专利名称：成纤维细胞生长因子15的制作方法
技术领域：
本发明涉及新近鉴别的多核苷酸、由这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途以及这些多核苷酸和多肽的生产方法。更具体地说，本发明的多肽已被推定性地鉴定为成纤维细胞生长因子/肝素结合生长因子(此后称作“FGF-15”)。本发明也涉及抑制这些多肽的作用的方法。
成纤维细胞生长因子是以结合肝素为特征(并且由此也称为肝素结合生长因子(HBGF))的一个家族。在各种组织中发现这些蛋白质的不同成员的表达，所述表达在特定时间和空间控制下。这些蛋白质是中胚层、外胚层和内胚层来源的细胞的有效的促细胞分裂剂，所述细胞包括成纤维细胞、角膜和血管内皮细胞、粒细胞、肾上腺皮质细胞、软骨细胞、成肌细胞、血管平滑肌细胞、晶状体上皮细胞、黑素细胞、角质形成细胞、少突神经胶质细胞、星形细胞、成骨细胞和生血细胞。
每种成员都具有与其它成员重叠的功能，也具有独特的功能范围。除了刺激血管内皮细胞增殖外，FGF-1和2两者都是内皮细胞趋化性的，并且FGF-2已显示出能够使内皮细胞穿透基底膜。FGF-1和2两者都具有刺激血管形成的能力。这些生长因子的另一个重要特征是它们促进伤口愈合的能力。FGF家族的许多其它成员都具有与FGF-1和2类似的活性，例如促进血管形成和伤口愈合。FGF家族的几个成员已显示出诱导中胚层形成和调节神经元细胞、脂肪细胞和骨骼肌细胞的分化。
除了在正常组织中的这些生物学活性外，已暗示FGF蛋白质通过促进肿瘤血管形成促进癌和肉瘤发生，当它们的表达失控时，其作为转化蛋白质。
FGF家族目前由8个结构相关的多肽组成碱性FGF、酸性FGF、int 2、hst1/k-FGF、FGF-5、FGF-6、角质形成细胞生长因子、AIGF(FGF-8)，神经胶质激活因子最近被查明为新的肝素结合生长因子，其是从人类神经胶质瘤细胞系培养物上清液纯化的(Miyamoto，M.等，分子和细胞生物学，13(7)4251-4259(1993))。各种多肽的基因已被克隆和测序。两个成员FGF-1和FGF-2被用许多名称表征，但最常见的是分别被称为酸性和碱性成纤维细胞生长因子。正常基因产物影响大多数中胚层和神经外胚层来源的细胞的一般的增殖能力。它们能够体内诱导血管形成，并可以在早期发育中起重要作用(Burgess，W.H.和Maciag，T.，生物化学年评，58575-606，(1989))。
FGF家族的许多以上鉴定的成员也结合到相同的受体上，并通过结合这些受体引发第二信使(message)。
编码分泌形式的FGF-1的真核表达系统已通过基因转移引入到猪动脉中。这种模型确定了在动脉壁中的基因的功能。在基因转移21天后，FGF-1的表达诱导猪动脉内膜变厚(Nabel，E.G.，等，自然，362844-6(1993))。已进一步地阐明，碱性成纤维细胞生长因子可以调节神经胶质瘤生长，并且不依赖于其在肿瘤血管形成中的作用进行，也阐明碱性成纤维细胞生长因子释放或分泌对这些作用可能是需要的(Morrison，R.S.，等，神经科学研究杂志，34502-9(1993))。
还有暗示成纤维细胞生长因子(如碱性FGF)在体外卡波济氏肉瘤细胞的生长中起作用(Huang，Y.Q.，等，J.Clin.Invest.，911191-7(1993))。编码人类碱性成纤维细胞生长因子的cDNA序列已被克隆到由噬菌体T7 RNA聚合酶识别的转录启动子下游。如此获得的碱性成纤维细胞生长因子在致有丝分裂性(mitogenicity)、血纤蛋白溶酶原激活剂合成和血管形成测定中被查明具有与人类胎盘成纤维细胞生长因子无法区别的生物学活性(Squires，C.H.，等，生物化学杂志，26316297-302(1988))。
美国专利5,155,214公开了实质上纯化的哺乳动物碱性成纤维细胞生长因子和其生产方法，公开了牛和人类碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列，以及编码牛物种多肽的DNA序列。
新发现的FGF-9具有与FGF家族其他成员约30％的序列相似性。在FGF-9序列中，两个半胱氨酸残基和该家族成员的其它共有序列得到保留。已发现FGF-9不具备酸性和碱性FGF中的那些N-末端典型的信号序列。然而，发现尽管其缺乏典型的信号序列FGF，但FGF-9在合成后从细胞分泌(Miyamoto，M.等，分子和细胞生物学，13(7)4251-4259(1993)。此外，发现FGF-9刺激少突神经胶质细胞2型星形细胞祖细胞、BALB/c3T3和PC-12细胞的细胞增殖，但不刺激人类脐静脉内皮细胞的细胞增殖(Naruo，K.，等，生物化学杂志，2682857-2864(1993)。
碱性FGF和酸性FGF是细胞增殖、细胞移动、分化和存活的有力的调节物，并作用于来源于外胚层，中胚层和内胚层的细胞类型上。这两种FGF以及KGF和AIGF经蛋白质纯化鉴别。然而，其他四个成员作为致癌基因分离，其表达限于胚发生和某些类型中。已查明FGF-9是针对神经胶质细胞的促细胞分裂剂。已报道PGF家族的成员具有瘤形成潜力。当转化进BALB/c3T3细胞中时，FGF-9已显示出转化潜力(Miyamoto，M.，等，分子和细胞生物学，13(7)4251-4259(1993)。
通过用睾酮刺激已从小鼠乳房癌细胞(SC-3)的条件培养基纯化出也被称作FGF-8的雄性激素诱导生长因子(AIGF)。AIGF是明显的类FGF-生长因子，具有推定的信号肽序列，并具有与FGF家族已知成员30-40％的同源性。用AIGF转化的哺乳动物细胞显示出在不存在雄性激素时对SC-3细胞明显的刺激作用。因此，AIGF介导SC-3细胞(可能还有其他细胞)的雄性激素诱导性生长，因为其被肿瘤细胞自身分泌。
本发明的多肽已经被推定性地鉴定为FGF家族的成员，因为其与FGF家族其它成员氨基酸序列具有同源性。
按照本发明的一个方面，本发明提供了新的成熟多肽以及其生物活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是人源的。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了编码本发明的多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其反义类似物和其生物学活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段和衍生物。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了经重组技术生产这种多肽的方法，在所说的重组技术中采用了重组载体(例如，在重组产生本发明的多肽中作为反应剂有用的克隆和表达质粒)以及含有编码本发明多肽之核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了将这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于筛选激动剂和拮抗剂以及用于治疗的方法，所述治疗方法例如，促进伤口(如烧伤和溃疡形成的)愈合、预防由于神经元紊乱引起的损伤、促进神经元生长、防止皮肤老化和头发脱落、刺激血管形成、刺激早期胚中的中胚层诱导和肢体再生。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面，其提供了本发明多肽的激动剂。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了所说的多肽的拮抗剂和将其用于抑制这些多肽的作用的方法，例如，治疗细胞转化(如，肿瘤)，降低瘢痕形成和治疗血管过多(hyper-vascular)病。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了核酸探针，这种核酸探针包含长度足以特异性地与编码本发明的多肽的多核苷酸杂交的核酸分子。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了检测与本发明的核酸序列中的突变相关的疾病或对疾病的易感性以及检测由所述序列编码的多肽的过量表达之诊断测定方法。
按照本发明的另一个方面，本发明提供了将这些多肽，或编码这些多肽的多核苷酸体外用于与科学研究、DNA合成及DNA载体的人工合成有关之目的的方法。
从本文的教导中，本领域技术人员会清楚本发明的这些和其它方面。
下列附图仅仅用来说明本发明的实施方案，而无意于用来限制本发明权利要求所包括的范围。
图1描述了FGF-15的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。
图2说明了FGF-15与FGF家族其它成员之间的氨基酸序列同源性。保守氨基酸是易于确定的。
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子(多核苷酸)，这种核酸编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或由1995年5月12日以保藏号ATCC 97146保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
编码本发明的FGF-15多肽的多核苷酸首先在来源于人肾上腺肿瘤组织的cDNA文库中发现。FGF-15多肽在结构上和成纤维细胞家族所有成员相关，其包含一个编码252个氨基酸的多肽的开放读框。最为匹配的情况是1)与FGF-9在129个氨基酸的一段序列上有41％的相同性和66％的相似性；2)与人KGF在88个氨基酸的一段序列上具有37％的相同性和59％的相似性。
在本发明的多肽中，FGF/HBGF家族的标记GXLX(S，T，A，G)X6(D，E)CXFXE(X指任何氨基酸，(D，E)指D或E残基，X6指任何6个氨基酸残基)是保守的。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1所示的编码序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的编码序列相同；由于遗传密码的丰余性或简并性，这种编码序列也可以是一种不同的编码序列，其能和图1的DNA(SEQ ID NO1)或所说保藏物的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽(SEQ ID NO2)或编码由所述所说保藏物的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括仅仅是编码成熟多肽的编码序列；编码成熟多肽的编码序列和附加的编码序列，如前导或分泌序列或蛋白原(proprotein)序列；编码成熟多肽的编码序列(和可有可无的附加的编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的非编码序列5′和/或3′。
这样，“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体，这种变体编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种多核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。
这样，本发明包括编码如图1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及编码如图1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽的片段、衍生物和类似物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体、取代变体、添加或插入变体。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一种编码序列，该序列是图1中所示的编码序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体。本领域已知等位变体是多核苷酸序列的另一种形式，其可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，而实质上不改变所编码的多肽的功能。
本发明也包括这样的多核苷酸，其中所说的成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框架中与帮助宿主细胞中表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作为分泌序列在控制多肽从细胞转运中起作用的前导序列。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以具有由宿主细胞切割形成成熟形式的多肽的前导序列。这种多核苷酸也编码蛋白原(proprotein)，这种蛋白原是添加有附加的5’氨基酸残基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一种无活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的是有活性的成熟蛋白。
这样，例如本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白或编码具有原序列的蛋白质或编码既有原序列又有前序列(presequence)(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸。在细菌宿主的情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，其用来纯化融合有标记的成熟多肽，或者例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。所说的HA标记相应于来源于流感血细胞凝集素蛋白质的一种表位(Wilson，I.，等，细胞，37767(1984))。
术语“基因”是指和产生多肽链有关的DNA区段；其包括编码区前面的区域和随后的区域(前导区和尾随序列)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
全长FGF-15基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长基因和与此基因有高度的序列类似性或类似生物活性的其它基因。这种类型的探针优选地是具有至少30个碱基，并且可以含有，例如50个或更多的碱基。所说的探针也可以用于鉴别相应于全长转录物的cDNA克隆和基因组克隆或含有包含调节和启动子区、外显子和内含子的完整FGF-15基因的克隆。筛选的实例包括通过利用已知DNA序列合成寡核苷酸探针来分离基因的编码区。具有互补于本发明的基因序列之序列的标记可以用来筛选人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库，以确定探针和哪些文库成员杂交。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(条件是两个序列之间具有至少70％，优选地具有至少90％，更优选地具有至少95％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语“严格条件”指仅在序列间具有至少95％，优选地具有至少97％的相同性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中，与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上保持与由图1的cDNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA(s)编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20个碱基，优选地是至少30个碱基，更优选地是至少50个碱基，其与本发明的多核苷酸杂交，并且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，这种多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸的探针，例如用于回收多核苷酸或者作为诊断探针或作为PCR引物。
这样，本发明涉及与编码SEQ ID NO2多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，优选地至少90％相同性并且更优选地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(这种片段具有至少30个碱基，优选地至少50个碱基)和这些多核苷酸编码的多肽。
本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保持。这些保持物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便，并不是35 U.S.C 112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考，并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾。对保藏材料的任何制造、使用或者销售需要经过许可，在此未给予任何这样的许可。
本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的FGF多肽或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的片段、类似物和衍生物。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，当有关图1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。这样，类似物包括蛋白原，这种类似物可以由蛋白原部分切除进而产生活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。
所说的图1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代(优选地是保守氨基酸残基取代)并且取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码子编码的氨基酸残基，或者(ii)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(iii)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)这样一种，其中附加氨基酸与成熟多肽融合，例如前导或分泌序列或用来纯化成熟多肽的序列或原序列。通过本文的阐述，可以认为这样的片段、衍生物以及类似物在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明优选地是提供分离形式的多肽和多核苷酸，并且优选地是将所述多肽和多核苷酸纯化成同质性的。
术语“分离的”意指所述的物质脱离了其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，其仍然是分离的，这是因为这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(特别是成熟多肽)以及和SEQ ID NO2的多肽具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更优选地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最优选地是95％的相似性(最好是90％相同性)的多肽，也包括这些多肽的部分，这种多肽的部分通常包含至少30个氨基酸，并且优选地是至少50个氨基酸。
如本领域所熟知的，两个多肽之间的“相似性”是通过比较一个多肽和另一个多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代来确定的。
本发明多肽的片段或部分通过肽合成可以用于产生相应的全长多肽；因此，此片段可以用作产生全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术生产本发明的多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程操作(转导、转化或转染)产生的，所说的载体可以是克隆载体或表达载体。该载体可以是例如，质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在改良的适于激活启动子、选择转化体或扩增本发明的基因的常规营养培养基中培养。培养条件，例如温度和pH值等，是以前用于表达选择的宿主细胞的那些，对普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可以用来经重组技术生产多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV 40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)组合衍生的载体。然而，任何其它载体也可以使用，只要其在宿主中可复制和稳定。
可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。
在表达载体中的所说的DNA序列是可操作地连接到适当的指导mRNA合成表达控制序列(启动子)上的。这样的启动子的代表性例子可以提到的是LTR或SV 40启动子，大肠杆菌的lac或trp、噬菌体λPL启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或者控制序列的载体可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的阐述，对适当的宿主的选择在本领域技术人员的知识范围之内。
更具体地说，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒的载体，该载体已正向或反向插入了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下，构建体还包含可操作连接到所述序列上的调节序列，包括，例如，启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体细菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)、pTRC99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharrmaca)；真核pWLneo、pSV2cat、pOG44、pxT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它质粒或载体都可以使用，只要它们在宿主中可复制和稳定。
可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。对适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或者宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法，(1986))。
宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式生产由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成仪合成产生。
成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。采用来源于本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来生产这种蛋白质。Sambrook等，分子克隆实验室手册，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
编码本发明的多肽的DNA在高等真核生物的转录被插入到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点晚期侧100至270bp上的SV 40增强子、细胞肥大病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧上的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。
一般来说，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如，大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列以合适的方式(phase)与翻译起始和终止序列装配，优选地，与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白，这种蛋白质包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽，所需特征例如，表达的重组产物稳定或简化纯化步骤。
通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列及合适的翻译起始和终止信号以可操作阅读方式(reading phase)与具有功能性启动子一起插入来构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以在宿主来保证保持载体和需要时提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种(虽然其它的也可以选择来使用)。
作为一个代表性的但不是限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。
在合适的宿主菌株转化和宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。
典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保持所形成的粗产物用于进一步的纯化。
可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman(细胞，23175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。
本发明的多肽可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换层析、磷纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)作为最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸残基。
由于具有刺激血管内皮细胞生长的能力，本发明的多肽可以用于刺激各种疾病(如血栓形成，动脉硬化和其它心血管疾病)引起的局部缺血组织血管再形成(revascularization)的治疗。这些多肽也可以用于刺激血管形成和肢体再生。
所述多肽也可以用于治疗损伤伤口、烧伤、手术后组织修复和溃疡，因为它们对不同来源的各种细胞(如成纤维细胞和骨骼肌细胞)是促有丝分裂的。并且因此促进损伤或患病组织的修复或替代。
本发明的多肽也可以用于刺激神经元生长，用于治疗和预防在某些神经元紊乱或神经衰弱病(阿耳茨海默氏病、帕金森氏病和AIDS-相关综合症)中出现的神经元损伤。FGF-15具有刺激软骨细胞生长的能力，因此，它们可以用于增强骨和牙周再生以及帮助组织移植和骨移植。
本发明的多肽也可以通过刺激角质形成细胞的生长预防由晒伤引起的皮肤老化。
FGF-15多肽也可以用于预防脱发，因为FGF家族成员激活毛发生成细胞，并促进黑素细胞生长。同时，本发明的多肽在与其它细胞因子组合使用时，也可以用于刺激生血细胞和骨髓细胞的生长和分化。
FGF-15多肽也可以用于在移植之前保持器官或者支持初生组织的细胞培养物。
本发明的多肽也可以用于在早期胚中诱导中胚层来源的组织分化。
按照本发明的另一方面，本发明提供了为了科研、DNA合成，DNA载体制备相关的体外目的和提供人类疾病之诊断剂和治疗剂相关的目的利用这种多肽或编码这些多肽的多核苷酸的方法。
本发明提供了鉴别本发明的多肽之受体的方法。可以用许多本领域技术人员已知的方法鉴别编码所说受体的基因。所述方法如配体淘选和FACS分选(Coligan等，免疫学当代方案，1(2)，第5章，(1991))。优选地，使用表达克隆，其中从对所述多肽反应性的细胞(例如，已知含有FGF家族蛋白质的若干受体的NIH3T3细胞和SC-3细胞)制备多聚腺苷酸RNA，将从这一RNA产生的cDNA文库分成多个集合体，用于转染COS细胞或对所述多肽非反应性的其它细胞。使生长在载玻片上的转染细胞与标记的本发明的多肽接触，所述多肽可以由多种方法(包括碘化或引入位点特异性蛋白质激酶识别位点)标记。
在固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性集合体，通过重复亚集合和再筛选方法制备和再转染亚集合体，最终产生编码推定的受体的单克隆。
受体鉴别的另一种方法是可以将标记的多肽与表达受体分子的细胞膜和抽提物光亲和连接，经PAGE分离交联材料，并对X-光胶片曝光。可以切下包含所述多肽受体的标记复合物，分离成肽片段进行蛋白质微测序。从微测序获得的氨基酸序列用于设计一套筛选cDNA文库的简并寡核苷酸探针，以鉴别编码推定的受体的基因。
本发明提供了筛选化合物以鉴别调节本发明多肽的作用的化合物的方法。这种检测的一个例子包括在成纤维细胞正常增殖的条件下将哺乳动物成纤维细胞、本发明的多肽，待筛选的化合物和3[H]胸苷混合。可以在不存在待筛选化合物下进行对照测定，并将其与存在所述化合物时的成纤维细胞增殖的量比较，从而通过测定每种情况下3[H]胸苷的摄入确定所述化合物是否刺激增殖。通过测定3[H]胸苷掺入的液体闪烁计数测定成纤维细胞增殖的量。激动剂和拮抗剂化合物两者均可以通过这一方法鉴别。
在另一种方法中，将哺乳动物细胞或者表达本发明的多肽之受体的膜制剂在所述化合物存在下与本发明的标记的多肽一起培养。然后测定所述化合物增强或阻断这一相互作用的能力。或者，测定在待筛选的化合物与FGF-15受体相互作用后的已知第二信使系统的反应，并测定所述化合物结合受体和引发第二信使反应的能力，以确定所述化合物是否是潜在的激动剂或拮抗剂。这种第二信使系统包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或者磷酸肌醇水解作用。
拮抗剂化合物的例子包括抗体，或者在某些情况下包括寡核苷酸，其结合本发明的多肽的受体，但不引发第二信使反应或者它们结合FGF-15多肽本身。此外，潜在的拮抗剂可以是所述多肽的突变形式，其结合所述受体但不引发第二信使反应，因此，所述多肽的作用被有效地阻断。
另一种FGF-15基因和基因产物的拮抗剂化合物是采用反义技术制备的反义构建体。反义技术可以通过三螺旋形成或反义DNA或者RNA来控制基因的表达，这两种方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的结合。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用来设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。一种DNA寡核苷酸被设计成与转录所涉及的基因区互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科学，241456，(1988)；和Dervan等，科学，2511360(1991))，进而阻止本发明多肽的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内和mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译成为本发明的多肽(反义-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以传送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA和DNA，抑制本发明多肽的产生。
潜在的拮抗剂化合物也包括小分子，这些小分子结合到受体的结合位点上并占据该位点，使得受体不能接近其多肽，由此阻止正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
拮抗剂化合物也可以用于在肿瘤细胞和组织上抑制本发明多肽的细胞生长和增殖作用(即肿瘤血管发生的刺激作用)，并且因此在例如肿瘤形成和生长中延迟或阻止异常细胞生长和增殖。
所述拮抗剂也可以用于预防血管过多病和在囊外白内障手术后预防上皮晶状体细胞增殖。在例如气囊血管成形术后的再狭窄的情况下，阻断本发明的多肽的致有丝分裂活性也可能是所需的。
所述拮抗剂也可以用于在伤口愈合期间阻止瘢痕组织生长。
所述拮抗剂可以与如下所述的药学上可接受的载体一起用于组合物中。
本发明的多肽、激动剂和拮抗剂可以与合适的药物载体组合使用，以构成供肠胃外施用的药物组合物，这样的组合物包含治疗有效量的所说多肽，激动剂或拮抗剂和药学上可接受的载体或者赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它们的组合物。其配方应该适宜于施用的方式。
本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。这种容器中可以附有管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的告示，这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品得到政府机构的同意。此外，本发明的多肽、激动剂和拮抗剂可以与其它治疗化合物结合使用。
所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，考虑用药途径和病症等因素，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。在局部施用的特定情况下，优选地以从约0.1μg到9mg/cm2的剂量施用。
本发明的多肽和多肽形式的激动剂和拮抗剂，可以依据本发明通过体内表达这样的多肽来利用，这常被称作“基因治疗”。
这样，例如，可以体外对细胞用编码多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)进行基因工程操作，用工程细胞向被治疗的患者提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的，并且由本文的描述也显而易见。例如，可以用本领域公知的方法用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。
同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。如本领域已知的，产生包含编码本发明的多肽之RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞可以施用到患者以便体内经基因工程操作细胞并体内表达所说的多肽。经本发明的描述，通过这种方式施用本发明多肽的这些或其它方法对本领域技术人员是清楚的。例如，经基因工程操作细胞的载体可以不是逆转录病毒颗粒，而是如腺病毒，其可以在与合适的运送载体组合后用于体内经基因工程操作细胞。
可以衍生上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于反转录病毒LTR；SV 40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller，等，生物技术，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或者其它任何启动子(例如真核细胞启动子，如包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述，合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。
编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括，但不限于腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。
使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DNA细胞系(Miller、人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，反转录病毒质粒载体可以包在脂质体中，或者和脂类偶联，然后施用到宿主中。
生产细胞系产生感染性的反转录病毒载体颗粒，这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或者体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于胚干细胞、胚癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
本发明也涉及本发明的基因作为诊断测定的一部分的用途，用以检测与编码本发明的多肽的核酸序列中的突变相关的疾病或疾病易感性。
可以用各种技术在DNA水平上检测具有本发明的基因突变的个体。可以从患者的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子，可以用与编码本发明多肽的核酸互补的PCR引物鉴别和分析其突变。例如，可以通过与正常遗传型比较的扩增产物大小上的改变来检测缺失或者插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的RNA或者放射性标记的反义DNA序列杂交鉴别。经核糖核酸酶A消化，或者从熔点温度的不同辨别完全配对的序列和错配双链体。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区别，其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的熔点或部分融化温度而停滞在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers等，科学，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化，所述测定法如核糖核酸酶保护和S1保护以及化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，854397-4401(1985))。
这样，可以由以下方法检测特定DNA序列，所述方法例如杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶(例如，限制片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法。
除很多常规凝胶电泳和DNA测序法之外，也可用原位分析检测突变。
因为相对于正常对照组织样品所说的蛋白的过量表达可以检测异常细胞增殖如肿瘤的存在，所以，本发明也涉及用于检测各种组织中FGF-15蛋白之改变的水平的诊断分析方法。用于检测得自宿主的样品中本发明蛋白水平的分析方法对本领域的技术人员是公知的，所说的方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析，ELISA测定和“夹心”测定。ELISA测定(Coligan，et al，Current Protocols in Immunology，1(2)，Chapter 6，(1991))最初包括制备本发明多肽之抗原的特异性抗体，优选地是单克隆抗体。此外，制备单克隆抗体的报道抗体。将可检测的试剂和报道抗体结合，所说的试剂如放射性、荧光或者在这一实例中是辣根过氧化物酶。由宿主获得样品，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如牛血清清蛋白)一起温育，将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来将单克隆抗体在皿中温育，在此期间单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上的本发明任何多肽结合。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的报道抗体放入皿中，结果导致报道抗体和任何结合到感兴趣的蛋白的单克隆抗体结合。
然后将未结合的报道抗体洗掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在的本发明的多肽的量。
也可以使用竞争测定，其中将对本发明的多肽特异性的抗体连接到固体支持物上，使标记的FGF-15和来源于宿主的样品通过固体支持物，经例如液体闪烁计数检测的标记的量可以与样品中本发明的多肽的量相关联。
“夹心’测定类似于ELISA测定。在“夹心”测定中，将本发明的多肽通过固体支持物并连接到结合在固体支持物上的抗体上。然后将第二抗体连接到兴趣多肽上。使标记的并且对第二抗体特异性的第三抗体通过固体支持物并连接到第二抗体上，可以定量结合的量。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外，现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前，仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。
简而言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用3’未翻译区域的计算机分析可以快速地选择引物，其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子，否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。
体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物，用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交，用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选，从而构建出染色体特异性的cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等，人类染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列已定位到一个准确的染色体位置，则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick，人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。
接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话，那么该突变可能是疾病的病因。
根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率，一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的致病(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。
所述的多肽、其片段或衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合，单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。
针对相应于本发明的序列的多肽而产生的抗体可以通过将该多肽直接注射入动物体内或者通过将该多肽向动物给药来得到，其中的动物优选非人类。然后，如此得到的抗体会结合到该多肽上。通过这种方式，即使是仅仅编码该多肽的一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后，该抗体可以用于从表达该多肽的组织中分离这种多肽。
为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler与Milstein，1975，自然，256495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，472)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体与癌症治疗，Alan R. Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以将用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)进行修改从而生产针对本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。也可以使用转基因小鼠来表达针对本发明免疫原性多肽产物的人源化抗体。
本发明将参照下面的实施例进一步加以说明；但是，应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外，所有的份或量均为重量。
为了利于理解以下的实施例，现叙述一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到，或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外，对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到，并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常把1μg的质粒或DNA片段与溶于约20μl缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50μg的DNA。针对具体的限制性酶而言，合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37℃下约1小时的温育时间，但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后，反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。
“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸，或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时，该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，出处同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。
除非另有说明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52456-457(1973)所述的方法进行转化。
实施例1细菌表达和纯化FGF-15利用PCR寡核苷酸引物起始扩增编码FGF-15的DNA序列(ATCC#97146)，所说的引物相当于加工过的FGF-15蛋白质的5’序列(减信号肽序列)和FGF-15基因的3’载体序列。将相应于FGF-15基因的附加核苷酸加入到5’和3’序列中。所说的5’寡核苷酸引物具有序列5’GCCAGACCATGGTAAAACCGGTGCCCCTC3′(SEQ IDNO3)，并含有NcoI限制性内切酶位点(粗体)。所说的3’序列5’GGCAGGAGATCTTGTTGTCTTACTCTTGTTGAC 3′(SEQ ID NO4)含有和BglII位点(粗体)互补的序列，并接着FGF-15编码序列的21个核苷酸。
所说的限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-60(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)的限制性内切酶位点。pQE-60编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG可调节启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用NcoI和BglII消化pQE-60。将扩增的序列连接到pQE-60中并将其插入到带有组氨酸标记编码序列和核糖体结合位点(RBS)的读框中。然后通过Sambrook等(分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝，这种质粒表达lacI阻遏物同时赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过转化体在LB平板上的生长能力鉴定转化体，并选择出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。通过限制分析分离并确认质粒DNA。将含有所需构建体的克隆在补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)培养。将O/N培养物以1∶100至1∶250的比率用于接种大体积培养物。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4和0.6之间时，加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最终浓度为1mM。IPTG通过失活lacI阻遏物，清除P/O，引起基因表达的增加。将细胞再培养3至4小时。通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解在6M盐酸胍离液剂中。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，在镍-螯合物柱中通过层析从溶液中纯化溶解的FGF-15(Hochuli，E.等，色谱学杂志411177-184(1984))。将FGF-15蛋白质以6M盐酸胍(pH值5.0)从柱中洗脱下来，为了复性，调至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在这一溶液温育12小时后，将蛋白质对10mM磷酸钠透析。
实施例2利用杆状病毒表达系统克隆和表达FGF-15利用PCR寡核苷酸引物扩增编码全长FGF-15蛋白质的DNA序列(ATCC#97146)，所说引物相应于该基因的5’和3’序列
FGF-155’引物具有序列5′CTAGTGGATCCGCCATCATGGTAAAACCGGTGCCC3′(SEQ ID NO5)，包含BamHI限制位点(粗体)，接下来是类似真核细胞翻译起始有效信号(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))的4个核苷酸，其就在所述基因的头18个核苷酸之后(翻译起始密码子“ATG”有下划线)。
3’引物具有序列5′CGACTGGTACCAGCCACGGAGCAGGAATGTCT3’(SEQ ID NO6)，包含限制性内切酶Asp718的切割位点(粗体)和互补于基因3’-非翻译序列的21个核苷酸。
用市售试剂盒(“Geneclean”BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的序列。然后将所说的片段用相应的核酸内切酶消化，并在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。此片段指定为F2。
载体pA2(由pVL941载体修饰而成，见下文讨论)用于表达蛋白质，这种表达使用杆状病毒表达系统(综述参见Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)强多角体蛋白启动子，其后面是限制性核酸内切酶BamHI和XbaI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因作为多角体蛋白启动子以同样的方向插入，其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞-介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替A2，所说的载体如pRG1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒学，17031-39)。
用限制酶消化所说的质粒，并用本领域已知的方法利用牛犊肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后用市售试剂盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA指定为V2。
用T4 DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌DH5α细胞(Stratagene克隆系统，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)并利用限制酶鉴别含有所说质粒(pBacFGF-15)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。
用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，847413-7417(1987))将5μg质粒pBacFGF-15与1.0μg市售的线性杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。
将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg所述质粒在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。然后添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s培养基，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1毫升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。
4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑(“噬斑测定”的详尽的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。
四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。
使Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-FGF-15感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。将细胞进一步培养16小时，然后离心收获。标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。
实施例4在COS细胞中表达重组FGF-15表达质粒FGF-15-HA来源于载体pcDNA3/Amp(Invitrogen)，后者包含1)SV 40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌的复制起点，4)CMV启动子，其后为多接头区、SV 40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整FGF-15前体的DNA片段和在读框中融合进3’末端的HA标记克隆到所说的载体的多接头区，由此，重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位，这一点以前已经描述过(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，细胞37767，(1984))。HA和靶细胞蛋白的融合，使得用识别HA表位的抗体很容易检测重组蛋白质。
质粒构建策略描述如下用两种引物经PCR构建编码FGF-15的DNA序列(ATCC#97146)，所说的引物是5’引物5’CTAGTGGATCCGCCATCATGGTAAAACCGGTGCCC3′(SEQ ID NO7)，包含一BamHI位点，之后是由起始密码子开始的编码序列的18个核苷酸；3’引物5′GTCGACCTCGAGTGTGTGCTTACTCTTGTT3′(SEQ ID NO8)包含互补于XhoI位点、翻译终止密码子、HA标记和FGF-15编码序列的最后18个核苷酸(不包括终止密码子)的序列。由此PCR产物包含一BamHI克隆位点、后接有融合进读框的HA标记的编码序列、接着HA标记的翻译终止密码子和一XhoI位点。
用相应的限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNA3/Amp并连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(可从Stratagene克隆系统，La Jolla，CA 92037得到)，将转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性克隆。从转化体中分离质粒DNA，并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组FGF-15，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测FGF-15-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体实验手册，冷泉港实验室出版，(1988))。将细胞在转染后的两天用15S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％ NP-40，0.1％ SDS，1％ NP-40，0.5％ DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养物两者。在15％SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质沉淀。
在以上所述的教导下，本发明的许多改良和变化是可能的，因此，在附属权利要求的范围内，可以以不同于以上特定描述的方式实施本发明。
序列表(1)一般信息(i)申请人GREENE，ET AL.(ii)发明名称成纤维细胞生长因子-15(iii)序列数8(iv)通讯地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新泽西州(E)国家美国(F)ZIP07068(v)计算机可读形式(A)介质类型3.5英寸磁盘(B)计算机IBM PS/2(c)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(Vi)当前申请的数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(Vii)在先申请的数据(A)申请号08/207,412(B)申请日1994年3月8日(viii)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36，134(c)卷号/文档号325800-364(ix)电信信息(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744(2)SEQ ID N01的信息(i)序列特征(A)长度680个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度225个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的成员(a)一种多核苷酸，这种多核苷酸编码图1所示的多肽；(b)一种多核苷酸，这种多核苷酸能够和(a)的多核苷酸杂交，并且和它们具有至少70％的相同性；(c)一种(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.权利要求1的多核苷酸，这种多核苷酸编码包含SEQ ID NO2所示的1至252位氨基酸之多肽。
3.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。
4.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。
5.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。
6.权利要求1的多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ ID NO1所示的1至759位核苷酸。
7.一种分离的多核苷酸，这种多核苷酸包括选自如下一组的成员(a)一种多核苷酸，这种多核苷酸编码一种由包含在ATCC 97146号保藏物中的DNA编码的成熟多肽；(b)一种多核苷酸，这种多核苷酸编码由包含在ATCC 97146号保藏物中的DNA表达的多肽；(c)一种多核苷酸，这种多核苷酸能够和(a)或(b)的多核苷酸杂交，并且和它们具有至少70％的相同性；(d)一种(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
8.权利要求7的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由包含在ATCC 97146号保藏物中的DNA表达的多肽。
9.权利要求7的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由包含在ATCC 97146号保藏物中的DNA表达的多肽。
10.权利要求7的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由包含在ATCC 97146号保藏物中的DNA表达的多肽。
11.一种载体，这种载体包含权利要求2的DNA。
12.一种用权利要求11的载体经基因工程操作得到的宿主细胞。
13.一种生产多肽的方法，这种方法包括从权利要求12的宿主细胞表达由所说的DNA编码的多肽。
14.一种生产能够表达多肽之细胞的方法，这种方法包括用权利要求11的载体对细胞进行基因工程操作。
15.一种多肽，这种多肽选自如下一组(i)一种具有图1的推导的氨基酸序列的多肽和其片段、类似物及衍生物；和(ii)一种由ATCC 97146号保藏物的cDNA编码的多肽和其片段、类似物及衍生物。
16.权利要求15的多肽，其中所说的多肽具有图1的推导的氨基酸序列。
17.一种权利要求15之多肽的抗体。
18.一种抑制权利要求15的多肽的化合物。
19.一种激活权利要求15的多肽的受体的化合物。
20.一种治疗需要FGF-15之患者的方法，这种方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求15的多肽。
21.一种治疗需要抑制FGF-15之患者的方法，这种方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求18的化合物。
22.权利要求20的方法，其中所说的治疗有效量的所说多肽是通过对患者提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽来施用的。
23.权利要求21的方法，其中所说的化合物是一种多肽，且治疗有效量的所说化合物是通过对患者提供编码所说拮抗剂的DNA并在体内表达所说的拮抗剂来施用的。
24.一种鉴定作为权利要求15的多肽的激动剂有活性的化合物的方法，该方法包括(a)使待筛选的化合物和包含细胞的反应混合物在所说细胞受所说多肽正常刺激的条件下混合，所说混合物含有在细胞增殖时掺入到细胞中的标记；和(b)测定所说细胞的增殖程度，以便鉴定此化合物是否是有效的激动剂。
25.一种鉴定作为权利要求15的多肽的拮抗剂有活性的化合物的方法，该方法包括(a)使待筛选的化合物、所说多肽和包含细胞的反应混合物在所说细胞受所说多肽正常刺激的条件下混合，所说混合物含有在细胞增殖时掺入到细胞中的标记；和(b)测定所说细胞的增殖程度，以便鉴定此化合物是否是有效的拮抗剂。
26.一种诊断与权利要求15的多肽表达不足相关的疾病或者疾病易感性的方法，这种方法包括测定在编码所说多肽的核酸序列中的突变。
27.一种诊断方法，这种方法包括分析来源于宿主细胞的样品中是否存在权利要求15的多肽。
全文摘要
本文公开了一种人类成纤维细胞生长因子－15多肽和编码这种多肽的DNA(RNA)。本文也公开了通过重组技术生产这种多肽的方法。本文也公开了利用这种多肽刺激血管再形成、治疗伤口和预防神经元损伤的方法。本文还公开了这样的多肽的拮抗剂和它们作为预防异常细胞增殖、血管过多病和上皮晶状体细胞增殖之治疗剂的用途,本文还公开了用于检测编码序列中的突变和得自宿主的样品中的多肽浓度的改变的诊断方法。
文档编号C12N15/16GK1183804SQ95197842
公开日1998年6月3日 申请日期1995年6月5日 优先权日1995年6月5日
发明者约翰·M·格林, 克雷格·A·罗森 申请人:人体基因组科学有限公司