专利名称：：生产核苷－5’－磷酸酯的方法
技术领域：
：本发明涉及核苷-5’-磷酸酯的生产方法。本发明也涉及新的酸性磷酸酶、编码该酸性磷酸酶的基因、含有该基因的重组DNA，涉及包含该重组DNA、可用来生产核苷-5’-磷酸酯的微生物。核苷-5’-磷酸酯可用作调味品、药物和生产这类物质的原料。通过使用以下磷酸基团供体，用生化方法将核苷磷酸化，生产核苷-5’-磷酸酯的方法是已知，包括使用对硝基苯磷酸的方法(日本专利公告39-29858)、使用无机磷酸的方法(日本专利公告42-1186)、使用多磷酸的方法(日本专利公开53-56390)、使用乙酰磷酸的方法(日本专利公开56-82098)和使用三磷酸腺苷(ATP)的方法(日本专利公开63-230094)。然而，因为这些方法使用的底物昂贵或在反应中产生副产物，所以在高效并便宜地生产核苷-5’-磷酸酯方面不能令人满意。因此，本发明人研制出一种方法，通过让特定的微生物细胞在酸性条件下作用于核苷和磷酸基团供体(选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)，高效地生产核苷-5’-磷酸酯，而不产生2’-、3’-核苷异构体副产物(日本专利公开7-231793)。然而，甚至该方法也有以下缺点。即例如，在反应期间由于在所用微生物细胞中不幸地微量存在降解核苷的活性，一部分底物被降解。而且，如果继续反应，那么产生并积累的核苷-5’-磷酸酯被降解。因此，在反应溶液中产生副产物，已不可能获得足够的产量。此外，因为每个微生物细胞的转磷酸活性低，如果加入高浓度的底物，那么反应不能进行。本发明的目的是提供便宜并有效地生产核苷-5’-磷酸酯的方法，本发明的另一目的是提供一种酶、一个编码该酶的基因、含有该基因的重组DNA以及含有该重组DNA、可用于生产核苷-5’-磷酸酯的微生物。本发明人进行了各种研究，以便研制出比常规方法更有效地生产核苷-5’-磷酸酯的方法，结果发现，通过让从微生物无细胞提取物中纯化的酸性磷酸酶在pH3.0-5.5的条件下，作用于核苷和磷酸基团供体(选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)，可以有效高产地生产核苷-5’-磷酸酯。另外，本发明人已成功地从不同的细菌中获得编码酸性磷酸酶的野生型基因，并通过在得自埃希氏杆菌细菌的腹性磷酸酶上导入一个突变，成功地获得在野生型酸性磷酸酶具有更多核苷菌亲和力的酸性磷酸酶的编码基因。而且，本发明人发现，通过按照遗传工程技术大量表达该基因，大大提高了核苷-5’-磷酸酯的生产率。本发明人还尝试制备温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶，目的是用酸性磷酸酶在较高温度下进行磷酸转移反应，使得核苷-5’-磷酸酯的生产效率更高，因为反应速度提高，并且在反应溶液中的磷酸酯受体浓度更高。然后，本发明人成功地制备了比实施例19中描述的突变型酸性磷酸酶温度稳定性更高的突变型酸性磷酸酶，并可以在高温下用于反应中，因此完成了本发明。即本发明提供生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以下步骤让对核苷具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的酸性磷酸酶，在pH3.0-5.5的条件下作用于核苷和磷酸基团供体(最好选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)，生产并收集核苷-5’-磷酸酯。另一方面，本发明提供生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以下步骤让微生物在pH3.0-5.5的条件下，作用于核苷和磷酸基团供体，生产并收集核苷-5’-磷酸酯；其中微生物用包含对核苷-5’-磷酸酯具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的酸性磷酸酶的编码基因的重组DNA转化。另一方面，本发明提供对核苷具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶、编码这些酸性磷酸酶的基因、含有这些基因的重组DNA和包含重组DNA的微生物。<1>酸性磷酸酶的制备用于本发明的酸性磷酸酶不特别限制，只要它在pH3.0-5.5的条件下，通过将磷酸基团从磷酸基团供体(例如选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)转移到核苷催化产生核苷-5’-磷酸酯的反应即可。这种酸性磷酸酶最好包括得自微生物的那些酸性磷酸酶。在特别推荐的实施方案中，本发明使用得自属于摩根氏菌属、埃希氏杆菌属、普罗威登斯菌属、肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属或沙雷氏菌属细菌的一种酶。这种细菌的代表实例包括以下细菌菌株。摩氏摩根氏菌NCIMB10466摩氏摩根氏菌IFO3168摩氏摩根氏菌IFO3848EsherichiablattaeJCM1650EsherichiablattaeATCC33429EsherichiablattaeATCC33430斯托氏普罗威登斯菌ATCC29851斯托氏普罗威登斯菌ATCC33672产气肠杆菌IFO12010产气肠杆菌IFO13534KlebsiellaplanticolaIFO14939KlebsiellaplanticolaIAM1133SerratiaficariaIAM13540粘质沙雷氏菌IAM12143我们注意到，酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)最初为在酸性条件下催化水解磷酸酯反应的酶，它具有降解通过转磷酸反应生成的核苷-5’-磷酸酯的核苷酸酶活性(在下文，核苷酸酶活性称为“磷酸单酯酶活性”)。甚至这样一种酸性磷酸酶也可以用于本发明生产核苷-5’-磷酸酯的方法中。然而，为了高产地获得核苷-5’-磷酸酯，需要使用突变型酸性磷酸酶，与用上述细菌生产的野生型酸性磷酸酶相比，它在将向核苷的转磷酸反应中对核苷的亲和性提高(必要时，下文简称为“突变型酸性磷酸酶”)。最好使用Km值低于100mM的突变型酸性磷酸酶。通过表达直接突变编码下述酸性磷酸酶的基因获得的突变型基因获得突变型酸性磷酸酶。或者，用紫外光辐射或通常用于人工诱变的突变剂(诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等)，处理产生对核苷具有较高亲和性酸性磷酸酶的微生物，然后培养突变的微生物，产生对核苷具有较高亲和性的突变型酸性磷酸酶，也可以获得突变型酸性磷酸酶。具有酸性磷酸酶活性的蛋白质可以从上述微生物中获得，即通过在适当的培养基中培养具有该活性的微生物菌株，收获增殖的微生物细胞，破碎这些微生物细胞以制备无细胞提取物，然后适当地从中纯化该蛋白质。培养微生物的培养基不受特别限制，为此可以获得含有一般碳源、氮源、无机离子和可选的有机营养物源的普通培养基。适当使用的碳源包括例如诸如葡萄糖和蔗糖等的糖类、诸如甘油等的醇类化合物和有机酸。所用的氮源包括例如氨气、氨水和铵盐。必要时适当使用的无机离子包括例如镁离子、磷离子、钾离子、铁离子和锰离子。适当使用的有机营养物源包括例如维生素和氨基酸以及含有它们的那些营养物源，诸如酵母膏、胨、肉膏、玉米浆、水解酪蛋白和大豆水解物等。培养条件也不特别限制。微生物例如可以在需氧条件下培养大约12-48小时，同时将pH和温度适当地控制在pH5-8和25-40℃的范围内。可以例如通过离心，从培养液中收获增殖的微生物细胞。用常规方法，从收获的微生物细胞中制备无细胞提取物。即用诸如超声处理、Dyno-mill和FrenchPress等方法破碎微生物细胞，然后通过离心除去细胞碎片，获得无细胞提取物。用通常用于酶纯化的适当技术组合(诸如硫酸铵分级分离、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤层析和等电纯化等)，从无细胞提取物中纯化酸性磷酸酶。关于沉淀，不需要必需完全纯化酸性磷酸酶。做到除去诸如参加降解核苷底物的酶等污染物就足够了。<2>酸性磷酸酶基因的制备含有编码具有酸性磷酸酶活性的蛋白质结构基因的DNA片断，可以从例如具有该酶活性的微生物细胞中开始克隆。克隆方法包括例如用止该酶活性作为指标筛选染色体基因表达文库的方法、制备该蛋白质的抗体以筛选染色体基因表达文库的方法、以及分析氨基酸序列(诸如该纯化蛋白质的N-末端序列等)，并在此基础上制备探针以筛选基因文库的方法。具体地说，上述摩氏摩根氏菌、Esherichiablattae、斯托氏普罗威登斯菌、产气肠杆菌、Klebsiellaplanticola、Klebsiellaplanticola、Serratiaficaria或粘质沙雷氏菌的酸性磷酸酶的编码基因的克隆，可以通过制备每种微生物的染色体基因表达文库，并用磷酸酶活性作为指标筛选该文库来进行。即可以如下制备染色体基因表达文库首先制备摩氏摩根氏菌或Esherichiablattae的染色体DNA，用适当的限制性内切酶部分降解该DNA，随后将其与能在大肠杆菌中自主复制的载体连接，用获得的重组DNA转化大肠杆菌。可以使用多种限制性内切酶降解染色体DNA，通过调整降解反应的时间调整降解程度。可以使用任何载体克隆该基因，只要它能在大肠杆菌中自主复制即可。可以使用例如pUC19、pUC118、pHSG298、pBR322和pBluescriptII。载体可以与含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断连接以制备重组DNA，即预先用与降解染色体DNA使用的相同的限制性内切酶或用产生的剪切末端与染色体DNA片断剪切末端互补的限制性内切酶降解载体，然后用诸如T4DNA连接酶等连接酶，将其与DNA片断连接。任何微生物菌株都可以用作制备的重组DNA的受体，只要它适于载体的复制即可。可以使用例如诸如HB101、JM109和DH5等大肠杆菌的微生物菌株。由此获得的转化体在琼脂培养基上生长，形成菌落。此后，将含有对硝基苯磷酸的反应溶液倒到培养基表面上，进行反应，然后表达磷酸酶活性的菌株释放对硝基酚，并表现出黄色。包含含目的酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的转化体可以如下筛选通过在酸性条件下进行上述反应，用颜色变化作为指标筛选转化体。此后，从筛选的转化体回收重组DNA，分析含与载体连接的酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的结构。关于酸性磷酸酶编码基因的核苷酸顺序，得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466的基因示于顺序表的SEQIDNO2中，得自EsherichiablattaeJCM1650的基因示于顺序表的SEQIDNO6中，得自斯托氏普罗威登斯菌ATCC29851的基因示于顺序表的SEQIDNO21中，得自产气肠杆菌IFO12010的基因示于顺序表的SEQIDNO23中，得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的基因示于顺序表的SEQIDNO25中，得自SerrtiaficariaIAM13540的基因示于顺序表的SEQIDNO27中。得出的由上述基因编码的酸生磷酸酶的氨基酸序列在SEQIDNO4、8、22、24、26和28中进行了描述。本发明最好使用由上述基因编码的酸性磷酸酶。另外，本发明也最好使用包含的氨基酸顺序与上述基因编码的酸性磷酸酶中任一种的氨基酸顺序基本相同的酸性磷酸酶。“基本相同”是指酸性磷酸酶的氨基酸序列可以替代、缺失、插入或转换一个或多个氨基酸残基，而不损失产生核苷-5’-磷酸酯的活性(下文称为“转磷酸活性”)<3>突变型酸性磷酸酶编码基因的制备按上述方法获得的野生型酸性磷酸酶具有磷酸单酯酶活性。因此，磷酸单酯酶活性可能作为核苷-5’-磷酸酯生产中，随着时间的推移造成产物的伴随性降解的因素致使反应产率降低。为了克服这一情况，最好在酸性磷酸酶的编码基因上产生人工突变，使得对核苷的亲和性增加。另外，用酸性磷酸酶在较高温度下进行磷酸酯转移反应，使得核苷-5’-磷酸酯的生产有效得多，因为反应速度提高，并且在反应溶液中的磷酸酯受体的浓度可以更高。为此，最好在酸性磷酸酶的编码基因上产生人工突变，使得温度稳定性提高。在DNA的目的位点上产生目的突变的定位点诱变的方法包括例如使用PCR的方法(Higuchi，R.，61，inPCRtechnology，Erlich，H.A.Eds.，Stocktonpress(1989)；Carter，P.，Meth.inEnzymol.，154，382(1987))，和使用噬菌体的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.inEnzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等人，Meth.inEnzymol.，154，367(1987))。对核苷亲和性较高的突变型酸性磷酸酶的实例为包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQIDNO4、8、22、24、26和28中描述顺序的其中一种氨基酸顺序基本相同、并具有增加野生型酸性磷酸酶对核苷亲和性的突变的酸性磷酸酶。具体地说，得自EsherichiablattaeJCM1650的突变型酸性磷酸酶的实例为，顺序表中SEQIDNO8中描述的氨基酸顺序的第74位甘氨酸残基和/或第153位异亮氨酸残基被另一个氨基酸残基替代。在以下描述的实施例中，突变型酸性磷酸酶的编码基因作为一个实施例进行描述，其中第74位甘氨酸残基用天冬氨酸残基替代，而第153位的异亮氨酸残基用苏氨酸残基替代。选自顺序表中SEQIDNO8中的包括第63位亮氨酸残基、第65位丙氨酸残基、第66位谷氨酸残基、第69位天冬氨酸残基、第71位丝氨酸残基、第72位丝氨酸残基、第85位丝氨酸残基、第92位丙氨酸残基、第94位丙氨酸残基、第116位天冬氨酸残基、第130位丝氨酸残基、第135位苏氨酸残基和/或第136位谷氨酸残基用另一氨基酸替代的其它突变，进一步提高了酸性磷酸酶对核苷的亲和性。温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶的实例为，包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQIDNO4、8、22、24、26和28中描述顺序的其中一种氨基酸顺序基本相同、并且具有增加野生型酸性磷酸酶温度稳定性的突变的酸性磷酸酶。具体地说，得自EsherichiablattaeJCM1650的突变型酸性磷酸酶的实例是，顺序表中SEQIDNO8中描述的氨基酸顺序中的第104位谷氨酸残基和/或第151位苏氨酸残基被另一个氨基酸残基替代。在以下描述的实施例中，编码突变型酸性磷酸酶的基因作为一个实施例进行描述，其中第104位谷氨酸残基用甘氨酸残基替代，而第151位苏氨酸残基用丙氨酸残基替代。因此，可以按照上述定位点诱变方法，在野生型基因的特定位点替代核苷酸，以编码这些突变型酸性磷酸酶。增加对核苷亲和性的突变是合乎需要的突变，即通过这种突变，生产核苷-5’-磷酸酯的活性与野生型酸性磷酸酶相比，基本上不降低。然而，甚至在产生核苷-5’-磷酸酯的活性降低的情况下，如果磷酸单酯酶活性降低的程度大于产生核苷-5’-磷酸酯的活性降低程度，结果与野生型酸性磷酸酶相比，磷酸单酯酶的活性与产生核苷-5’-磷酸酯的活性之比降低，那么也是足够的。关于对核苷亲和性的增加程度，在转磷酸反应中对核苷的Km值最好低于100mM。增加温度稳定性的突变是指，在温度处理后这种突变残留的活性高于野生型酸性磷酸酶的残留活性。温度稳定性增加的程度最好是在pH7.0、50℃处理30分钟后不发生活性降低。正如下面实施方案中描述的，EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶的氨基酸顺序与摩氏摩根氏菌NCIMB10466的氨基酸顺序高度同源，在SEQIDNO4描述的氨基酸顺序中的第72位甘氨酸残基、第102位的谷氨酸残基、第149位苏氨酸残基和第151位异亮氨酸残基分别相当于SEQIDNO8描述的氨基酸顺序中的第74位甘氨酸残基、第104位谷氨酸残基、第151位苏氨酸残基和第153位的异亮氨酸残基。另外，除EsherichiablattaeJCM1650之外，得自诸如斯托氏普罗威登斯菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010、KlebsiellaplanticolaIFO14939和SerrtiaficariaIAM13540等微生物的酸性磷酸酶的氨基酸顺序与摩氏摩根氏菌NCIMB10466的氨基酸顺序高度同源，这些酸性磷酸酶的氨基酸顺序包括每个分别相当于在SEQIDNO4描述的氨基酸顺序中的第72位甘氨酸残基、第102位的谷氨酸残基、第149位苏氨酸残基和第151位异亮氨酸残基的氨基酸残基。因此，得自这些微生物的突变型酸性磷酸酶的编码基因可以按上述方法获得。在SEQIDNO22、24或26中描述的得自斯托氏普罗威登斯菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010或KlebsiellaplanticolaIFO14939的酸性磷酸酶的氨基酸顺序中的第92位甘氨酸残基、第122位谷氨酸残基、第169位苏氨酸残基和第171位异亮氨酸残基以及在SEQIDNO28中描述的得自SerrtiaficariaIAM13450的酸性磷酸酶的基硫顺序中的第88位甘氨酸残基、第118位谷氨酸残基、第165位苏氨酸残基和第167位异亮氨酸残基分别相当于在SEQIDNO4描述的氨基酸顺序中的第72位甘氨酸残基、第102位谷氨酸残基、第149位苏氨酸残基和第151位异亮氨酸残基。图12描述了比较上述酸性磷酸酶的氨基酸顺序的结果。在图12基础上，决定酸性磷酸酶的哪个氨基酸残基相当于另一酸性磷酸酶的另一氨基酸残基。<4>将酸性磷酸酶基因导入宿主中高水平表达酸性磷酸酶活性的重组微生物可以通过以下步骤获得将含有按上述方法获得的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质编码基因的DNA片断与适当的载体重组后，将该DNA片断导入宿主中。在这一步骤中，用野生型酸性磷酸酶的编码基因表达野生型酸性磷酸酶，而用突变型酸性磷酸酶的编码基因表达突变型酸性磷酸酶。宿主包括诸如上述HB101、JM109和DH5等的大肠杆菌微生物菌株。除这些菌株外，还可以将所有细菌用作宿主，只要构建的重组DNA的复制起点和酸性磷酸酶基因起作用、重组DNA可复制、而酸性磷酸酶基因可以表达即可。其中一个最优选的宿主是大肠杆菌JM109。导入酸性磷酸酶编码基因的载体不特别限制，只要它可在宿主中复制即可。使用大肠杆菌作为宿主时，载体的实例是在该细菌中可自主复制的质粒。例如可以使用ColE1型质粒、pl5A型质粒、R因子型质粒和噬菌体型质粒。这类质粒具体包括例如pBR322(Gene，2，95(1977)、pUC19(Gene，33，103(1985)、pUC119(MehtodsinEmzymology，153，3(1987))、pACYC184(J.Bacteriol.，134，1141(1978)和pSC101(Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.，70，3240(1973))。当含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断含有在宿主中起作用的启动子时，可以将DNA片断照原样与载体连接。当该DNA片断不含这一启动子时，可以将在宿主微生物中起作用的另一启动子(诸如lac、trp和PL等)连接到该基因上游位置。甚至当该DNA片断含有该启动子时，该启动子也可以用另一启动子替代，以便有效地表达酸性磷酸酶编码基因。将通过载体与含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断连接构建的重组DNA导入宿主中的方法没有特殊的限制。可以用常规方法将重组DNA导入宿主中。使用大肠杆菌作为宿主时，可以使用例如氯化钙法(J.Mol.Biol.，53，159(1970))、Hanahan法(J.Mol.Biol.，166，557(1983))、SEM法(Gene，96，23(1990))、Chung等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，2172(1989))和电击法(NucleicAcidsRes.，16，6127(1988))。酸性磷酸酶基因可以插入自主复制的载体DNA上，可以将其导入宿主中，使得它作为上述染色体外DNA包含于宿主中。或者，可以按照使用转导、转座子(Biotechnol.，1,417(1983))、Mu噬菌体(日本专利公开2-109985)或同源重组(ExperimentsinMolecularGenetics，ColdSpringHarbourLab.(1972))的方法，将酸性磷酸酶基因引入宿主微生物的染色体中。<5>用重组微生物表达酸性磷酸酶基因按上述方法获得的已导入重组DNA(含有酸性磷酸酶编码基因)的转化体，通过将其培养在适当的培养基(含有碳源、氮源、无机离子和可选的有机营养物源)中，能够在其细胞中高水平地表达酸性磷酸酶活性。适当使用的碳源包括例如诸如葡萄糖等的糖类、诸如甘油等的醇类化合物和有机酸。所用的氮源包括例如氨气、氨水和铵盐。必要时适当使用的无机离子包括例如镁离子、磷离子、钾离子、铁离子和锰离子。适当使用的有机营养物源包括例如维生素和氨基酸以及含有它们的那些营养物源，诸如酵母膏、胨、肉膏、玉米浆、水解酪蛋白和大豆水解物。根据启动子，将诸如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)等表达诱导剂加入培养基中，可以增加酸性磷酸酶活性的表达量。培养条件也不特别限制。例如可以在需氧条件下培养大约12-48小时，同时将pH和温度适当地控制在pH5-8和25-40℃的范围内。此后，从培养物中收获微生物细胞，通过破碎制备无细胞提取物，可以从其中纯化酸性磷酸酶。使用通常用于酶纯化的的适当技术组合(诸如上述第<1>条中描述的那些技术等)进行纯化。关于纯化，不必完全纯化酸性磷酸酶。做到除去诸如参加核苷底物降解的酶等污染物就足够了。<6>核苷-5’-磷酸酯的生产核苷-5’-磷酸酯可以在反应混合物中生产，即让按第<1>条描述方法获得的酸性磷酸酶、或野生型酸性磷酸酶、或通过按照第<5>条描述的遗传工程技术大量表达基因得到的突变型酸性磷酸酶，与核苷及磷酸基团供体(选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)接触并引起反应。为了在该反应中达到高生产率，重要的是将反应溶液的pH调至3.0-5.5的弱酸性范围内。当用遗传工程技术大量表达酸性磷酸酶的编码基因时，特别是当大量表达对核苷的亲和性较高的突变型酸性磷酸酶编码基因时，也可以使用含转化体微生物细胞的培养物，便宜并有效地生产核苷-5’-磷酸酯，从培养物中分离并收获微生物细胞，或按照例如固定化处理、丙酮处理或冷冻干燥处理代替纯化的酸性磷酸酶，从微生物细胞中获得产物。使用的核苷包括例如嘌呤核苷，诸如肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、嘌呤核糖核苷、6-甲氧基嘌呤核糖核苷、2，6-二氨基嘌呤核糖核苷、6-氟嘌呤核糖核苷、6-硫代嘌呤核糖核苷、2-氨基-6-硫代嘌呤核糖核苷和巯基鸟苷等；和嘧啶核苷，诸如尿苷、胞苷、5-氨基尿苷、5-羟基尿苷、5-溴尿苷和6-氮杂尿苷等。反应结果是，这些天然型核苷和非天然型核苷在它们的5’-位置上专一性地磷酸化，分别生产出相应的核苷-5’-磷酸酯。需要加入反应溶液中的核苷浓度为1-20g/dl。使用微溶于水的核苷时，可以通过加入硼酸或诸如二甲基亚砜等表面活性剂，提高反应产量。通过发酵生产核苷时，发酵后的发酵培养基可以照原样加入磷酸化反应液中。当培养基中包含分解核苷-5’-磷酸酯的成分时，最好使用纯化步骤，使得除去所述成分。关于所用的磷酸基团供体，可作为多磷酸或其盐使用的那些磷酸基团供体包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、它们的混合物、其钠盐、钾盐和它们的盐的混合物。那些可作为苯磷酸或其盐使用的磷酸基团供体包括例如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐和它们的混合物。那些可作为氨甲酰磷酸或其盐使用的磷酸基团供体包括例如氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂和它们的混合物。那些可作为乙酰磷酸或其盐使用的磷酸基团供体包括例如乙酰磷酸锂钾。磷酸基团供体使用的浓度由作为磷酸基团受体的核苷浓度决定。磷酸基团供体的用量通常为核苷用量的1-5倍。在温度通常为20-60℃、最好为30-40℃，pH为3.5-6.5、最好为4.0-5.0的弱酸性范围内的反应中，获得最佳结果。使用温度稳定性增加的突变型酸性磷酸酶时，反应温度为20-70℃，最好为30-60℃。可以采用静止方法和搅拌方法中的任一种方法进行反应。反应时间根据诸如所用酶的活性和底物浓度等条件而延迟，然而，一般为1-100小时。在完成反应后，可以采用使用合成树脂吸附的方法、使用沉淀剂的方法和其它常规收集和分离方法，从混合物中收集和分离由此生产的核苷-5’磷酸酯。下面参考实施例具体解释本发明，然而，本发明不限于这些实施例。用肌苷作为底物，在以下条件下测定转磷酸活性。反应在pH5.0、30℃下进行10分钟，在反应溶液(1ml)中含有40μmol/ml肌苷、100μmol/ml焦磷酸钠、100μmol/ml乙酸钠缓冲液(pH5.0)和酶。加入200μl2N盐酸中止反应。此后，通过离心除去沉淀。然后，定量测定通过转磷酸反应产生的5’-肌苷酸。在该标准反应条件下每1分钟产生1μmol5’-肌苷酸的酶量定为1个单位。使用5’-肌苷酸作为底物，在以下条件下测定磷酸单酯酶活性。反应在30℃下进行10分钟，在反应溶液(1ml)中含有10μmol/ml5’-肌苷酸、100μmol/mlMES/NaOH缓冲液(pH6.0)和酶。加入200μl2N盐酸中止反应。此后，通过离心除去沉淀。然后，定量测定通过水解反应产生的肌苷。在该标准反应条件下每1分钟产生1μmol肌苷的酶量定为1个单位。在以下条件下用高效液相层析(HPLC)分析肌苷和5’-肌苷酸。柱子Cosmosil5C18-AR(4.6×150mm)[由nacalaitesque生产]；流动相5mM磷酸钾缓冲液(pH2.8)/甲醇＝95/5；流速1.0ml/min；温度室温；检测UV245nm。顺便说说，在用除肌苷外的核苷作为原料生产核苷-5’-磷酸酯的反应中，按照上述方法用HPLC分析作为原料的核苷和产生的核苷-5’-磷酸酯。实施例1得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的纯化和表征将含有1g/dl胨、0.5g/dl酵母膏和1g/dl氯化钠的营养培养基(pH7.0，50ml)注入坂口(Sakaguchi)烧瓶(500ml)中，在120℃下灭菌20分钟。每个烧瓶用白金接种环接种一次摩氏摩根氏菌NCIMB10466斜面培养物，在30℃震荡培养16小时。将通过离心从培养物收获的微生物细胞(大约3,000g)悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(1L，pH7.0)中。在4℃下进行超声处理20分钟，以破碎微生物细胞。对处理后的悬浮液进行离心，以除去不溶部分。由此制备得到无细胞提取物。将硫酸铵加入无细胞提取物中，使得达到30％的饱和度。通过离心除去出现的沉淀，然后再将硫酸铵加入上清液中，使得达到60％的饱和度。通过离心收集出现的沉淀，将其溶于100mM磷酸钾缓冲液中。该粗酶溶液对5L100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析4次，然后将其加到用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopeal650M柱(φ4.1×22cm)上，然后用800ml20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤。在通过柱子的一个部分中发现转磷酸活性，从而回收该部分。将硫酸铵加入该部分中，使得达到35％的饱和度，将其吸附到用含有35％饱和度硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopeal柱(φ3.1×26cm)上。用磷酸钾缓冲液(pH7.0)中饱和度为35-20％的线性浓度梯度进行洗脱。收集活性部分，并对1L50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，然后加到用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(φ5×6.5cm)上。用50-300mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度进行洗脱。收集活性部分，并进行超滤浓缩。将该酶溶液加到HiLoadTM16/60Superdex200柱上(由Pharmacia生产)。用含有100mM氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液，以1.0ml/min的流速进行洗脱。按照上述步骤，结果从无细胞提取物中纯化出表现转磷酸活性的酶，纯化倍数为大约550倍，回收率大约为10％。该纯化方法的比活和回收率示于表1中。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，该酶样是均一的。表1回收步骤总活性总蛋白比活回收率(单位)(mg)(单位/mg)(％)1.无细胞提取物597127,2000.0051002.硫酸铵分级分离568122,2100.00595(30-60％)3.DEAE-Toyopearl51736,4980.014874.Butyl-Toyopearl3941,1210.351665.羟基磷灰石112502.244196.Superdex20063242.63010纯化的酶具有以下性质。(1)作用将磷酸基团从诸如多磷酸等磷酸基团供体转移到核苷上，产生核苷-5’-磷酸酯。相反地，该酶也表现出水解磷酸酯的活性。(2)底物专一性在转磷酸反应中用作磷酸基团供体的那些底物包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂。作为磷酸基团受体的那些底物包括例如嘌呤核糖核苷、肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、尿苷和胞苷。另一方面，在磷酸酯水解反应中受到作用的那些底物包括例如无机磷酸，诸如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等；磷酸酯，诸如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂；以及5’-核苷酸，诸如5’-嘌呤核糖核苷酸、5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸、5’-腺苷酸、5’-黄苷酸、5’-尿苷酸和5’-胞苷酸等。(3)最适pH5.2(转磷酸反应)，6.5(磷酸酯水解反应)。(4)pH稳定性pH3.0-12.0(在30℃处理60分钟)。(5)最适温度大约35℃。(6)温度稳定性可稳定至30℃(在pH7.0下处理30分钟)。(7)加入金属离子和抑制剂的效果加入任何金属离子，该酶都不表现出与其活性有关的激活现象。该活性受Ag2+、Pb2+、Hg2+和Cu2+的抑制。该活性也受碘乙酸的抑制。(8)分子量按照高效液相层析(TSKgelG-3000SW，由ToyoSoda生产)计算的分子量为大约190,000。(9)亚基分子量按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳计算的亚基分子量为大约25,000。该酶不仅表现出将磷酸基团转移到核苷的活性，而且表现出相反的水解磷酸酯的活性。此外，该酶表现出的磷酸酯水解活性(磷酸单酯酶活性)比转磷酸活性高出的倍数不低于20倍。其它性质与用属于摩根氏菌属细菌产生的已知酸性磷酸酶的那些性质(Microbiology，140，1341-1350(1994))很好地吻合。因此，已经阐明该酶为酸性磷酸酶。将焦磷酸钠(10g/dl)和肌苷(2g/dl)溶于pH为5.5、5.0、4.5、4.0和3.5的乙酸钠缓冲液中，加入上述酶样，使达到50单位/dl的浓度。该反应混合物在30℃下保温6小时，同时保持每个pH；随着时间的推移，测定产生的5-’肌苷酸的量。产生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的产生。结果示于图1中。5’-肌苷酸的生产速度在pH5.0下最大。然而，5’-肌苷酸最大积累量在较低pH下更高。在pH4.0下的反应条件对5’-肌苷酸的生产最有效，其中通过进行3小时的反应，5’-肌苷酸产生并积累的量为2.60g/dl。实施例2用得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶样品进行的各种核苷的磷酸化反应将焦磷酸钠(10g/dl)和作为磷酸基团受体的肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷(2g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例1中制备的酶样，使达到50单位/dl的浓度。该反应混合物在30℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。通过反应产生的核苷-5’-酯的量示于表2中。产生的核苷酸只含有核苷-5’-酯。根本没有观察到核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副产物的产生。表2核苷产物产量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸2.60鸟苷5’-鸟苷酸1.90尿苷5’-尿苷酸1.30胞苷5’-胞苷酸0.98实施例3用得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶样品从作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸将肌苷(2g/dl)和作为磷酸基团供体的三聚磷酸钠、多磷酸钠(商品名PolygonP，由ChiyodaChemical生产)、苯磷酸二钠或氨甲酰磷酸二钠(10g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例1中制备的酶样，使得其浓度为50单位/dl。该反应混合物在30℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。通过反应产生的5’-肌苷酸的量示于表3中。使用任何磷酸基团供体，都有效地产生并积累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸钠作为磷酸基团供体时，5’-肌苷酸的积累量最高。表3磷酸基团供体产生的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸钠2.10多磷酸钠2.72苯磷酸二钠2.33氨甲酰磷酸二钠2.54实施例4得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶的纯化和表征将含有1g/dl胨、0.5g/dl酵母膏和1g/dl氯化钠的营养培养基(pH7.0，50ml)注入坂口烧瓶(500ml)中，在120℃下灭菌20分钟。每个烧瓶用白金接种环接种一次EsherichiablattaeJCM1650斜面培养物，在30℃震荡培养16小时。通过离心从培养物收获微生物细胞。将微生物细胞(大约3,300g)悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(1L，pH7.0)中。在4℃下进行超声处理20分钟，以破碎微生物细胞。对处理后的悬浮液进行离心，以除去其不溶部分。由此制备得到无细胞提取物。将硫酸铵加入无细胞提取物中，使得达到30％的饱和度。通过离心除去出现的沉淀，然后再将硫酸铵加入上清液中，使得达到60％的饱和度。通过离心收集出现的沉淀，将其溶于100mM磷酸钾缓冲液中。该粗酶溶液对5L100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析4次，然后将其加到用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopeal650M柱(φ6.2×35cm)上，然后用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤。在通过柱子的一个部分中发现转磷酸活性，从而收集该部分。将硫酸铵加入该活性部分中，使得达到35％的饱和度，将其加到到用含有35％饱和度硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopeal柱(φ5.0×22.5cm)上。用磷酸钾缓冲液(pH7.0)中饱和度为35-20％的线性浓度梯度进行洗脱。收集活性部分，并对1L100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，然后加到用100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(φ3.0×7.0cm)上。用50-100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度进行洗脱，并收集活性部分。该酶溶液对1L100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)透析，然后加到用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)平衡的CM-Toyopearl柱(φ2.0×14.0cm)上。用磷酸钾缓冲液(pH6.0)中含有0-300mM氯化钾的线性浓度梯度进行洗脱。收集从柱子洗脱的活性部分。按照上述步骤，结果从无细胞提取物中纯化出表现转磷酸活性的酶，纯化倍数为大约600倍，回收率大约为16％。该纯化方法的比活和回收率示于表4中。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，该酶样品是均一的。表4步骤总活性总蛋白比活回收率(单位)(mg)(单位/mg)(％)1.无细胞提取物365160,6500.0021002.硫酸铵分级分离340138,8950.00293(30-60％)3.DEAE-Topopearl31830,4400.010874.Butyl-Topopearl2326610.347635.羟基磷灰石96961.000266.CM-Toyopearl59431.36516纯化的酶具有以下性质。(1)作用将磷酸基团从诸如多磷酸等磷酸基团供体转移到核苷上，产生核苷-5’-磷酸酯。相反地，该酶也表现出水解磷酸酯的活性。(2)底物专一性在转磷酸反应中作为磷酸基团供体的那些底物包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂。作为磷酸基团受体的那些底物包括例如嘌呤核糖核苷、肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、尿苷和胞苷。另一方面，在磷酸酯水解反应中受到作用的那些底物包括例如无机磷酸，诸如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等；磷酸酯，诸如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂等；以及5’-核苷酸，诸如5’-嘌呤核糖核苷酸、5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸、5’-腺苷酸、5’-黄苷酸、5’-尿苷酸和5’-胞苷酸。(3)最适pH5.2(转磷酸反应)，6.5(磷酸酯水解反应)。(4)pH稳定性pH3.5-12.0(在30℃处理60分钟)。(5)最适温度大约35℃。(6)温度稳定性可稳定至40℃(在pH7.0下处理30分钟)。(7)加入金属离子和抑制剂的效果加入任何金属离子，该酶都不表现出与其活性有关的激活现象。该活性受Fe2+、Ag2+、Pb2+、Hg2+和Cu2+的抑制。该活性也受碘乙酸的抑制。(8)分子量按照高效液相层析(TSKgelG-3000SW，由ToyoSoda生产)计算的分子量为大约188,000。(9)亚基分子量按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳计算的亚基分子量为大约24,500。该酶不仅表现出将磷酸基团转移到核苷的活性，而且也表现出相反的水解磷酸酯的活性，其方式与从摩氏摩根氏菌NCIMB10466的无细胞提取物中纯化的酶相似。此外，该酶表现出的磷酸酯水解活性(磷酸单酯酶活性)比转磷酸活性高出的倍数不低于30倍。因此，已经阐明该酶为酸性磷酸酶。将焦磷酸钠(15g/dl)和肌苷(3g/dl)溶于pH为5.5、5.0、4.5、4.0和3.5的乙酸钠缓冲液中，加入上述酶样，使达到50单位/dl的浓度。该反应混合物在30℃下保温6小时，同时保持每个pH；随着时间的推移，测定产生的5-’肌苷酸的量。产生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的产生。结果示于图2中。5’-肌苷酸的生产速度在pH5.0下最大。然而，5’-肌苷酸最大积累量在较低pH下更高。在pH4.0下的反应条件对5’-肌苷酸的生产最有效。通过在30℃、pH4.0下进行3小时的反应，5’-肌苷酸产生并积累的量为1.56g/dl。实施例5用得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶样品进行的各种核苷的磷酸化反应将焦磷酸钠(15g/dl)和肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷(3g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例4中制备的酶样，使得其浓度为50单位/dl。该反应混合物在35℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。产生的核苷-5’-酯的量示于表5中。产生的核苷酸只含有核苷-5’-酯。根本没有观察到核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副产物的产生。表5核苷产物产量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸1.56鸟苷5’-鸟苷酸1.05尿苷5’-尿苷酸1.87胞苷5’-胞苷酸1.22实施例6用得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶样品从作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸将肌苷(2g/dl)和作为磷酸基团供体的三聚磷酸钠、多磷酸钠(商品名PolygonP，由ChiyodaChemical生产)、苯磷酸二钠或氨甲酰磷酸二钠(10g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例4中制备的酶样，使得其浓度为50单位/dl。该反应混合物在35℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。产生的5’-肌苷酸的量示于表6中。使用任何磷酸基团供体，都有效地产生并积累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸钠作为磷酸基团供体时，5’-肌苷酸的积累量最高。表6磷酸基团供体产生的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸钠1.20多磷酸钠1.79苯磷酸二钠1.50氨甲酰磷酸二钠1.53实施例7摩氏摩根氏菌染色体的酸性磷酸酶编码基因的分离(1)N-末端氨基酸顺序的测定将按照实施例1描述的方法从摩氏摩根氏菌NCIMB10466无细胞提取物中纯化的酸性磷酸酶，吸附到DITC膜(由Milligen/Biosearoh生产)上，用Prosequencer6625(由Milligen/Biosearch生产)测定其N-末端氨基酸顺序。确定了顺序表SEQIDNO1中所示一个包含20个残基的N-末端氨基酸顺序。(2)含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的分离按照Murray和Thomson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，从培养的摩氏摩根氏菌NCIMB10466微生物细胞中提取染色体DNA。用限制性内切酶Sau3AI部分降解染色体DNA。此后，借助于蔗糖密度梯度离心分离3-6kbp的DNA片断。质粒载体pUC118(由TakaraShuzo生产)用限制性内切酶BamHI降解，将其与部分降解的染色体DNA片断连接。用DNA连接药盒(由TakaraShuzo生产)按照指定的方法进行DNA连接。此后，按照常规方法，用获得的DNA混合物转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)。转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上铺平板，让其生长以制备基因文库。将含有4mM对硝基苯磷酸和100mMMES/NaOH缓冲液(pH6.5)的反应溶液倒在转化体生长的琼脂培养基上，将温度保持在30℃15分钟。表达磷酸酶活性的菌株释放对硝基酚并表现出黄色。因此，用该现象作为指标筛选转化体。筛选了一个包含大约20,000个转化体菌株的基因表达文库，结果获得30个表达磷酸酶活性的转化体菌株。表达磷酸酶活性的转化体(30个菌株)经过单克隆分离。将单克隆培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(2.5ml)上，让其在37℃培养16小时。将含有肌苷(2g/dl)和焦磷酸钠(10g/dl)的乙酸钠缓冲液(100mM，pH5.0，50μl)加入从培养物中收获的微生物细胞中，反应混合物在30℃保温16小时。通过HPLC分析检测5’-肌苷酸的生产，以筛选具有转磷酸活性的微生物菌株。结果，我们成功地获得5个转化体，它们表现出转磷酸活性，并假定包含含有目的酸性磷酸酶基因的DNA片断。实施例8得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因核苷酸顺序的测定按照碱裂解法(MolecularCloning2ndedition(J.Sambrook，E.F.FritschandT.Maniatis，ColdSpringHarbourLaboratoryPress，pl.25(1989))，从实施例7获得的、假定包含含有酸性磷酸酶基因(得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466)的DNA片断的一个转化体菌株制备质粒，分析插入的DNA片断。该质粒命名为pMPI501。图3显示了测定的插入DNA片断的限制性内切酶图谱。通过亚克隆进一步具体测定酸性磷酸酶基因区。结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶HindIII和EcoRI剪切的大小为1.2kbp的片断上。因此为了测定该核苷酸顺序，构建一个质粒DNA，将1.2kbp片断与用HindIII和EcoRI降解的pUC118连接。按照常规方法，用命名为pMPI505的该质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)，将其在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基铺平板，以获得转化体。按照碱裂解法，从包含pMPI505的大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)的转化体中提取质粒，测定核苷酸顺序。按照Sanger的方法(J.Mol.Biol.，143，161(1980))，用TaqDyeDeoxy末端循环测序药盒(由AppliedBiochemical生产)测定核苷酸顺序。一个测定的开放阅读框架的核苷酸顺序示于顺序表的SEQIDNO2中。从该核苷酸顺序得出的蛋白质氨基酸顺序示于顺序表的SEQIDNO3中。在该氨基酸顺序中发现一个与纯化酶N-末端氨基酸顺序完全吻合的部分顺序。纯化酶的N-末端从SEQIDNO3中所示顺序的第21位丙氨酸残基开始。因此，我们假定SEQIDNO3中所示的氨基酸顺序为前体蛋白的氨基酸顺序，并且包含从第1位甲硫氨酸残基至第20位丙氨酸残基区域的多肽在翻译后被去除。由此得出的成熟蛋白的氨基酸顺序示于顺序表的SEQIDNO4中。从该氨基酸顺序估计的成熟蛋白的分子量计算为24.9千道尔顿，它与纯化酶的SDS-PAGE结果很好地吻合。按照上述结果，由于包含含该片断质粒的转化体表现出转磷酸活性，鉴定该开放阅读框架为目的酸性磷酸酶的编码区。分别比较核苷酸顺序和氨基酸顺序与已知顺序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的数据库。结果揭示出，顺序表的SEOIDNO2中所示的核苷酸顺序与得自摩氏摩根氏菌的已知酸性磷酸酶基因的核苷酸顺序(Thaller，M.C.等人，Microbiology，140，1341(1994))吻合，只是在后者中，第54位G为A，第72位G为A，第276位T为G，第378位T为C，第420位G为T，第525位C为G，第529位C为T和第531位G为A，并且顺序表的SEQIDNO4中所示的氨基酸顺序与得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的氨基酸顺序相同。即包含顺序表SEQIDNO4中所示氨基酸顺序的蛋白质的编码基因为摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因。前体蛋白包含249个氨基酸，从其顺序得出的蛋白质的分子量为27.0千道尔顿。用质粒pMPI505转化的大肠杆菌JM109菌株命名为AJ13143，已经于1996年2月23日在布达佩斯条约下，在工业科学技术局的国家生命科学和人类技术研究所(邮政编码305，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)进行了国际储藏，给予的储藏号为FERMBP-5422。实施例9通过表达得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因放大活性将实施例8中构建的大肠杆菌JM109/pMPI505接种在含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃下培养16小时。通过离心从其培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.2)中，通过在4℃下进行20分钟的超声处理破碎细胞。将处理后的溶液离心，以除去不溶部分，由此制备得到无细胞提取物。测定获得的无细胞提取物的转磷酸活性，而使用的对照为从摩氏摩根氏菌野生型菌株和用质粒pUC118按照上述相同方法转化的大肠杆菌JM109制备的无细胞提取物。结果示于表7中。在大肠杆菌JM109/pUC118中没有检测到转磷酸活性。在摩氏摩根氏菌野生型菌株中转磷酸活性也很低。另一方面，大肠杆菌JM109/pMPI505表现出高转磷酸活性，其比活为摩氏摩根氏菌野生型菌株的150倍。按照该结果，证明导入的DNA片断使大肠杆菌高水平地表达酸性磷酸酶。表7微生物菌株转磷酸活性(单位/mg)摩氏摩根氏菌NCIMB104660.008大肠杆菌JM109/pUC118未检测到大肠杆菌JM109/pMPI5051.250实施例11Esherichiablattae染色体的酸性磷酸酶编码基因的分离(1)N-末端氨基酸顺序的测定将从EsherichiablattaeJCM1650无细胞提取物中纯化的酸性磷酸酶，吸附到DITC膜(由Milligen/Biosearch生产)上，用Prosequencer6625(由Milligen/Biosearch生产)测定其N-末端氨基酸顺序。确定了顺序表SEQIDNO8中所示的一个包含15个残基的N-末端氨基酸顺序。(2)含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的分离按照Murray和Thmoson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，从培养的EsherichiablattaeJCM1650细胞中提取染色体DNA。用限制性内切酶Sau3AI部分降解染色体DNA。此后，用蔗糖密度梯度离心分离3-6kbp的DNA片断。质粒载体pUC118(由TakaraShuzo生产)用限制性内切酶BamHI降解，将其与部分降解的染色体DNA片断连接。用DNA连接药盒(由TakaraShuzo生产)按照指定方法进行DNA连接。此后，按照常规方法，用获得的DNA混合物转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)。转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基铺平板，让其生长以制备基因文库。将含有4mM对硝基苯磷酸和100mMMES/NaOH缓冲液(pH6.5)的反应溶液倒在转化体生长的琼脂培养基表面上，将温度保持在30℃15分钟。表达磷酸酶活性的菌株释放对硝基酚并表现出黄色。因此，用该现象作为指标筛选转化体。筛选了一个包含大约8,000个转化体菌株的染色体基因表达文库，结果获得14个表达磷酸酶活性的转化体菌株。表达磷酸酶活性的转化体(14个菌株)经过单克隆分离。将单克隆培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(2.5ml)上，让其在37℃培养16小时。将含有肌苷(2g/dl)和焦磷酸钠(10g/dl)的乙酸钠缓冲液(100mM，pH5.0，50μl)加入从培养液中收获的微生物细胞中，在30℃进行16小时的反应。通过HPLC分析检测5’-肌苷酸的生产，以筛选具有转磷酸活性的菌株。结果，我们成功地获得3个转化体，它们表现出转磷酸活性，并假定包含含目的酸性磷酸酶基因的DNA片断。实施例12得自EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因核苷酸顺序的测定按照碱裂解法，从实施例11获得的、假定包含含酸性磷酸酶基因(得自EsherichiablattaeJCM1650)的DNA片断的一个转化体菌株中提取质粒，分析插入的DNA片断。该质粒命名为pEPI301。图5显示了测定的插入DNA片断的限制性内切酶图谱。通过亚克隆进一步具体测定酸性磷酸酶基因区。结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶ClaI和BamHI剪切的、大小为2.4kbp的片断上。因此为了测定该核苷酸顺序，构建质粒DNA，其中将该片断与用ClaI和BamHI降解的pBluescriptKS(+)(由Stratagene生产)连接。按照常规方法，用命名为pEPI305的该质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)，将其在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基铺平板，以获得转化体。按照碱裂解法，从包含pEPI305的大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)转化体中提取质粒，测定核苷酸顺序。一个测定的开放阅读框架的核苷酸顺序示于顺序表的SEQIDNO6中。从该核苷酸顺序得出的蛋白质的氨基酸顺序示于顺序表的SEQIDNO7中。在该氨基酸顺序中发现一个与纯化酶N-末端氨基酸顺序完全吻合的部分顺序。纯化酶的N-末端从SEQIDNO7中所示顺序的第19位亮氨酸残基开始。因此，我们假定SEQIDNO7中所示的氨基酸顺序为前体蛋白质的氨基酸顺序，并且包含从第1位甲硫氨酸残基至第18位丙氨酸残基区域的多肽在翻译后被去除。由此推测的成熟蛋白的氨基酸顺序示于顺序表的SEQIDNO8中。因此，估计的成熟蛋白的分子量计算为25.1千道尔顿，它与纯化酶的SDS-PAGE结果很好地吻合。按照上述结果，由于包含含该片断的质粒的转化体表现出转磷酸活性，因此鉴定该开放阅读框架为目的酸性磷酸酶的编码区。即包含顺序表ESQIDNO8中所示氨基酸顺序的蛋白质编码基因为EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因。分别比较核苷酸顺序和氨基酸顺序与已知顺序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的数据库。结果，揭示出顺序表的SEQIDNO8中所示的蛋白质与编码它的DNA是新的。该基因编码的前体蛋白包含249个氨基酸，由其顺序得出的蛋白质的分子量为27.0千道尔顿。分别比较氨基酸顺序与已知顺序的同源性。结果，该蛋白质表现出与斯托氏普罗威登斯菌的酸性磷酸酶、实施例8中的摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶和鼠伤寒沙门氏菌的酸性磷酸酶的高度同源性，同源性分别为77.1％、77.1％和44.3％。用质粒pEPI305转化的大肠杆菌JM109菌株命名为AJ13144，已经于1996年2月23日在布达佩斯条约下，在工业科学技术局的国家生命科学和人类技术研究所(邮政编码305，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)进行了国际储藏，给予的储藏号为FERMBP-5423。实施例13通过表达得自EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因放大活性将实施例12中构建的大肠杆菌JM109/pEPI305接种在含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃下培养16小时。通过离心从其培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.2)中，通过在4℃下进行20分钟的超声处理破碎细胞。将处理后的溶液离心，以除去不溶部分，由此制备得到无细胞提取物。测定获得的无细胞提取物的转磷酸活性，而使用的对照为从Esherichiablattae野生型菌株和用质粒pBluescriptKS(+)按照上述相同方法转化的大肠杆菌JM109中制备的无细胞提取物。结果示于表8中。在大肠杆菌JM109/pBluescriptKS(+)中没有检测到转磷酸活性。在Esherichiablattae野生型菌株中转磷酸活性也很低。另一方面，大肠杆菌JM109/pEPI305表现出高转磷酸活性，其比活为Esherichiablattae野生型菌株的120倍。按照该结果，证明导入的DNA片断使大肠杆菌高水平地表达酸性磷酸酶。表8微生物菌株转磷酸活性(单位/mg)EsherichiablattaeJCM16500.002大肠杆菌JM109/pBluescriptKS(+)未检测到大肠杆菌JM109/pEPI3050.264实施例14用包含得自EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因的菌株从肌苷生产5’-肌苷酸将焦磷酸钠(12g/dl)和肌苷(6g/dl)溶于100mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入上述大肠杆菌JM109/pEPI305的微生物细胞，使转化为微生物细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温10小时，同时将pH保持在4.0；随着时间的推移，测定产生的5’-肌苷酸的量。产生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的生产。结果示于图6中。在短时间内，用该微生物在从焦磷酸盐和肌苷产生5’-肌苷酸的反应中，非常高效地生产和积累5’-肌苷酸。实施例15磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的制备正如实施例13和实施例14所描述的，包含得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶基因的菌株表达相当大量的酸性磷酸酶，并且在短时间内，在用该微生物从焦磷酸盐和肌苷生产5’-肌苷酸的反应中，非常高效地生产和积累5’-肌苷酸。然而，它揭示出5’-肌苷酸的积累量不超过一定程度，因为该酸性磷酸酶本身具有的磷酸单酯酶活性，使生产的5’-肌苷酸降解。因此，试图按照用PCR定位点诱变的方法，将突变导入实施例11克隆的得自Esherichiablattae的该酸性磷酸酶基因中，改进该酶。使用DNA合成仪(由AppliedBiosystems生产的394型)，按照磷酰胺化物法，分别合成顺序表的SEQIDNO9、10和11中所示的寡核苷酸MUT300、MUT310和MUT320。将在实施例12中制备的、作为模板的质粒pEPI305、作为引物的M13引物RV(由TakaraShuzo生产)和MUT310寡核苷酸(每种2.5μmol)以及TaqDNA聚合酶(2.5单位，由TakaraShuzo生产)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每种200μM)、氯化钾(50mM)和氯化镁(1.5mM)的100mMTris-HCl缓冲液(pH8.3，100μl)中，进行PCR反应，其中一个循环包括在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复该循环25次。使用PJ2000型热循环仪(由TakaraShuzo生产)进行PCR反应。此外，以上述相同方式，用质粒pEPI305(1ng)作为模板、M13引物M3(由TakaraShuzo生产)和MUT300寡核苷酸(每种2.5μmol)作为引物进行PCR反应。每种反应溶液通过用Microspin柱S-400(由Pharmacia生产)进行凝胶过滤纯化，以除去引物。将每种PCR反应产物(1μl)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每种200μM)、氯化钾(50mM)和氯化镁(1.5mM)的100mMTris-HCl缓冲液(pH8.3，95μl)中，将其在94℃加热10分钟，然后在60分钟内冷却至37℃。此后，将温度保持在37℃15分钟，形成异源双链。加入TaqDNA聚合酶(2.5单位)，在72℃下反应3分钟，使得完成异源双链。此后，将M13引物RV和M13引物M3(每种2.5μmol)加入该反应溶液中，进行PCR反应，其中一个周期包括在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复10次周期。将第二个PCR反应的产物用ClaI和BamHI降解，然后用苯酚/氯仿抽提，然后进行乙醇沉淀。将该DNA片断与用ClaI和BamHI降解的pBluescriptKS(+)连接。按照常规方法，用获得的质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)，将其在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上铺平板，以获得转化体。按照碱裂解法，从转化体中提取质粒，以测定其核苷酸顺序，证实目的核苷酸被替代。由此制备编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸残基(GGG)用天冬氨酸残基(G*A*T)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI310。按照上述相同的方式，用pEPI305作为模板，MUT300和MUT320寡核苷酸作为引物，制备编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第153位异亮氨酸残基(ATC)用苏氨酸残基(A*CC)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI320。此外，按照上述相同的方式，用pEPI310作为模板，MUT300和MUT320寡核苷酸作为引物，制备编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸残基(GGG)用天冬氨酸残基(G*A*T)替代，而第153位异亮氨酸残基(ATC)用苏氨酸残基(A*CC)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI330。将已导入含有相应突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI310、大肠杆菌JM109/pEP1320和大肠杆菌JM109/pEPI330，以及已导入含野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。从它们的培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.0)中，通过在4℃下超声处理20分钟破碎细胞。离心处理后的溶液，以除去不溶部分，由此制备得到无细胞提取物。在pH4.0下测定获得的无细胞提取物的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性，将它们与野生型菌株的活性进行比较。表9表明野生型酸性磷酸酶和磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性的测定结果。它表明，与野生型酸性磷酸酶相比，磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性都降低，并且磷酸单酯酶活性的降低程度大于转磷酸活性的降低程度，结果，与野生型酸性磷酸酶相比，突变型酸性磷酸酶的磷酸单酯酶活性与转磷酸活性之比降低。表9质粒磷酸单酯酶活性转磷酸活性比值1)(单位/mg)(单位/mg)(相对值)pEPI3052.380.13218.03(100)pEPI3100.260.01913.68(76)pEPI3200.880.1237.15(39)pEPI3300.420.0706.00(33)1)磷酸单酯酶活性与产生核苷-5’-磷酸酯活性之比实施例16用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的菌株从肌苷生产5’-肌苷酸将已导入含有磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI310、大肠杆菌JM109/pEPI320和大肠杆菌JM109/pEPI330，以及已导入含野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。将焦磷酸钠(12g/dl)和肌苷(6g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入通过上述培养获得的每种大肠杆菌菌株的微生物细胞，使转化为微生物细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温32小时，同时将pH保持在4.0；随着时间的推移，测定产生的5’-肌苷酸的量。结果示于图7中。在图7中，纵坐标轴表示5’-肌苷酸的浓度(mg/dl)，而横坐标轴表示反应时间(h)。对于用相应的菌株细胞测定的反应进程，大肠杆菌JM109/pEPI305用实心圆表示，大肠杆菌JM109/pEPI310用实心三角表示，大肠杆菌JM109/pEPI320用空心圆表示，而大肠杆菌JM109/pEPI330用空心方块表示。在用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的菌株从肌苷生产5’-肌苷酸的反应中，生产的5’-肌苷酸的降解速度降低。结果，5’-肌苷酸的产量和积累量都增加了。大肠杆菌JM109/pEPI330表现出最高积累量的5’-肌苷酸，该菌株包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的编码基因，其中第74位甘氨酸残基和第153位异亮氨酸残基分别用天冬氨酸残基和苏氨酸残基替代。实施例17用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的菌株生产各种核苷-5’-磷酸酯将已导入含有磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。将焦磷酸钠(12g/dl)和作为磷酸基团受体的肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷(6g/dl)溶于100mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入上述微生物细胞中，使转化为细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温32小时，同时将pH保持在4.0。生产的核苷-5’-磷酸酯的量示于表10中。产生的核苷酸只含有核苷-5’-磷酸酯。根本没有观察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副产物的生产。表10核苷产物产量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸7.45鸟苷5’-鸟苷酸4.77尿苷5’-尿苷酸8.93胞苷5’-胞苷酸6.60实施例18用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的菌株从作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸将已导入含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。将肌苷(6g/dl)和作为磷酸基团供体的三聚磷酸钠、多磷酸钠(商品名PolygonP，由ChiyodaChemical生产)、苯磷酸二钠或氨甲酰磷酸二钠(12g/dl)溶于100mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入上述微生物细胞中，使转化为细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温32小时，同时将pH保持在4.0。生产的5’-肌苷酸的量示于表11中。使用任何磷酸基团供体，都有效地产生并积累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸作为磷酸基团供体时，5’-肌苷酸的积累量最高。表11磷酸基团供体生产的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸钠5.96多磷酸钠8.84苯磷酸二钠7.60氨甲酰磷酸二钠7.73实施例19对得自EsherichiablattaeJCM1650的新突变型酸性磷酸酶基因的产生和该突变型酸性磷酸酶基因的酶学性质的研究在实施例19-22中，在以下条件下，测定对核苷的转磷酸活性。用含40μmol/ml肌苷、100μmol/ml焦磷酸钠、100μmol/ml乙酸钠缓冲液(pH4.0)和酶的1ml反应溶液，在30℃、pH4.0下进行10分钟的反应。加入200μl2N盐酸中止该反应。然后，通过离心除去沉淀，在上述条件下，测定通过转磷酸生成的5’-肌苷酸的量。在这些标准反应条件下，生产1μmol肌苷酸的酶量定义为1单位。此外，将肌苷浓度从10μmol/ml变为100μmol/ml，在上述组成的反应条件下测定转磷酸活性，使用Hanes-Woolf作图法[Biochem.J.，26,1406(1932)]测定转磷酸活性中肌苷的速度常数。按照以下所述，对实施例15中所述的用来提高核苷-5’-磷酸酯的产量的突变型酶进行详细分析。随后发现，突变型酶对核苷的亲和性野生型酶的对核苷亲和性，提高了2倍。因此，本发明人认为，通过增加上述酶对核苷的亲和性，可以提高核苷-5’-磷酸酯的生产率，通过遗传工程技术，进一步修饰该酶。使用实施例15所述的含有得自Esherichiablattae的野生型酸性磷酸酶编码基因的质粒pEPI305，通过遗传工程技术将位点专一性突变导入该质粒DNA中，产生编码突变型酸性磷酸酶的基因。pEPI305为通过将用限制性内切酶ClaI和BamHI剪切并含有得自blattae埃希氏杆菌JCM6150野生型酸性磷酸酶编码基因的2.4KbpDNA片断连接到用ClaI和BamHI剪切的pBluescriptKS(+)(由Stratagene供应)上形成的质粒DNA。该酸性磷酸酶编码基因的碱基顺序由顺序表的SEQIDNO6表示。此外，由该碱基顺序得出的前体蛋白的氨基酸顺序由顺序表的SEQIDNO7表示。从纯化酶(实施例4中描述的)分析结果，推测出成熟蛋白的氨基酸顺序，用顺序表的SEQIDNO8表示。使用DNA合成仪(由AppliedBiosystem供应的394型)，用磷酰胺化物法合成具有顺序表中所示顺序的寡核苷酸MUT300(顺序表的SEQIDNO9)、MUT310(顺序表的SEQIDNO10)、MUT320(顺序表的SEQIDNO11)、MUT330(顺序表的SEQIDNO12)、MUT340(顺序表的SEQIDNO13)、MUT350(顺序表的SEQIDNO14)、MUT360(顺序表的SEQIDNO15)、MUT370(顺序表的SEQIDNO16)、MUT380(顺序表的SEQIDNO17)和MUT390(顺序表的SEQIDNO18)。将作为模板的1ngpEPI305、2.5μmolM13引物RV(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供应)、2.5μmol寡核苷酸MUT310和2.5单位TaqDNA聚合酶(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供应)加入含有200μMdATP、200μMdCTP、200μMdGTP、200μMdTTP、50mM氯化钾和1.5mM氯化镁的100μlTris-盐酸缓冲液(pH8.3)中。进行PCR，其中三步步骤-即在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复25次。在该反应中，使用PJ2000型热循环器(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供应)。另外，用1ngpEPI305作为模板、2.5μmolM13引物M3(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供应)作为引物和2.5μmol寡核苷酸MUT300同样进行PCR。通过用Microspin柱S-400(由Pharmacia供应)进行凝胶过滤纯化每种反应溶液，以除去引物。将1μl每种PCR溶液加入含有200μMdATP、200μMdCTP、200μMdGTP、200μMdTTP、50mM氯化钾和1.5mM氯化镁的95μl100mMTris-盐酸缓冲液(pH8.3)中。将混合物在94℃加热10分钟，然后在60分钟内冷却至37℃，在37℃保温15分钟，以形成异源双链。加入2.5单位TaqDNA聚合酶，在72℃下反应3分钟，以完成异源双链。随后，将2.5μmolM13引物RV和2.5μmolM13引物M3加入该反应溶液中，进行PCR反应，其中三步步骤-即在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复10次。将第二个PCR产物用ClaI和BamHI剪切，然后用苯酚和氯仿的混合物抽提，用乙醇沉淀。将该DNA片断连接到用ClaI和BamHI剪切的pBluescriptKS(+)上。用常规方法，用所得的质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供应)。将其在含有100μg/ml的氨苄青霉素的L琼脂培养基上铺平板，以获得转化体。用碱细菌裂解法从转化体中制备质粒，测定碱基顺序，鉴定出目的碱基已被替代。用Sanger等人的方法[J.Mol.Biol.，143，161(1980)]，用TaqDyeDeoxyTerminatorCycle测序药盒(由AppliedBiochemical供应)进行碱基顺序的测定。这样，产生编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸残基(GGG)用天冬氨酸残基(G*A*T)替代。该含突变型基因的质粒命名为pEPI310(实施例15)。用已导入突变的质粒作为模板重复上述步骤，以累积性地导入位点专一性突变。用碱细菌裂解法从转化体中制备质粒，测定碱基顺序，鉴定出目的碱基已被替代。所得的编码突变型磷酸酶的突变型基因和突变位点示于表12中。突变位点中的氨基酸残基表示用SEQIDNO8表示的成熟蛋白的氨基酸顺序中的一个氨基酸残基。表12<p>导入含突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330、大肠杆菌JM109/pEPI340、大肠杆菌JM109/pEPI350、大肠杆菌JM109/pEPI360、大肠杆菌JM109/pEPI370、大肠杆菌JM109/pEPI380、大肠杆菌JM109/pEPI390和大肠杆菌JM109/pEPI400以及已导入含有野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305中的每一种接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素和1mMIPTG的50mlL培养基中，在37℃培养16小时。通过离心，从每个菌株的2L培养液中收集细胞，用生理盐水溶液洗涤1次。将细胞悬浮于50ml100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在4℃下超声处理20分钟以破碎细胞。离心如此处理的溶液，以除去不溶部分，制备无细胞提取物。用实施例4描述的方法，从每种无细胞提取物中纯化每种酸性磷酸酶。每种酶产物在SDS-聚丙烯酰胺电泳中都是均一的。测定纯化的突变型酸性磷酸酶和野生型酸性磷酸酶转磷酸中的肌苷速度常数，结果示于表13中。我们发现，在实施例15中描述的、在大肠杆菌JM109/pEPI330中表达的提高核苷-5’-磷酸酯生产率的突变型酶，其Vmax降低，但它对肌苷的Km值大大降低，这意味着与在大肠杆菌JM109/pEPI305中表达的野生型酶相比，它对肌苷的亲和性增加2倍或2倍以上。这暗示着，该突变型酶的核苷-5’-磷酸酯的生产率大大提高，其原因不仅是因为其核苷酸酶活性降低，而且因为它对核苷的亲和性提高-这是一个重要因素。因此，我们预期，对核苷的亲和性提高导致生产率的提高。在已导入本实施例中产生的新突变型酶基因的大肠杆菌JM109中表达的新突变型酶表现出对核苷的亲和性比在实施例15中描述的大肠杆菌JM109/pEPI330中表达酶的亲和性更高。因此，我们预计核苷-5’-磷酸酯的生产率提高。此外，在大肠杆菌JM109/pEPI380中表达的突变型酶与野生型酶相比，不仅提高了对核苷的亲和性，而且也提高了Vmax值。另外，我们预计核苷-5’-磷酸酯的生产率提高。表13具有酶的菌株Km(mM)Vmax(单位/mg)大肠杆菌JM109/pEPI3052021.83大肠杆菌JM109/pEPI3301091.39大肠杆菌JM109/pEPI340851.03大肠杆菌JM109/pEPI350850.93大肠杆菌JM109/pEPI360551.33大肠杆菌JM109/pEPI370421.15大肠杆菌JM109/pEPI380422.60大肠杆菌JM109/pEPI390422.58大肠杆菌JM109/pEPI400432.11实施例20用含新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株生产5’-肌苷酸将已导入含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330、大肠杆菌JM109/pEPI340、大肠杆菌JM109/pEPI360、大肠杆菌JM109/pEPI370和大肠杆菌JM109/pEPI380中的每一种接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的50mlL培养基中，在37℃培养16小时。将焦磷酸(15g/dl)和8g/dl肌苷溶于乙酸盐缓冲液(pH4.0)中。在该溶液中加入已导入含有上述突变型酸性磷酸酶基因和野生型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到200mg/dl。反应在35℃下进行32小时，同时将pH保持在4.0，在整个过程中测定形成的5’-肌苷酸的量。形成的肌苷酸只是5’-肌苷酸，根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的生成。结果示于图8中。实施例15中描述的大肠杆菌JM109/pEPI330显示大量积累5’-肌苷酸。尽管仍有底物，但当5’肌苷酸的积累量达到7.5g/dl时5’-肌苷酸的产生停止，5’-肌苷酸的量不再增加。相反，含有新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株提供大量积累的5’-肌苷酸。尤其是，在使用大肠杆菌JM109/pEPI370和大肠杆菌JM109/pEPI380的反应中，提供更大量积累的5’-肌苷酸。此外，该反应速率高，表明5’-肌苷酸的生产率进一步大大提高。尤其是在大肠杆菌JM109/pEPI380中，反应速率高，表明相当高的反应性。实施例21用含新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株生产各种核苷-5’-磷酸酯将已导入含有新的突变型酸性磷酸酶基因质粒的大肠杆菌JM109/pEPI380接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的50mlL培养基中，在37℃培养16小时。将焦磷酸(15g/dl)和8g/dl作为磷酸基团受体的肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷溶于100mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)中。加入上述菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到100mg/dl。反应在35℃下进行12小时，同时将pH保持在4.0。生成的核苷-5’-磷酸酯的量示于表14中。用任何核苷都能很好地进行转磷酸，生成并积累相应的核苷-5’-磷酸酯。生成的核苷酸只是核苷-5’-磷酸酯，根本没有观察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副产物的生成。表14核苷产物产量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸12.05鸟苷5’-鸟苷酸5.78尿苷5’-尿苷酸13.28胞苷5’-胞苷酸10.65实施例22用含新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株和作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸将已导入含有新的突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI380接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的50mlL培养基中，在37℃培养16小时。将肌苷(6g/dl)和15g/dl三聚磷酸盐、多磷酸盐(“PolygonP”，ChiyodaKagakuK.K.产品的商品名)、苯乙酸二钠或氨甲酰磷酸二钠溶于100mM乙酸盐缓冲液(pH4.0)中。加入上述菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到100mg/dl。反应在35℃下进行12小时，同时将pH保持在4.0。生成的5’-肌苷酸的量示于表15中。用任何磷酸基团供体，都非常有效地生成并积累5’-肌苷酸。尤其使用多磷酸盐作为磷酸基团供体时，积累最大量的5’-肌苷酸。表15磷酸基团供体生成的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸钠10.84多磷酸钠13.35苯乙酸二钠12.84氨甲酰磷酸二钠12.42乙酰磷酸钾锂10.65实施例23得自斯托氏普罗威登斯菌染色体的酸性磷酸酶基因的分离和该基因核苷酸顺序的测定分别合成具有顺序表的SEQIDNO19和20中描述的核苷酸顺序的寡核苷酸PRPl和PRP2。在斯托氏普罗威登斯菌酸性磷酸酶编码基因的已知核苷酸顺序(EMBL数据库登记号X64820)基础上，设计这些寡核苷酸来扩增斯托氏普罗威登斯菌的酸性磷酸酶编码基因。按照Murray和Thomson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，从培养的斯托氏普罗威登斯菌ATCC29851的微生物细胞中提取染色体DNA。将染色体DNA(0.1ng)作为模板，寡核苷酸PRPl和PRP2(每种2.5μmol)作为引物以及TaqDNA聚合酶(2.5单位，由TakaraShuzo生产)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每种200μM)、氯化钾(50mM)和氯化镁(1.5mM)的100mMTris-盐酸缓冲液(pH8.3，100μl)中，进行PCR反应，其中一个循环包括在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复该循环30次。该反应溶液经过琼脂糖凝胶电泳，然后借助于玻璃粉(由TakaraShuzo生产)回收大约为1kbp的扩增的DNA片断。该基因片断用BamHI降解，与用BamHI降解的pUC118连接。按上述方法获得的质粒命名为pPRP100。测定导入pPRP100的转化体大肠杆菌JM109/pPRP100的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性。结果，菌株表现出将磷酸转移到核苷的活性以及磷酸单酯酶活性。按照碱裂解法，从大肠杆菌JM109/pPRP100转化体中提取质粒，以测定核苷酸顺序。一个测定的开放阅读框架的核苷酸顺序和从该核苷酸顺序得出的蛋白质的氨基酸顺序示于顺序表的SEQIDNO21和22中。开放阅读框架的核苷酸顺序与已知的斯托氏普罗威登斯菌酸性磷酸酶基因的核苷酸顺序完全吻合。实施例24得自产气肠杆菌、Planticola克雷伯氏杆菌和Serratiaficaria染色体的酸性磷酸酶基因的分离和这些基因的核苷酸顺序的测定按照Murray和Thomson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，从培养的产气肠杆菌IFO12010、KlebsiellaplanticolaIFO14939和SerrtiaficariaIAM13540的微生物细胞中提取染色体DNA。然后，按照实施例7(2)中描述的方法，构建包含大约20,000个大肠杆菌JM109转化体的染色体基因表达文库并进行筛选，获得表现转磷酸活性的转化体。我们认为这些转化体中的每个都包含得自每个原始菌株的酸性磷酸酶基因。按照碱裂解法，从认为具有得自产气肠杆菌IFO12010的酸性磷酸酶基因的一个大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，分析质粒内插入的DNA。上述质粒命名为pENP100。得自产气肠杆菌IFO12010的插入DNA的限制性内切酶图谱示于图9中。通过亚克隆具体分析酸性磷酸酶基因区的结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶SalI和KpnI剪切的1.6kbp片断中。然后，将该SalI-KpnI片断与用SalI和KpnI降解的pUC118连接，构建一个质粒。所得的质粒命名为pENP110。按照上述步骤，按照碱裂解法从认为具有得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的酸性磷酸酶基因的一个大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，分析质粒内插入的DNA。上述质粒命名为pKLP100。得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的插入DNA的限制性内切酶图谱示于图10中。通过亚克隆具体分析酸性磷酸酶基因区的结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶KpnI和EcoRI剪切的2.2kbp片断中。然后，将该KpnI-EcoRI片断与用KpnI和EcoRI降解的pUC118连接，构建一个质粒。所得的质粒命名为pKLP110。同样地，按照碱裂解法，从认为具有得自SerrtiaficariaIAM13540的酸性磷酸酶基因的一个大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，分析质粒内插入的DNA。上述质粒命名为pSEP100。得自SerrtiaficariaIAM13540的插入DNA的限制性内切酶图谱示于图11中。通过亚克隆具体分析酸性磷酸酶基因区的结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶HindIII剪切的1.4kbp片断中。然后，将该HindIII片断与用HindIII降解的pUC118连接，构建一个质粒。所得的质粒命名为pSEP110。然后，按照碱裂解法，从分别导入pENP110、pKLP110和pSEP110的转化体大肠杆菌JM109/pENP110、大肠杆菌JM109/pKLP110、大肠杆菌JM109/pSEP110中提取质粒DNA。按照实施例8描述的方法，测定这些质粒的插入核苷酸顺序。关于测定的插入的开放阅读框架的核苷酸顺序，产气肠杆菌IFO12010的示于SEQIDNO23中，KlebsiellaplanticolaIFO14939的示于SEQIDNO25中，而SerrtiaficariaIAM13540的示于SEQIDNO27中。另外，得出的氨基酸顺序分别示于SEQIDNO24、26和28中。因为包含这些质粒(含有这些片断)的转化体表现出转磷酸活性，因此鉴定出这些开放阅读框架为目的酸性磷酸酶基因。分别比较核苷酸顺序和得出的氨基酸顺序与已知顺序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的数据库。结果揭示出，在顺序表SEQIDNO23、25和27中描述的基因是新基因。我们假定由得自产气肠杆菌IFO12010的基因编码的蛋白质包含248个氨基酸残基，得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的基因编码的蛋白质包含248个氨基酸残基。而得自SerrtiaficariaIAM13540的基因编码的蛋白质包含244个氨基酸残基。一个可能性是，这些蛋白质可能同得自摩氏摩根氏菌和Esherichiablattae的酸性磷酸酶一样，为前体蛋白。从核苷酸顺序得出的氨基酸顺序以及在实施例8中获得的得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466酸性磷酸酶得出的氨基酸顺序、在实施例12中获得的得自EsherichiablattaeJCM1650酸性磷酸酶得出的氨基酸顺序以及斯托氏普罗威登斯菌的酸性磷酸酶的已知氨基酸顺序(EMBL登记号X64820)一起，示于图12中，用一个字母表示一个氨基酸残基。在所有氨基酸顺序中相同的氨基酸残基在图12的顺序下用星号表示。如图12所示，得自6个菌株的酸性磷酸酶的氨基酸顺序相互高度同源，在所有氨基酸顺序中，130个氨基酸残基是相同的。因此，我们假定这些酸性磷酸酶具有相似的功能。实施例25通过表达得自产气肠杆菌、Klebsiellaplanticola和Serratiaficaria的酸性磷酸酶基因放大活性将实施例23中构建的大肠杆菌JM109/pPRP100、实施例24中构建的大肠杆菌JM109/pENP110、大肠杆菌JM109/pKLP110和大肠杆菌JM109/pSEP110接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。通过离心，从这些培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.0)中，通过在4℃下超声处理20分钟破碎细胞。离心处理后的溶液，以除去不溶部分，由此制备无细胞提取物。测定获得的无细胞提取物的转磷酸活性，同时使用的对照是从斯托氏普罗威登斯菌ATCC29851、产气肠杆菌IFO12010、KlebsiellaplanticolaIFO14939、SerrtiaficariaIAM13540和按上述相同方法用质粒pUC118转化的大肠杆菌JM109。结果示于表16中。在所有野生型菌株中，转磷酸活性都低。在大肠杆菌JM109/pUC118中没有检测到转磷酸活性。另一方面，与野生型菌株相比，导入酸性磷酸酶基因的所有大肠杆菌JM109转化体表现出高转磷酸活性。按照该结果，证明每个导入的DNA片断都使得大肠杆菌高水平地表达酸性磷酸酶。表16微生物菌株转磷酸活性(单位/mg)斯托氏普罗威登斯菌ATCC298510.005产气肠杆菌IFO120100.002KlebsiellaplanticolaIFO149390.002SerrtiaficariaIAM135400.001大肠杆菌JM109/pUC118未检测到大肠杆菌JM109/pPRP1000.833大肠杆菌JM109/pENP1100.301大肠杆菌JM109/pKLP1100.253大肠杆菌JM109/pSEP1100.123实施例26温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶基因的制备如实施例20、21和22所描述的，实施例19中产生的含得自blattae埃希氏杆菌的突变型酸性磷酸酶基因的菌株表达相当量的酸性磷酸酶。在用该菌株由焦磷酸和肌苷生产5’-肌苷酸的过程中，以高转化率生成并积累5’-肌苷酸。该酸性磷酸酶的最适反应温度为35℃。然而，该反应在较高温度下进行时，反应速率增加，在反应溶液中增加磷酸受体核苷的浓度时，进行该反应。因此，我们预计，核苷-5’-磷酸酯在较短时间内可以更高效地生产。因此，通过用PCR位点专一性突变法，将突变导入实施例19中克隆的得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶基因时，提高了该酶的温度稳定性。使用含有实施例19中描述的得自EsherichiablattaeJCM1650的突变型酸性磷酸酶编码基因的质粒pEPI380，用遗传工程法，将位点专一性突变导入该质粒DNA中，产生温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶的编码基因。pEPI380是通过将含有得自EsherichiablattaeJCM1650的突变型酸性磷酸酶编码基因、用限制性内切酶ClaI和BamHI剪切的2.4kbpDNA片断与用ClaI和BamHI剪切的pBluescriptKS(+)(由Stratagene生产)连接而得到的质粒DNA。由该酸性磷酸酶编码基因的碱基顺序得出的成熟蛋白的氨基酸顺序推测为实施例19的表12中所示的11个氨基酸残基，用顺序表的SEQIDNO8的顺序来表示。用磷酰胺化物法，使用DNA合成仪(AppliedBiosystems供应的394型)合成具有顺序表中所示顺序的寡核苷酸MUT300(顺序表中的SEQIDNO9)、MUT400(顺序表中的SEQIDNO29)和MUT410(顺序表中的SEQIDNO30)。用PCR法按实施例15的方法，使用实施例19描述的pEPI380作为模板，用MUT300和MUT410作为引物导入突变，产生编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第104位谷氨酸残基(GAG)用甘氨酸残基(GG*T*)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI410。同样地，使用pEPI380作为模板，用MUT300、MUT310和MUT420作为引物导入突变，产生编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中第151位苏氨酸残基(ACC)用丙氨酸残基(G*CC)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI420。从导入含有突变型型磷酸酶基因的质粒pEPI410和pEPI420的大肠杆菌JM109转化体中，用碱细菌裂解法制备质粒，测定碱基顺序，鉴定出目的碱基己被替代。将导入本实施例中制备的突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420和实施例19中描述的大肠杆菌JM109/pEPI380中的每一种接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的50mlL培养基中，在37℃培养16小时。从每个菌株的50ml培养液中收获细胞，用生理盐水溶液洗涤1次。将这些细胞悬浮于5ml100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在4℃下超声处理20分钟，以破碎细胞。离心如此处理的溶液，以除去不溶部分，制备无细胞提取物。从每个菌株制备的无细胞提取物在0-80℃、pH7.0下保温30分钟。保温完成后，在pH4.0、30℃下的标准反应条件下，用在不同温度下处理的无细胞提取物进行转磷酸，测定残留活性。结果示于图13中。在实施例19中描述的大肠杆菌JM109/pEPI380中表达的突变型酶在40℃30分钟的处理中稳定，但在较高温度下观察到其活性的降低。相反，在导入本实施例中产生的新突变型酶基因的大肠杆菌JM109/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420中表达的新突变型酶提高了温度稳定性，即使在50℃处理30分钟，也没有观察到活性的降低。因此我们预计，使用这些菌株在高温下生产核苷-5’-磷酸酯时，生产率进一步提高。实施例27用含有温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶基因的菌株生产5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸将已导入突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JMI09/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420和实施例19中描述的大肠杆菌JM109/pEPI380中的每一种接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mMIPTG的50mlL培养基中，在37℃培养16小时。将焦磷酸(15g/dl)和8g/dl肌苷或鸟苷溶于乙酸盐缓冲液(pH4.0)中。加入已导入每种突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到100mg/dl。反应在50℃下进行9小时，同时将pH保持在4.0，测定生成的5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸的量。结果示于表17中。生成的核苷磷酸酯只有核苷-5’-磷酸酯，根本没有观察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副产物的产生。反应也在35℃下进行12小时，用大肠杆菌JM109/pEPI380菌株作为对照。结果也示于表17中。如实施例21所述，用大肠杆菌JM109/pEPI380高效地生成并积累核苷-5’-磷酸酯。相反，用导入了实施例26制备的得自Esherichiablattae的新突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420进行反应，在较短时间内生成并积累等量的5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。因此，可以更有效地生产核苷-5’-磷酸酯。尤其当使用大肠杆菌JM109/pEPI420时，不仅反应时间缩短，而且大量积累5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸，表现出相当高的生产率。表17</tables>图1描述了反应pH和在用得自摩氏摩根氏菌的酶进行的反应中5’-肌苷酸的产生量之间的关系。图2描述了反应pH和在用得自Esherichiablattae的酶进行的反应中5’-肌苷酸的产生量之间的关系。图3描述了含有酸性磷酸酶编码基因的摩氏摩根氏菌染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。图4描述了在用包含得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。图5描述了含有酸性磷酸酶编码基因的Esherichiablattae染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。图6描述的图表示在用包含得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。图7分别描述了在用包含野生型酸性磷酸酶基因的菌株和包含得自Esherichiablattae的突变型酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。图8描述了在用包含得自Esherichiablattae的新突变型酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。图9描述了含有酸性磷酸酶编码基因、得自产气肠杆菌的染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。图10描述了含有酸性磷酸酶编码基因、得自Planticola克雷伯氏杆菌的染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。图11描述了含有酸性磷酸酶编码基因、得自Serratiaficaria的染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。图12描述了由得自摩氏摩根氏菌、Esherichiablattae、斯托氏普罗威登斯菌、产气肠杆菌、Planticola克雷伯氏杆菌和Serratiaficaria的酸性磷酸酶的核苷酸顺序得出的氨基酸顺序，用一个字母表示一个氨基酸残基。这些氨基酸顺序在顿序表的SEQIDNO4、8、22、24、26和28中进行了描述，用三个字母表示一个氨基酸残基。在该图中，在所有氨基酸顺序中相同的氨基酸残基在顺序下用*标记。图13描述了在从包含得自Esherichiablattae的新突变型酸性磷酸酶基因的菌株中制备的无细胞提取物中，酸性磷酸酶活性的温度稳定性曲线。顺序表SEQIDNO1的资料(i)顺序特性(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型多肽(v)蛋白质片断类型N-末端(vi)来源(A)有机体摩氏摩根氏菌(B)菌株NICMB10466(xi)顺序描述SEQIDNO1AlaIleProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysProAspLeuTyrTyr151015LeuLysAsnGlu20SEQIDNO2的资料(i)顺序特性(A)长度750个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)有机体摩氏摩根氏菌(B)菌株NICMB10466(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1...747(ix)特征(A)名称/关键词信号肽(B)位置1...60(ix)特征(A)名称/关键词成熟多肽(B)位置61...747(xi)顺序描述SEQIDNO2ATGAAGAAGAATATTATCGCCGGTTGTCTGTTCTCACTGTTTTCCCTT48MetLysLysAsnIleIleAlaGlyCysLeuPheSerLeuPheSerLeu-20-15-10-5TCCGCGCTGGCCGCGATCCCGGCGGGCAACGATGCCACCACCAAGCCG96SerAlaLeuAlaAlaIleProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro1510GATTTATATTATCTGAAAAATGAACAGGCTATCGACAGCCTGAAACTG144AspLeuTyrTyrLeuLysAsnGluGlnAlaIleAspSerLeuLysLeu152025TTACCGCCACCGCCGGAAGTCGGCAGTATTCAGTTTTTAAATGATCAG192LeuProProProProGluValGlySerIleGlnPheLeuAsnAspGln303540GCAATGTATGAGAAAGGCCGTATGCTGCGCAATACCGAGCGCGGAAAA240AlaMetTyrGluLysGlyArgMetLeuArgAsnThrGluArgGlyLys45505560CAGGCACAGGCAGATGCTGACCTGGCCGCAGGGGGTGTGGCAACCGCA288GlnAlaGlnAlaAspAlaAspLeuAlaAlaGlyGlyValAlaThrAla657075TTTTCAGGGGCATTCGGCTATCCGATAACCGAAAAAGACTCTCCGGAG336PheSerGlyAlaPheGlyTyrProIleThrGluLysAspSerProGlu808590CTGTATAAACTGCTGACCAATATGATTGAGGATGCCGGTGATCTTGCC384LeuTyrLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla95100105ACCCGCTCCGCCAAAGAACATTACATGCGCATCCGGCCGTTTGCGTTT432ThrArgSerAlaLysGluHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe110115120TACGGCACAGAAACCTGTAATACCAAAGATCAGAAAAAACTCTCCACC480TyrGlyThrGluThrCysAsnThrLysAspGlnLysLysLeuSerThr125130135140AACGGATCTTACCCGTCAGGTCATACGTCTATCGGCTGGGCAACCGCA528AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla145150155CTGGTGCTGGCGGAAGTGAACCCGGCAAATCAGGATGCGATTCTGGAA576LeuValLeuAlaGluValAsnProAlaAsnGlnAspAlaIleLeuGlu160165170CGGGGTTATCAGCTCGGACAGAGCCGGGTGATTTGCGGCTATCACTGG624ArgGlyTyrGlnLeuGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp175180185CAGAG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IleThrGluLysAspAlaProGlu100105110IleHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ThrArgSerAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TyrGlyValAlaThrCysAsnThrLysAspGlnAspLysLeuSerLys145150155160AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrAlaIleGlyTrpAlaSerAla165170175LeuValLeuSerGluIleAsnProGluAsnGlnAspLysIleLeuLys180185190ArgGlyTyrGluLeuGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValAlaSerGlyAlaValAla210215220ThrLeuHisSerAsnProGluPheGlnLysGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240AspGluPheAlaLysLeuLysLys245SEQIDNO23的资料(i)顺序特性(A)长度744个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)有机体产气肠杆菌(B)菌株IFO12010(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1...744(xi)顺序描述SEQIDNO23ATGAAAAAGCGCGTTCTCGCCCTCTGCCTCGCCAGCCTGTTTTCCGTT48MetLysLysArgValLeuAlaLeuCysLeuAlaSerLeuPheSerVal151015AACGCTTTCGCGCTGGTCCCTGCCGGCAATGATGCAACCACCAAACCG96AsnAlaPheAlaLeuValProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro202530GATCTCTATTATCTGAAAAATGCACAGGCCATCGATAGTCTGGCGCTG144AspLeuTyrTyrLeuLysAsnAlaGlnAlaIleAspSerLeuAlaLeu354045TTGCCGCCGCCGCCGGAAGTTGGCAGCATCGCATTTTTAAACGATCAG192LeuProProProProGluValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln505560GCGATGTATGAGAAAGGACGGCTGTTGCGCAATACCGAACGTGGCAAG240AlaMetTyrGluLysGlyArgLeuLeuArgAsnThrGluArgGlyLys65707580CTGGCGGCTGAAGATGCTAACCTGAGCGCCGGCGGCGTCGCGAATGCC288LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerAlaGlyGlyValAlaAsnAla859095TTCTCCAGCGCTTTTGGTTCGCCCATCACCGAAAAAGACGCGCCGCAG336PheSerSerAlaPheGlySerProIleThrGluLysAspAlaProGln1001051l0TTACATAAGCTGCTGACAAATATGATTGAGGATGCCGGCGATCTGGCC384LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ACCCGCAGCGCGAAAGAGAAATATATGCGCATTCGCCCGTTTGCGTTC432ThrArgSerAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TACGGCGTTTCAACCTGTAACACTACCGAGCAGGACAAGCTGTCGAAA480TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys145150155160AACGGATCTTACCCTTCCGGCCATACCTCTATCGGTTGGGCAACCGCG528AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla165170175CTGGTACTGGCGGAGATCAATCCGCAGCGGCAAAACGAAATTCTCAAA576LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys180185190CGCGGCTATGAATTGGGCGAAAGCCGGGTTATCTGCGGCTATCATTGG624ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205CAGAGCGATGTCGATGCGGCGCGGATAGTCGGCTCGGCGGTGGTGGCG672GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaValValAla210215220ACCCTGCATACCAACCCGGCCTTCCAACAGCAGTTGCAGAAAGCAAAG720ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGlnGlnGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240GATGAATTCGCCAAAACGCAGAAGTAA747AspGluPheAlaLysThrGlnLys245SEQIDNO24的资料(i)顺序特性(A)长度248个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)有机体产气肠杆菌(B)菌株IFO12010(xi)顺序描述SEQIDNO24MetLysLysArgValLeuAlaLeuCysLeuAlaSerLeuPheSerVal151015AsnAlaPheAlaLeuValProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro202530AspLeuTyrTyrLeuLysAsnAlaGlnAlaIleAspSerLeuAlaLeu354045LeuProProProProGluValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln505560AlaMetTyrGluLysGlyArgLeuLeuArgAsnThrGluArgGlyLys65707580LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerAlaGlyGlyValAlaAsnAla859095PheSerSerAlaPheGlySerProIleThrGluLysAspAlaProGln100105110LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ThrArgSerAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys145150155160AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla165170175LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys180185190ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaValValAla210215220ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGlnGlnGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240AspGluPheAlaLysThrGlnLys245SEQIDNO25的资料(i)顺序特性(A)长度747个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)有机体Klebsiellaplanticola(B)菌株IFO14939(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1...747(xi)顺序描述SEQIDNO25ATGAAAAAGCGTGTACTCGCCCTTTGCCTTGCCAGCCTCTTTTCAGTT48MetLysLysArgValLeuAlaLeuCysLeuAlaSerLeuPheSerVal151015AGCGCCTTTGCGCTGGTTCCCGCCGGCAATGATGCCACCACCAAGCCC96SerAlaPheAlaLeuValProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro202530GATCTCTACTATCTGAAAAATGCCCAGGCCATTGACAGCCTGGCGCTG144AspLeuTyrTyrLeuLysAsnAlaGlnAlaIleAspSerLeuAlaLeu354045TTGCCACCGCCGCCGGAAGTGGGCAGCATTGCGTTTTTAAACGATCAG192LeuProProProProGluValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln505560GCGATGTATGAGAAAGGCCGTCTGCTGCGCGCCACCGCCCGCGGCAAG240AlaMetTyrGluLysGlyArgLeuLeuArgAlaThrAlaArgGlyLys65707580TTGGCGGCAGAAGATGCCAACCTGAGCGCGGGTGGCGTGGCCAACGCC288LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerAlaGlyGlyValAlaAsnAla859095TTCTCCGCAGCATTCGGCTCCCCGATCAGCGAAAAAGACGCCCCGGCG336PheSerAlaAlaPheGlySerProIleSerGluLysAspAlaProAla100105110CTGCACAAACTGCTCACCAACATGATTGAAGACGCGGGCGATCTGGCG384LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ACCCGAGGCGCGAAAGAGAAGTATATGCGTATTCGTCCGTTTGCCTTC432ThrArgGlyAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TACGGCGTGTCCACCTGCAATACCACCGAACAGGATAAGCTGTCGAAA480TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys145150155160AACGGCTCCTACCCTTCCGGACACACCTCTATCGGCTGGGCGACCGCC528AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla165170175CTGGTGCTGGCCGAAATCAACCCGCAGCGCCAGAATGAGATTCTCAAG576LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys180185190CGCGGCTATGAGCTCGGTGAAAGTCGGGTGATCTGCGGTTACCACTGG624ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205CAGAGCGATGTTGACGCCGCGCGGATTGTCGGCTCGGCGGTGGTTGCA672GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaValValAla210215220ACCCTGCATACCAATCCGGCCTTCCAGCAGCAGCTGCAAAAAGCCAAA720ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGlnGlnGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240GACGAGTTTGCGAAACAGCAGAAATAG747AspGluPheAlaLysGlnGlnLys245SEQIDNO26的资料(i)顺序特性(A)长度248个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)有机体Klebsiellaplanticola(B)菌株IFO14939(xi)顺序描述SEQIDNO26MetLysLysArgValLeuAlaLeuCysLeuAlaSerLeuPheSerVal151015SerAlaPheAlaLeuValProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro202530AspLeuTyrTyrLeuLysAsnAlaGlnAlaIleAspSerLeuAlaLeu354045LeuProProProProGluValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln505560AlaMetTyrGluLysGlyArgLeuLeuArgAlaThrAlaArgGlyLys65707580LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerAlaGlyGlyValAlaAsnAla859095PheSerAlaAlaPheGlySerProIleSerGluLysAspAlaProAla100105110LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ThrArgGlyAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys145150155160AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla165170175LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys180185190ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaValValAla210215220ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGlnGlnGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240AspGluPheAlaLysGlnGlnLys245SEQIDNO27的资料(i)顺序特性(A)长度735个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)有机体Serratiaficartia(B)菌株IAM13540(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1...732(xi)顺序描述SEQIDNO27ATGAAAAAAATATTATTAGCCACATTAAGCTGCGCCGCGTTGACGCAG48MetLysLysIleLeuLeuAlaThrLeuSerCysAlaAlaLeuThrGln151015TTTTCCTTTGCCGCCAAAGATGTCACTACCCACCCTGAGGTTTATTTT96PheSerPheAlaAlaLysAspValThrThrHisProGluValTyrPhe202530CTGCAAGAATCACAGTCCATCGACAGCCTGGCACTATTGCCGCCGCCG144LeuGlnGluSerGlnSerIleAspSerLeuAlaLeuLeuProProPro354045CCGGCGATGGACAGCATTGATTTCCTGAATGACAAAGCGCAATACGAC192ProAlaMetAspSerIleAspPheLeuAsnAspLysAlaGlnTyrAsp505560GCCGGGAAAATAGTGCGCAATACTCCGCGTGGCAAGCAGGCTTATGAT240AlaGlyLysIleValArgAsnThrProArgGlyLysGlnAlaTyrAsp65707580GACGCCCACGTTGCCGGGGACGGCGTTGCCGCCGCATTTTCCAACGCC288AspAlaHisValAlaGlyAspGlyValAlaAlaAlaPheSerAsnAla859095TTCGGCCTAGAAATAGCCCAACGGAAAACGCCGGAGCTGTTTAAGCTG336PheGlyLeuGluIleAlaGlnArgLysThrProGluLeuPheLysLeu100105110GTGATGAAAATGCGTGAAGACGCCGGCGATTTGGCGACCCGCAGCGCC384ValMetLysMetArgGluAspAlaGlyAspLeuAlaThrArgSerAla115120125AAAAATCACTATATGCGCATTCGCCCCTTTGCGTTTTATAACGAAGCG432LysAsnHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPheTyrAsnGluAla130135140ACCTGCCGACCGGACGAAGAAAGCACCCTGTCGAAGAACGGTTCTTAC480ThrCysArgProAspGluGluSerThrLeuSerLysAsnGlySerTyr145150155160CCTTCCGGCCATACCACCATCGGCTGGGCGACCGCGCTGGTGCTGGCT528ProSerGlyHisThrThrIleGlyTrpAlaThrAlaLeuValLeuAla165170175GAAATCAACCCCGCCAGGCAGGGTGAAATCCTGCAGCGCGGCTATGAT576GluIleAsnProAlaArgGlnGlyGluIleLeuGlnArgGlyTyrAsp180185190ATGGGCCAAAGCCGGGTTATCTGCGGTTATCACTGGCAAAGCGACGTG624MetGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrpGlnSerAspVal195200205ACTGCGGCGCGCATGGCGGCGTCGGCCATGGTGGCGCGTTTGCATGCC672ThrAlaAlaArgMetAlaAlaSerAlaMetValAlaArgLeuHisAla210215220GAACCCACCTTCGCCGCCCAGCTGCAAAAGGCCAAAGACGAATTCAAC720GluProThrPheAlaAlaGlnLeuGlnLysAlaLysAspGluPheAsn225230235240GGCCTGAAAAAGTAA735GlyLeuLysLysSEQIDNO28的资料(i)顺序特性(A)长度244个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)有机体Serratiaficartia(B)菌株IAM13540(xi)顺序描述SEQIDNO28MetLysLysIleLeuLeuAlaThrLeuSerCysAlaAlaLeuThrGln151015PheSerPheAlaAlaLysAspValThrThrHisProGluValTyrPhe202530LeuGlnGluSerGlnSerIleAspSerLeuAlaLeuLeuProProPro354045ProAlaMetAspSerIleAspPheLeuAsnAspLysAlaGlnTyrAsp505560AlaGlyLysIleValArgAsnThrProArgGlyLysGlnAlaTyrAsp65707580AspAlaHisValAlaGlyAspGlyValAlaAlaAlaPheSerAsnAla859095PheGlyLeuGluIleAlaGlnArgLysThrProGluLeuPheLysLeu100105110ValMetLysMetArgGluAspAlaGlyAspLeuAlaThrArgSerAla115120125LysAsnHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPheTyrAsnGluAla130135140ThrCysArgProAspGluGluSerThrLeuSerLysAsnGlySerTyr145150155160ProSerGlyHisThrThrIleGlyTrpAlaThrAlaLeuValLeuAla165170175GluIleAsnProAlaArgGlnGlyGluIleLeuGlnArgGlyTyrAsp180185190MetGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrpGlnSerAspVal195200205ThrAlaAlaArgMetAlaAlaSerAlaMetValAlaArgLeuHisAla210215220GluProThrPheAlaAlaGlnLeuGlnLysAlaLysAspGluPheAsn225230235240GlyLeuLysLysSEQIDNO29的资料(i)顺序特性(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它DNA...合成DNA(iii)假设否(iv)反义否(xi)顺序描述SEQIDNO29CCCGGCGTCACCAATCATATT21SEQIDNO30的资料(i)顺序特性(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它DNA...合成DNA(iii)假设否(iv)反义否(xi)顺序描述SEQIDNO30GCCGGTAGAGGCATGCCCGGA2权利要求1.生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括让对核苷具有较高亲和性和/或较高温度稳定性的酸性磷酸酶，在pH3.0-5.5条件下作用于核苷和磷酸基团供体，生产并收集核苷-5’-磷酸酯。2.生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括让微生物在pH3.0-5.5条件下作用于核苷和磷酸基团供体，生产并收集核苷-5’-磷酸酯；其中微生物用包含对核苷具有较高亲和性和/或较高温度稳定性的酸性磷酸酶编码基因的重组DNA转化。3.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中对核苷的Km值低于100mM。4.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中酸性磷酸酶在50℃下是稳定的。5.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶得自属于埃希氏杆菌属、摩根氏菌属、普罗威登斯菌属、肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属或沙雷氏菌属的细菌。6.按照权利要求5的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中酸性磷酸酶包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序基本相同，所述酸性磷酸酶在选自顺序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序上具有一个突变，该突变提高了对核苷的亲和性和/或温度稳定性。7.按照权利要求5的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中所述突变选自顺序表的SEQIDNO8中的第63位亮氨酸残基、第65位丙氨酸残基、第66位谷氨酸残基、第69位天冬氨酸残基、第71位丝氨酸残基、第72位丝氨酸残基、第74位甘氨酸残基、第85位丝氨酸残基、第92位丙氨酸残基、第94位丙氨酸残基、第104位谷氨酸残基、第116位天冬氨酸残基、第130位丝氨酸残基、第135位苏氨酸残基、第136位谷氨酸残基、第151位苏氨酸残基和/或第153位异亮氨酸残基用另一氨基酸的替代。8.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中磷酸基团供体选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐。9.一种突变型酸性磷酸酶，它包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序基本相同，所述酸性磷酸酶在选自顺序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序上具有一个突变，该突变提高对核苷的亲和性和/或温度稳定性。10.按照权利要求9的一种突变型酸性磷酸酶，其中所述突变选自顺序表的SEQIDNO8中的第63位亮氨酸残基、第65位丙氨酸残基、第66位谷氨酸残基、第69位天冬氨酸残基、第71位丝氨酸残基、第72位丝氨酸残基、第74位甘氨酸残基、第85位丝氨酸残基、第92位丙氨酸残基、第94位丙氨酸残基、第104位谷氨酸残基、第116位天冬氨酸残基、第130位丝氨酸残基、第135位苏氨酸残基、第136位谷氨酸残基、第151位苏氨酸残基和/或第153位异亮氨酸残基用另一氨基酸的替代。11.按权利要求9定义的酸性磷酸酶的编码基因。12.包含按权利要求11定义的基因的重组DNA。13.包含按权利要求12定义的重组DNA的微生物。全文摘要通过用生化方法将核苷磷酸化,便宜并高效地生产核苷－5’－磷酸酯的方法。通过使酸性磷酸酶、尤其是对核苷具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的酸性磷酸酶以及导入具有所述酸性磷酸酶活性的蛋白质编码基因的微生物,在pH3.0—5.5条件下作用于核苷和磷酸基团供体(选自聚磷酸或其盐、苯膦酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)产生并收集核苷－5’－磷酸酯,生产核苷－5’－磷酸酯。文档编号C12N15/00GK1184157SQ9712293公开日1998年6月10日申请日期1997年11月21日优先权日1996年11月21日发明者三原康博,宇多川隆,山田秀明,浅野泰久申请人:味之素株式会社