样品中的可溶性受体多肽水平的测定法对本领域技术人员是熟知的，包括放射免疫测定、竞争-结合测定、Western印迹分析，优选地是ELISA测定。
ELISA测定起初包括制备对神经肽受体多肽抗原特异性的抗体，优选地是一种单克隆抗体。此外，制备针对所述单克隆抗体的报道抗体。所述报道抗体上连接有可检测试剂，例如放射性，荧光或在这一实例中的辣根过氧化物酶。然后，从宿主取得样品，在固体支持物上温育，所述支持物例如聚苯乙烯皿，其结合样品中的蛋白质。通过与非特异性蛋白质(例如牛血清白蛋白)一起温育覆盖皿上任何游离的蛋白质结合位点。接着温育所述的单克隆抗体，在此期间，单克隆抗体连接到任何与聚苯乙烯皿连接的神经肽受体蛋白质上。用缓冲液洗涤掉所有未结合的单克隆抗体。然后将连接到辣根过氧化物酶上的报道抗体置于皿中，使得报道抗体结合到任何与神经肽受体蛋白质连接的抗体上。洗掉未连接的抗体。将过氧化物酶底物添加到皿中。但与标准曲线比较时，在给定的时间期限内产生的颜色的量是存在于给定体积患者样品中的神经肽受体蛋白质的量。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外，现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前，仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。
简而言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选10-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用3’未翻译区域的计算机分析可以快速地选择引物，其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子，否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。
体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物，用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交，用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选，从而构建出染色体特异性的cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等，人类染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列已定位到一个准确的染色体位置，则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick，人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。
接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话，那么该突变可能是疾病的病因。
根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率，一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的致病(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。
所述的多肽、其片段或衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合，单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。
可以通过对动物直接注射多肽或者对动物(优选地是非人动物)施用多肽获得抗相应于本发明的序列的多肽产生的抗体。然后如此获得的抗体结合多肽本身。按这种方式，即使是编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合全部天然多肽的抗体。用这种抗体从表达多肽的组织中分离多肽。
对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供由传代细胞系培养物产生抗体的技术。例子包括产生人单克隆抗体的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，472)和EB病毒-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌疗法，Alan R. Liss公司，pp.77-96)。
所描述的有关单链抗体产生的技术(美国专利4,946,778)可以用来产生抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。也可以利用转基因小鼠表达抗本发明的免疫原性多肽产品的人源化抗体。
本发明将参照下面的实施例进一步加以说明；但是，应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外，所有的份或量均为重量。
为了利于理解以下的实施例，现叙述一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到，或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外，对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到，并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常把1μg的质粒或DNA片段与溶于约20μl缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50μg的DNA。针对具体的限制性酶而言，合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37℃下约1小时的温育时间，但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后，反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。
“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸，或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时，该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，出处同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。
除非另有说明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52456-457(1973)所述的方法进行转化。
实施例1
神经肽受体的细菌表达和纯化利用PCR寡核苷酸引物起始扩增编码神经肽受体的DNA序列(ATCC#-----)，所说的引物相应于加工过的神经肽受体基因的5’和3’末端序列(减信号肽序列)和所述基因的3’载体序列’。将相应于神经肽受体基因的附加核苷酸分别加入到5’和3’序列中。所说的5’寡核苷酸引物具有序列5’CACTAAAGCTTAATGGAGCCCTCAGCCACC 3′(SEQ ID NO7)，并含有HindIII限制性内切酶位点，后面接着从推测的加工蛋白质的末端氨基酸密码子开始的神经肽受体编码序列的18个核苷酸。所说的3’序列5’ACAAGTCCTTGTCCTTCTAGAGGGC 3′(SEQ ID NO8)含有XbaI位点。所说的限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth，CA)的限制性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌的复制起点(ori)、IPTG可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用Hind III和XbaI消化pQE-9。将扩增的序列连接到pQE-9中并将其插入到带有组氨酸标记编码序列和RBS的读框中。然后通过Sambrook等(分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep 4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝，这种质粒表达lacI阻遏物同时赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过转化体在LB平板上的生长能力鉴定转化体，并选择出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。通过限制分析分离并确认质粒DNA。将含有所需构建体的克隆在补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)生长。将O/N培养物以1∶100至1∶250的比率接种大体积培养物。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4和0.6之间时，加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最终浓度为1mM。IPTG通过灭活lacI阻遏物、清除P/O诱导基因增加表达。将细胞再培养3至4小时。通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解离液剂在6M盐酸胍中。澄清后，在允许含有5-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，在镍-NAT树脂上通过层析从溶液中纯化溶解的神经肽受体(Hochuli，E.等，层析学杂志411177-184(1984))。将神经肽受体蛋白质(85％纯度)以6M盐酸胍(pH值5.0)从柱中洗脱下来，为了复性，调至3M盐酸胍、100mM磷酸盐钠、10mM谷胱甘肽(还原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在这一溶液温育12小时后，将蛋白质对10mM磷酸钠透析。
实施例2在COS细胞中的表达重组神经肽受体神经肽受体-HA的质粒表达来源于载体pcDNA3/Amp(Invitrogen)，其包含1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌的复制起点)，4)CMV启动子，其后为多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整的神经肽受体前体的DNA片段和在读框中融合进3’末端的HA标记克隆到所说的载体的多接头区，由此，重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位，这一点以前已经描述过(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，细胞37767)。HA和靶细胞蛋白的融合，使带有抗体(其识别HA表位)的重组蛋白质很容易检测。
质粒构建策略描述如下用两种引物经PCR构建编码神经肽受体的DNA序列(ATCC#-----)，所说的引物是5’引物5’CCTAGGATGCCCCTCTGCTGCAGCGG 3′(SEQ ID NO9)，包含BamHI位点；3’引物5′ACAAGTCCTTGTCCTTCTGAGGGC 3′(SEQ ID NO10)包含互补于XbaI位点、翻译终止密码子和神经肽受体编码序列区的最后17个核苷酸(不包括终止密码子)的序列。由此PCR产物包含BamHI位点、编码序列、翻译终止密码子和XbaI位点。用BamHI和XbaI消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNA3/Amp并连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE(可从Stratagene克隆系统，La Jolla得到)中，将转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性克隆。从转化体中分离质粒DNA，并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组神经肽受体，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测神经肽受体HA蛋白的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体实验手册，冷泉港实验室出版，(1988))。将细胞在转染后的两天用15S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA的特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养物两者。在15％SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质沉淀。
实施例3利用杆状病毒表达系统克隆和表达神经肽受体利用PCR寡核苷酸引物扩增编码全长神经肽受体蛋白质的DNA序列(ATCC#-----)，所说引物相应于该基因的5’和3’序列
神经肽受体5’引物具有序列5′CGGGATCCGCCATCATGGAGCCCTCAGCCACC 3′(SEQ ID NO11)，包含BamHI限制位点(粗体)，接下来是类似真核细胞翻译起始有效信号(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))的6个核苷酸，其就在所述基因的头18个核苷酸之后(翻译起始密码子“ATG”有下划线)。
3’引物具有序列5′ACAAGTCCTTGTCCTTCTAGAGGGC 3’(SEQID NO12)，包含限制性内切酶XbaI的切割位点和互补于神经肽受体基因3’-非翻译序列的5个核苷酸。用市售试剂盒(“Geneclean”BIO101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的序列。然后将所说的片段用相应的核酸内切酶BamHI和XbaI消化，并如实施例1所述纯化。此片段指定为F2。
载体pA2(由pVL941载体修饰而成，见下文讨论)用于表达蛋白质，这种表达使用杆状病毒表达系统(综述参见Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)强多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶BamHI和XbaI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因作为多角体蛋白启动子以同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞-介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替A2，所说的载体如pGR1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，17031-39)。
用限制酶BamHI和XbaI消化所说的质粒，并用本领域已知的方法利用牛犊肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后如实施例1的描述从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA指定为V2。
用T4 DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化DH5α，并利用限制酶BamHI和XbaI鉴别含有具有神经肽受体基因的所说质粒(pBac神经肽受体)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。
用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，847413-7417(1987))将5μg质粒pBac神经肽受体与1.0μg市售的线性杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。
将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pBac神经肽受体在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。在添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRLl711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1毫升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。
4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑(“噬斑测定”的详尽的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。
四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于包含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。
使Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-神经肽受体感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前，将细胞进一步培养16小时，标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。
实施例4经由基因治疗的表达成纤维细胞是通过皮肤活组织检查从一个研究对象中得到的。将得到的组织放置在组织培养基上并且分割成小块。将小组织块放置在组织培养瓶的湿表面上，其中每瓶中放置约10块组织。将瓶颠倒放置，盖紧并于室温下过夜。在室温下放置24小时后反转瓶，组织块仍固定在瓶底部，加入新鲜培养基(例如含有10％FBS，青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基)，然后于37℃下温育大约1周。这时加入新鲜培养基，随后每隔几天更换一次培养基。再培养2周后，出现了一单层成纤维细胞。将单层细胞经胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和Hind III消化旁侧有Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下来用小牛肠磷酸酶进行处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分级分离并使用玻璃珠加以纯化。
采用分别与5’和3’末端序列对应的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物包含一个EcoRI位点，3’引物含有一个Hind III位点。在T4 DNA连接酶存在下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性化骨架与扩增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在适于两个片段连接的条件下保持所得到的混合物。将该连接混合物用于转化细菌HB101，然后为了证实该载体具有插入正确的感兴趣基因而将细菌涂布在含有卡那霉素的琼脂平板上。
将兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)的组织培养板上进行培养，直至达到铺满密度。然后将含有所述基因的载体加入培养基中并用该载体转导包装细胞。包装细胞随即生产含有该基因的具有感染性的病毒颗粒(现在包装细胞被称作生产细胞)。
向转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，接下来从一个铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。含有感染性病毒颗粒的培养基经微孔过滤器过滤以除去脱附(detached)的生产细胞，然后利用该培养基去感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚铺满平板中除去培养基并迅速地代之以来自于生产细胞的培养基。除去该培养基并代之以新鲜的培养基。如果病毒的滴度很高，那么实质上所有的成纤维细胞均被感染并且无需选择。如果滴度非常低，那么就需要采用具有如neo或his这样的可选择性标记的逆转录病毒。
然后将工程化的成纤维细胞注射入宿主，它或单独注射或在一个cytodex 3微载体珠上已生长至铺满之后再注射。此时成纤维细胞产生蛋白质产物。
根据以上的教导，本发明的许多改进和变化都是可能的，因此在附加的权利要求的范围内可以另外的方式实施本发明。
序列表(1)一般信息(i)申请人LI等(ii)发明名称人神经肽受体(iii)序列数12(iv)通讯地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新泽西州(E)国家美国(F)邮码07068(v)计算机可读形式(A)介质类型3.5英寸磁盘(B)计算机IBM PS/2(c)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(viii)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登记号36,134(c)案号/文档号325800-268(ix)电信信息(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1209个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCCTGGCAG CAGACAGCCG 60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC CCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC420GCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CGACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT540GCAGTCATGG AATGCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA600GTCTGTCATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC720AACCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC760CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTGCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGCA AATTCCGGGA GCAGTTTAAG GCTGCCTTCT CCTGCTGCCT GCCTGGCCTG 1140GGTCCCTGCG GCTCTCTGAA GGCCCCTAGT CCCCGCTCCT CTGCCAGCCA CAAGTCCTTG 1200TCCTTGTAG 1209(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度402个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Sar Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 100 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Ser Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Lys Phe Arg Glu Gln Phe Lys Ala Ala Phe Ser Cys365 370 375Cys Leu Pro Gly Leu Gly Pro Cys Gly Ser Leu Lys Ala Pro Ser380 385 390Pro Arg Ser Ser Ala Ser His Lys Ser Leu Ser Leu395 400(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1110个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCGTGGCAG CAGAGAGCCG60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG 120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC GCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC 180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC 240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG 300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG 360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC 420CCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CCACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG 480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT 540GCAGTCATGC AATCCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA 600CTCTGTCATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT 660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC 720AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC 780CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC 840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG 900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTCCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT 960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGCC TTCCCTGGAG TCTGCTCTAA 1110(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度369个碱基对(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Ser Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 100 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Ser Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Mat Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ila Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Leu Pro Trp Ser Leu Leu365(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度1133个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCCTGGCAG CAGAGACCCC 60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC GCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC420GCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CCACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT540GCAGTCATGG AATGCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA600GTCTGTGATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC720AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC780CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTGCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGAT GTAAAGAGAA GAGTCTAGTT CTGTCCTGAC CATCGTGCCC CGG 1133(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度377个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Sar Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Pha Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 l00 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ila Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Sar Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr TyT Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Cys Lys Glu Lys Ser Leu Val Leu Ser Pro Ser Cys365 370 375Pro Gly(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CACTAAAGCT TAATGGAGCC CTCAGCCACC 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 26(2)SEQ ID NO9的信息、(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9CCTAGGATGC CCCTCTGCTG CAGCGG 26(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征
(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 25(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO11CGGGATCCGC CATCATGGAG CCCTCAGCCA CC 32(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO12ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 2权利要求
1.一种分离的多核苷酸，这种多核苷酸包括选自如下一组的成员(a)一种多核苷酸，这种多核苷酸编码SEQ ID NO2所示的多肽；(b)一种多核苷酸，这种多核苷酸能够和(a)的多核苷酸杂交，并且和它们具有至少70％的相同性；(c)一种(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.权利要求1的多核苷酸，这种多核苷酸编码SEQ ID NO2所示的多肽。
3.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。
4.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。
5.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。
6.权利要求1的多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ ID NO1所示的1至1209位核苷酸。
7.权利要求1的多核苷酸，其编码SEQ ID NO2所示的多肽的可溶形式。
8.一种分离的多核苷酸，这种多核苷酸包括选自如下一组的成员(a)一种多核苷酸，这种多核苷酸编码一种由包含在ATCC-----号保藏物中的DNA编码的成熟多肽；(b)一种多核苷酸，这种多核苷酸编码由包含在ATCC-----号保藏物中的DNA表达的多肽；(c)一种多核苷酸，这种多核苷酸能够和(a)或(b)的多核苷酸杂交，并且和它们具有至少70％的相同性；(d)一种(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
9.权利要求8的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由包含在ATCC-----号保藏物中的DNA表达的多肽。
10.权利要求8的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由包含在ATCC-----号保藏物中的DNA表达的多肽。
11.一种载体，这种载体包含权利要求2的DNA。
12.一种用权利要求11的载体转化或转染过的宿主细胞。
13.一种生产多肽的方法，这种方法包括从权利要求12的宿主细胞表达由所说的DNA编码的多肽。
14.一种生产能够表达多肽之细胞的方法，这种方法包括用权利要求11的载体转化或转染所述细胞。
15.一种受体多肽，这种多肽选自如下一组(a)一种多肽，这种多肽具有SEQ ID NO2的推导的氨基酸序列和其片段、类似物及衍生物；和(b)一种由ATCC-----号保藏物的cDNA编码的多肽和其片段、类似物及衍生物。
16.权利要求15的多肽，其中所说的多肽具有SEQ ID NO2的推导的氨基酸序列。
17.一种权利要求15的多肽的抗体。
18.一种激活权利要求15的多肽的化合物。
19.一种抑制权利要求15的多肽的激活的化合物。
20.一种治疗需要激活神经肽受体之患者的方法，这种方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求18的化合物。
21.一种治疗需要抑制神经肽受体之患者的方法，这种方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求19的化合物。
22.权利要求20的方法，其中所说的化合物是一种多肽，并且治疗有效量的所说化合物是通过对患者提供编码所说激动剂的DNA并在体内表达所说的激动剂来施用的。
23.权利要求21的方法，其中所说的化合物是一种多肽，并且治疗有效量的所说化合物是通过对患者提供编码所说拮抗剂的DNA并在体内表达所说的拮抗剂来施用的。
24.一种鉴别结合并激活权利要求15的受体多肽之化合物的方法，该方法包括提供在其表面表达所述受体多肽的重组宿主细胞，所述受体与能够提供应答一种化合物与所说受体多肽的结合的可检测信号的第二组分相关联；在足以允许化合物与所说受体多肽结合的条件下使多种化合物与所说宿主细胞接触；和通过检测由所说第二组分产生的信号鉴别能够与受体结合的那些化合物。
25.由权利要求24的方法鉴别的激动剂化合物。
26.一种鉴别结合权利要求15的多肽并抑制其激活的化合物的方法，该方法包括提供在其表面表达所述受体多肽的重组宿主细胞，所述受体与能够提供应答一种化合物与所说受体多肽的结合的可检测信号的第二组分相关联；在足以允许结合所说受体多肽的条件下，使已知结合受体多肽的分析上可检测的配体和多种化合物与所说宿主细胞接触；和通过检测由配体与多肽相互作用产生的信号是否存在，确定所述配体是否结合到所述多肽上。
27.由权利要求26的方法鉴别的拮抗剂化合物。
28.一种测定未知能否结合到权利要求15的多肽上的配体是否可以连接到所述多肽上的方法，该方法包括在允许结合的条件下，使一种在其表面表达所述多肽的重组宿主细胞与一种待鉴别的配体接触，并检测任何结合配体的受体的存在。
29.权利要求28的方法，其中在与待鉴别的配体接触之前，从所说的细胞分离受体多肽或包含该受体的膜组分。
30.一种筛选化合物以鉴别结合权利要求15的受体多肽的那些化合物的方法，该方法包括在允许结合到受体上的条件下，使一种在其表面表达所述多肽的重组宿主细胞与许多候选化合物和已知结合所述受体的分析上可检测的配体接触；和鉴别能够增强或抑制所述配体结合到所述受体上的那些候选化合物。
31.一种由权利要求30的方法鉴别的拮抗剂或激动剂化合物。
32.一种诊断与权利要求15的多肽表达不足相关的疾病或者疾病易感性的方法，这种方法包括测定在编码所说多肽的核酸序列中的突变。
33.权利要求15的多肽，其中所说的多肽是多肽的可溶性片段，并且能够结合受体的配体。
34.一种诊断方法，该方法包括分析来源于宿主的样品中权利要求33的多肽的存在。
全文摘要
本文公开了人类神经肽受体多肽和编码这些多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术产生这些多肽的方法。本文也公开了利用这些多肽鉴别它们的拮抗剂和激动剂的方法,以及分别将这些激动剂和拮抗剂治疗性地用于治疗与所述神经肽受体多肽表达不足和过量表达相关之疾病的方法。本文还公开了用于检测所述神经肽受体核酸序列中的突变和该受体的可溶形式之改变的水平的诊断方法。
文档编号C12N15/12GK1182432SQ9519784
公开日1998年5月20日 申请日期1995年5月5日 优先权日1995年5月5日
发明者丹尼尔·R·索佩特, 李毅, 克雷格·A·罗森 申请人:人体基因组科学有限公司