专利名称：：发酵生产l－氨基酸的方法
技术领域：
：本发明是有关微生物工业的发明。更确切地说，本发明涉及通过发酵生产L-氨基酸的方法，以及在该方法中所使用的一种DNA及微生物体。现有技术当通过发酵生产L-赖氨酸时，已经从自然界及合成菌株中分离出了一些用来提高产量的菌株。已知大量产赖氨酸的合成突变体，其中大部分为具氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性且属于短杆菌属，棒状杆菌属，芽孢杆菌属或埃希氏杆菌属的菌株。而且，也使用了由重组DNA得到的转化子(如美国专利No.4,278,765)。这样，许多用来提高氨基酸产量的技术已被公开。例如，在日本公开文本(Kokai)No.18,596/1981，美国公开文本No.4,346,170及应用微生物和生物技术15，227(1982)两期刊中公开了一种涉及埃希氏菌属的方法，该方法通过增加二羟二吡啶二羧酸合成酶(下文有时简称为“DDPS”的作用来生产L-赖氨酸。这种酶(DDPS)能够催化天冬氨酸半醛和丙酮酸脱水缩合形成二羟二吡啶二羧酸。这一反应是生物合成天冬氨酸类的氨基酸反应中进入L-赖氨酸生物合成系统中的起始反应。已知在埃希氏菌属的细菌中进行L-赖氨酸生物合成时，该酶和天冬氨酸激酶共同起着重要的调节位点的作用。DDPS由E.coli中dapA基因编码。dapA已被克隆，碱基序列已被确定[Richaud，F.等人，细菌学杂志，297(1986)]同时，天冬氨酸激酶(下文有时简称“AK”)催化天冬氨酸转化为β-磷酸天冬氨酸，且在天冬氨酸类氨基酸的生物合成系统中是一个重要的调节酶。E.coli的AK有三种类型(AKI，AKII，AKIII)，其中两种分别是与高丝氨酸脱水酶(以下有时简称“HD”)构成的结合酶。其中一种结合酶为AKI-HDI，由thrA基因编码；另一种是AKII-HDII，由metLM基因编码。AKI被苏氨酸所抑制且被苏氨酸和异亮氨酸协同抑制，AKII被甲硫氨酸所抑制。同时，AKIII是一种具有单一功能的酶，它是由LysC基因编码产生的。已知L-赖氨酶对它有抑制和反馈抑制作用。这三种酶在细胞中的活性比约为AKI∶AKII∶AKIII≈5∶1∶4。E.coli的Lyc基因已被克隆，且碱基序例已被确定出来[Cassan，M，Parsof，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志2611052(1986)]。国际专利号为WO95/16042的公开文本公开了一种生产L-赖氨酸的方法，该方法是使E.coli含有发生突变的dapA和Lysc基因，这种突变能够消除赖氨酸的反馈抑制效应。用发酵法生产L-苏氨酸时，所用的微生物是从自然界分离出来的菌株或其突变株。已知大量的生产L-苏氨酸的合成突变体，其中大部分对α-氨基-β-羟基咸酸具有抗性，属于埃希氏菌属，沙雷氏菌属，短杆菌属或棒状杆菌属。在日本公开文本(Kokai)Nos.131,397/1980,31,691/1984及15,696/1981及日本专利公告(No.501,682/1991)中描述了一种涉及埃希氏菌属的生产L-苏氨酸的方法，该方法用含有苏氨酸启动子的重组质粒转化埃希氏菌属的菌株生产L-苏氨酸。而且，国际专利号为WO94/11517的专利公开了一种用含有LYsC基因的E.coli来生产L-苏氨酸的方法，该突变能消除赖氨酸的反馈抑制。本发明所要解决的问题本发明的目的是要从那些将L-赖氨酸反馈抑制作用消除得较好的埃希氏菌属中获得AKIII，并提供一种比现有技术更好的发酵生产L-氨基酸的方法。解决存在问题的方法发明人经过努力研究分析了上述问题，并最终成功地从那些将L-赖氨酸反馈抑制作用消除得较好的埃希氏菌属中获得了编码AKII的DNA。在本发明中，将这种从埃希氏菌属中获得的编码AKIII的DNA在本发明中有时称为突变LysC基因或突变AKIII基因。从那些将L-赖氨酸反馈抑制作用消除得较好的E.coli中获得的编码DDPS的DNA在本发明中有时被叫做突变dapA基因或突变DDPS基因。发明人进一步获得了细胞中含有突变lysC基因的埃希氏菌属的细菌，并且发现L-赖氨酸和L-苏氨酸能够在培养基中大量产生并积累。这样，本发明涉及编码埃希氏菌属细菌的天冬氨酸激酶的DNA特征是该编码区的突变能够消除赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制作用，所述突变为天冬氨酸基酶III的318位甲硫氨酸残基被另一氨基酸残基取代且323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，第325位亮氨酸残基被另一氨基酸残基所取代且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基所取代且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，325位亮氨酸残基被另一氨基酸残基所取代且345位丝氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基所取代和358位丝氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，344位苏氨酸被另一氨基酸残基所取代的突变，250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，346位谷氨酸残基和347位亮氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，250位谷氨酸残基和364位苏氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，202位天冬氨酸残基和321位丝氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，283位精氨酸残基，333位丙氨酸残基，338位丝氨酸残基，346位谷氨酸残基及414位天冬氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，或者是318位甲硫氨酸残基，321位丝氨酸残基，328位缬氨酸残基，349位缬氨酸残基及405位谷氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变。本发明涉及编码埃希氏菌属细菌的天冬氨酸激酶的DNA，特征是该编码区突变能够消除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制作用，所述突变为如下突变时效果更好天冬氨酸激酶III的318位甲硫氨酸残基被异亮氨酸残基取代且323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代，325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代且347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基取代，325位亮氨酸残基被苯氨酸残基取代且345位丝氨酸残基被亮氨酸残基取代，323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且358位丝氨酸残基被亮氨酸残基取代，344位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基取代，250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，346位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且347位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且364位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代，202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且321位丝氨酸被脯氨酸残基所取代，283位精氨酸残基被丝氨酸残基所取代，333位丙氨酸残基被苏氨酸残基取代，338位丝氨酸残基被苏氨酸残基取代，346位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代且414位精氨酸残基被丝氨酸残基取代，或者318位甲硫氨酸残基被赖氨酸残基取代，321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代，328位缬氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，349位缬氨酸被甘氨酸残残取代且405位谷氨酸残基被缬氨酸残基取代。本发明涉及上述重组DNA，该重组DNA通过将权利要求1所述的DNA联接到埃希氏菌属中细菌细胞内具有自我复制能力的载体DNA上获得，也可以是含有这种载体DNA的埃希氏菌属的微生物中。本发明涉及一种生产L-氨基酸的方法，包括在发酵培养基中培养上述具有产生L-氨基酸能力的微生物，在培养基中生产、积累一种L-氨基酸以及从培养基中收集L-氨基酸。在本说明书，编码DDPS或AKIII的DNA或含有这一区段及启动子的DNA有时被称为“DDPS基因”或“AKIII基因”。而且，被消除了反馈抑制作用的突变酶有时被简单地称作“一种突变酶”，而且编码这一功能或含有相同功能区段及启动子的DNA被叫做“一个突变基因”。进一步说，“消除L-赖氨酸的反馈抑制”应理解为大部分清除，并且并不需要完全消除。以下是对本发明的详细描述。<1>本发中编码突变天冬氨酸激酶(AKIII)的DNA本发明中编码突变天冬氨酸激酶(AKIII)的DNA是编码野生型AKIII的DNA发生突变，该突变使L-赖氨酸对AKIII的反馈抑制被消除。本发明提到了由埃希氏菌属的细菌中获得的AKIII，特别提到由E.coli中获得AKIII。消除L-赖氨酸对AKIII的反馈抑制的突变氨基酸序列范围是如序列表中1号序列所示的AKIII序列，从AKIII的N-末端开起算起。(a)天冬氨酸激酶的突变位点是318位的甲硫氨酸残基被另一个氨基酸残基所取代，最好是异亮氨酸残基而且323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是天冬氨酸残基，(b)突变是325位的亮氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苯丙氨酸残基，而且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甲硫氨酸残基，(c)突变是323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是天冬氨酸残基，而且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甲硫氨酸残基，(d)突变是325位亮氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苯丙氨酸残基，而且345位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是亮氨酸残基，(e)突变是323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是天冬氨酸残基，并且358位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是亮氨酸残基，(f)突变是344位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甲硫氨酸残基，(g)突变是250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是赖氨酸残基，(h)突变是346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是赖氨酸残基，并且347位亮氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苯丙氨酸残基，(i)突变是250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是赖氨酸残基，并且364位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用甲硫氨酸残基，(j)突变是202位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甘氨酸残基，并且321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基所取代，最好用脯氨酸残基，(k)突变是283位的精氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是丝氨酸残基，333位丙氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苏氨酸残基，338位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苏氨酸残基，346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用天冬氨酸残基，并且414位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用丝氨酸残基，或者(l)突变是318位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用赖氨酸残基，321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用脯氨酸，328位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用苯丙氨酸，349位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用甘氨酸残基，405位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用缬氨酸残基。编码野生型AKIII的DNA并非十分有限。已经提到过从埃希氏菌属一例如大肠杆菌(E.coli)中得到了编码AKIII的DNA。特别提到的是，由编码如序列No.1所示的氨基酸序列的DNA，进一步说即在序列No.1中所学的碱基序列的碱基Nos.584到1930。E.coli的AKIII由lysC基因编码。上边提到的序列中，含有引起氨基酸残基被取代的突变碱基序列的就是编码本发明的突变AKIIII的序列。一种编码相应氨基酸残基的密码子并不仅限于编码那一种氨基酸残基。野生型AKIII的氨基酸序列随细菌或菌株的差异而略有不同。即使序列中不影响酶活性的氨基酸残基位点发生了取代，失活、插入等变化，也应视为属于本发明的突变AKIII基因中。例如，在例1中得到的野生型lysC基因的碱基序列(序列No.1)与公知的E.coliK-12JC411菌株的序列(Cassan，M.，Parsot.C.，Cohen.G、N.，和Patte，J、C.，生物化学杂志、261，1052(1986)]相比较，有6个位点不相同。编码的氨基酸残基在6位点中有两个位点是不同的(在JC411菌株的LysC中，由序列No.1表示的lysC氨基的序列从N-末端开始的第58个甘氨酸残基由半胱氨酸残基取代且401个甘氨酸残基由一丙氨酸残基所取代。如果将上述(a)到(l)的突变引入E.coliK-12JC411菌株的相同lysC序列中，可预期得到消除L-氨酸反馈抑制的突变lysC。编码消除赖氨酸反馈抑制的突变AKIII的DNA是通过如下方法获得的。首先，在体外对含有野生型AKIII因或有其它突变的AKIII基因进行诱变处理，将被诱变的基因连接到适于某种宿主的载体DNA上从而形成重组DNA。将重组DNA导入一种微生物宿主中从而得到转化子。当选择出表达突变AKIII的转化子时，表明该转化子含有该突变基因。然后，将含有野生型AKIII基因或有其他位点突变的AKIII基因的DNA连接到适于某种宿主细胞的载体DNA上，从而形成重组DNA。在体外诱变该重组DNA，把诱变后的DNA导入宿主微生物中从而得到转化子。当选择出表达突变AKIII的转化子时，意味着该转化也含有这一突变基因。另外一种可能是将一种产野生型酶的微生物诱变后形成生产突变酶的菌株，这样从突变株中可得到突变基因。提到过羟胺及类似物可用作直接诱变DNA的试剂。羟胺是一种化学诱变剂，它通过使胞嘧啶变为N4-羟基胞嘧啶而引起胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。而且，紫外光辐射或人工诱变时经常使用的诱变剂-如N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍(NTG)就用来诱变微生物。由于供体菌DNA含有野生型AKIII基因或有其它突变的基因，可以使用埃希氏菌属的任何微生物。特别是一些在F、C、Neidhardt等人的文章中描述过的(参见Neidhardt，F、C、等人所著大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，华盛顿特区，1208页，表I)那些菌均可使用。例如E.coliJM109菌株及E.coliMC1061菌株。(1)野生型AKIII基因的获取下表介绍得到含有AKIII基因的DNA的实施例。例如，首先培养含有lysC基因的E.coliMC1061菌株从而获得培养物。上述微生物可用通常的固体培养基进行培养。考虑到细胞收集的效果，最好使用液体培养基。在这种情况下，培养基中可加入一种或几种无机盐；例如在单碳或多碳源培养基中加入磷酸一氢钾，磷酸二氢钾，硫化镁，氯化钠，氯化镁，氯化铁，硫化铁及硫化锰等无机盐，该一碳多碳培养是酵母提取物，蛋白胨，肉汁提取物，玉米浆和黄豆浆或小麦汁，再根据需要加入适量的促进发酵的糖类物质及维生素等。培养基的起始pH值最好调到6～8。温度温度应在30～42℃间，最好在37℃下深层通气搅拌培养、摇床培养或静培养4到24小时。例如，可在3000转/分转速下用5分钟时间从培养物中分离得到E.coliMC1061菌株。可用Saito和Miura法[生物化学、生物物理学报、72,619，(1963)]或K.S.Kirby法[生物化学杂志、64405(1956)]来得到该菌株的染色体DNA。为了从得到的染色体DNA中分离AKIII基因，需要制备染色体DNA文库。首先，用合适限制性内切酶将染色体DNA部分切割得到不同大小片段混合物。如果通过控制切割时间等因素来控制切割程度，可以得到不同的片段混合物。例如，在大于30℃时，最好在37℃，用内切酶浓度为1～10单位/毫升使染色体DNA同Sau3A1分别在1分钟至2小时的范围内进行反应。这样，染色体DNA片段就同埃希氏菌属的细菌细胞内有自我复制能力的载体DNA连接形成重组DNA。具体来讲，用某种限制性内切酶与载体DNA进行反应，得到的切割后的末端碱基序列应与限制性内切酶Sau3A1切割染色体DNA所得的末端碱基序列一致，例如，在30℃或大于30℃时用浓度为1～100单位/毫升的BamHI切割1小时以上的时间，最好是1到3小时，对染色体DNA进行完全消化，则染色体DNA裂解。然后，把上述得到的染色体DNA片段混合物同裂解的载体DNA混和。混合物中加入DNA连接酶，最好用浓度为1～100单位/毫升的T4DNA连接酶在4到116℃条件下反应1小时以上，最好6～24小时，从而形成重组DNA。可转化埃希氏菌属的微生物，例如E.coliK-12菌株，最好是转化完全缺失AKI，AKII，AKIII的菌株，例如，E.coliGT3菌株(可从美国田纳西州的大肠杆菌遗传保藏中心获得该菌株)从而制备染色体DNA文库。可用D、M、Morrison的方法进行转化[见酶学方法68，326，(1979)]或用氯化钙处理受体菌细胞从而提高其对DNA通透性的方法进行转化[见Mandel，M.andHiga，A.，分子生物学杂志53，159(1970)]从提高了AKIII活性的菌株或是从由染色体DNA文库补偿了AKIII基因缺失导致的营养缺陷型菌株中得到含有AKIII基因的重组DNA菌株。例如，当用一个完全缺失AK基因的突变体作宿主时，从在不含有L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-甲硫氨酸及二氨基庚二酸或不含有高丝氨酸和二氨基庚二酸的培养基上能够生长的重组体菌株中可找到重组DNA，这就使获得含有AKIII基因的DNA片段成为可能。从被选菌株中制备细胞提取物，再由此提取物中形成粗酶提取液。然后，可确定AKIII的污性。测定AKIII酶活的方法可使用E.R.Stadman法(Statman，E.R.，Cohen，G、N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，生物化学杂志，236，2033(1961)]。将含有AKIII基因的DNA片段插入截体DNA所得到的重组DNA可通过P.Guerry等人所提出的方法来分离(细菌学杂志116，1064，(1973)]或用D、B、Clewell方法来分离(细菌学杂志110，667，(1972)]。野生型AKIII基因可用Saito及Miura方法获得，即通过制备某种染色体DNA获得，该染色体DNA是得自于有AKIII基因的菌株，该基因在菌株的染色体上，而且AKIII基因的扩增是通过聚合酶链式反应法获得的[PCR，White，T.J.etal，遗传学动态5185(1989)]。在扩增反应中使用的DNA引物是同含有全部或部分AKIII基因区的DNA双链3’-末端互补的。当只有部分AKIII基因区被扩增时，需要从用含有AKIII基因区作为引物的染色体DNA文库中筛选出含有全部区域的DNA片段。当全部AKIII基因被扩增时，把含有DNA片段的PCR溶液-(该DNA片段上有扩增的AKIII基因)进行凝脉电泳，从而可提取出所需DNA片段，即又重新获得了含有AKIII基因的DNA片段。例如，根据已知的E.coli序列[参见Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.生物化学杂志261，1052(1986)]可以获得合适的DNA引物。一种能够扩增含有1347个碱基的编码lysC基因的区域的引物是合适的。例如，序例Nos.2和3中所示的引物DNA是合适的。可使用常规方法来合成引物DNA，例如Phosphoamidide法[TetrahedronLetters.1895(1981)]用市场上销售的DNA合成仪(例如，由AppliedBiosystems公司生产的380B型号合成仪)。然后，由供应商用市售的PCR仪(即TakaroShuzo有限公司生产的型号为PJ2000的DNA热循环仪)及TagDNA聚合酶来实现PCR反应。把通过PCR扩增的AKIII基因连接到属于埃希氏菌属的细菌细胞中具有自我复制能力的载体DNA上，如此可容易地将突变引入AKIII基因。载体DNA，及对AKIII基因的检出方法同上文描述的相同。(2)将突变引入AKIII基因上述AKIII基因需要用重组PCR方法[Higuchi，R.61，在《PCR技术》一书中(Erlich，HA.Eds.，Stockton出版社出版)]，一个位点特殊突变法[Kramer，W.和Frits，H.J.，酶学方法154，350(1987)；Kunkel，TA等，酶学方法154，367(1987)]，或类似方法来进行氨基酸残基的取代，插入或消除方法来引发突变的产生。这些方法能在目的位点引起所需突变。在所需位点可通过化学合成基因引入突变或随机突变。而且，有一种方法是直接用羟胺处理染色体或质粒上的AKIII基因[Hashimoto，T.和Sekiguchi，M，细菌学杂志。159，1039(1984)]。还有，可用紫外线辐射或化学试剂一如N-甲基-N’-亚硝基胍或亚硝酸对含有AKIII基因的埃希氏菌属的细菌进行处理的方法。通过这些方法可随机引发突变。下面描述筛选突变AKIII基因的方法。首先，将诱变处理的含有AKIII基因的重组DNA引入AK完全缺失的菌株，例如E.coliGT3菌株中。然后在基本培养基(如M9培养基)中培养转化株，该培养基中含大量L-赖氨酸。由于在含有野生型AKIII基因的重组DNA菌株的单独AK受L-赖氨酸抑制，无法合成L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸及二氨基庚二酸(DAP)，这样控制了菌株的生长。同时，由于含有突变AKIII基因的重组菌株的L-赖氨酸抑制被消除，所以该菌株应能够在含有大量L-赖氨酸的基本培养基上生长。利用这种现象，可以筛选出对L-赖氨酸或S-2-氨基半胱氨酸(AEC)具有抗性的菌株细菌生长中，AE(起L-赖氨酸类似物的作用)，即选择出了消除了反馈抑制的含有突变AKIII基因的菌株。如此获得的重组DNA基因即重组DNA被引入合适的微生物(即宿主)中，通过反馈抑制被消除的现象来获得含有AKIII的微生物。应优选属于埃希氏菌属的微生物作为宿主。例如，提到的大肠杆菌(E.coli)。而且，可用把从重组DNA上得到的突变型AKIII基因插入其它载体DNA上获得一种物质的方法。在本发明使用的载体DNA中，建议最好使用质粒载体DNA。举例说包括pUC19，pUC18，pUC322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219及pMW218。可供使用的还有噬菌体DNA载体和转座子载体。为了高效表达突变型AKIII基因，可在编码突变型AKIIIDNA的上游区段连接上可在宿主中起作用的启动子，如lac，trp及PL。或者，使用扩增的AKIII基因中的启动子。如上所述，通过将突变基因插入具有自我复制能力的载体DNA，并导入某一宿主中，这样在宿主中得到了类似质粒的外源染色体DNA。或者，用转座子通过转导的方法将突变型基因插入微生物宿主的染色体中(Berg，D.E.和Berg.C.M，生物/技术。1，417(1983)]，或用Mu噬菌体[日本公开文本(Kokai)No.109，985/1990)]或通过互补重组[分子遗传学实验，冷泉港实验室(1972)]的方法。<3>按照本发明生产L-氨基酸将上述突变型AKIII基因通过转化导入埃希氏菌属的细菌中，并在适宜的培养基中培养该菌，就能够产生L-氨基酸，在培养物中产生并积累L-氨基酸，从培养物中收集L-氨基酸。埃希氏菌属中含有AK从而消除了L-赖氨酸反馈抑制的细菌包括通过将突变的编码AKIII基因插入染色体DNA中从而消除L-赖氨酸反馈抑制的转化细菌，以及将上述DNA连到具有自我复制能力的载体DNA后形成的重组DNA导入埃希氏菌属中的细菌中形成的转化细菌。而且，还有通过诱变埃希氏菌属细菌细胞而导致允许突变AKIII产生的突变型埃希氏菌属细菌。涉及到埃希氏菌属的细菌在转化中用作宿主的问题，任何细胞中有突变型AKIII基因启动子或在该细胞中能够用来表达AKIII基因的启动子的细菌均可使用。或者是，当把突变型AKIII基因作为外源染色体引入质粒后，如果用作介导的载体DNA的复制区能够在细胞内起作用并能复制的活，那么该细菌就可以选用。本发明中用于培养含有突变基因的微生物的培养基是一种普通培养基，含有所需碳源、氮源、无机盐及其它有机物质。碳源的例子包括葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖及淀粉水解物糖类；甘油及山梨醇的醇，及有机酸中的延胡索酸，柠檬酸及琥珀酸。氮源的例子包括无机胺盐硫化氨，氯化氨及磷酸氨；黄豆水解物；氨气及液氨。至于无机微量营养元素，建议加入适量所需的物质，例如维生素B1或L-异亮氨酸，或酵母提取物。而且，磷酸钾，硫化镁，铁离子及锰离子也可根据需要少量加入。培养是在有氧状况下进行16至72小时。培养温度在25℃到45℃之间。在培养过程中pH值要调到5到8之间。可以用无机或有机，酸性或碱性物质甚至用氨气调节pH值。可用离子交换树脂法，沉淀法及其它已知方法来从发酵液中提取L-氨基酸实施例下面通过实施例进一步详细阐述本发明。实施例1突变型AKIII基因的获取(1)<1>野生型AKIII基因的克隆E.coli的AKIII基因的碱基序列已经有报导[Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志，261，1052(1986)]。已知开放阅读框架(ORF)含有1347个碱基对，编码449个氨基酸残基。该基因含有操纵子，受L-赖氨酸的抑制。因此，为了去掉其操纵区，需通过PCR方法扩增SD序例及仅含有ORF的区域并克隆。E.coliK12MC1061菌株的全部染色体组DNA已用Saito和Miura的方法制得[生物化学、生物物理、Acta.72，619(1963)]，并且制成了含有如Nos.2和3所示的序例的引物。使用H.A.Erlich等人的方法进行PCR反应。(PCR技术，Stocklon出版社(1989)]，用相同的方法扩增基因。将所得的DNA用BamHI和AseI消化，然后，得到平末端，插入低挎备载体pMW119的SMaI位点中，从而构建pMLYSC2。SMaI位于载体DNA的lacZ启动子的下游。当把由DNA片段插入pMW119的SmaI位点而获得的重组DNA导入E.coli时，可通过控制lacZ启动子而使插入的DNA片段转录(如图1)。<2>突变AKIII基因的克隆用EcoRI和HindIII来切割如国际公开WO94/11517和WO95/16042中所描述的突变型AKIII基因，即pLYSC*180，pLYSC1*117和pLYSC1*126，将含有突变型AKIII基因的DNA片段切掉。所得到的片段插入pMW119的EcoRI-HindIII切割位点中从而得到构建质粒，分别为pMLYSC2*80，pMLYSC2*117和pMLYSC2*126。根据国际公开文本WO94/11517所描述的方法，可由pLLC*8制备质粒pLYSC*80。把pLLC*80导入E.coliHBi01后所得的菌株记做AJ12750。该菌株保藏在工业科学部国家生物和人类技术研究所(No.1～3，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaragiken，305)保藏号为No.FERMP13136，保藏时间为1992年9月1日。按照布达佩斯条约的要求，该菌株于1993年11月4日提交国际保藏单位，在那里得到新的保藏号为BP-4462。pLYSC2*117和pLYSC2*126还未提交保藏。但是，由于在国际公开文本WO94/11517中公开了该菌株的突变特征，所以可容易地由pLYS1*80制得。<3>对选择新的突变AKIII基因条件的研究将pMLYSC1导入AK完全缺失的菌株，获得的转化菌株E.coliGT3(thrA1016b，metLM1005，lysC1004)被标作GT3/pMLYSC2。类似的，可得到GT3/pMLYSCZ*80，GT3/pMLYSC2*117和GT3/pMLYSC2*126。GT3/pMLYSC2菌株的质粒上有野生型lysC，该质粒的lysC编码的AKIII仅有AK。由于仅含有AK的野生型AKIII菌株在含有大量L-赖氨酸菌株的基本培养基中被L-赖氨酸所抑制，不能合成L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸及二氨基丁二酸(DAP)，从而使生长受到抑制。希望获得一种含有突变型]gsC基因的质质的菌株，该突变能消除L-赖氨酸抑制，从而能使菌株在含有大量L-赖氨酸的基本培养基上发生，从而需要选择出具有L-赖氨酸抗性的菌株，这样，选择出含有一种质粒的菌株，该质粒上含有突变型lysC能够消除L-赖氨酸抑制。在含不同浓度的L-赖氨酸的基本琼脂培养基上培养GT3/pMLYSC2，GT3/pMLYSC*80，GT3/pMLYSC2*117菌株，从而研究生长抑制浓度和含有质粒的菌株的筛选条件。在含有不同浓度的L-赖氨酸的基本琼脂培养基中转化菌株的生长情况如表1所示。在表1中，十代表有转化菌株生长，土表示转化菌株微弱生长，一表示没有转化菌株生长。表1L-赖氨酸的浓度及菌株生长情况</tables>在赖氨酸浓度达到0.2M后，含有野生型lysC的GT3/pMLYSCZ菌株的生长被完全抑制。而且，在L-赖氨酸的浓度达到0.4M后，含有突变LysC的公知的GT3/pMLYSC2*80菌株，GT3/pMLYSCZ*117菌株及GT3/pMLYSC2*126菌株的生长也几乎被完全抑制。结果表明，能够比目前为止知道的突变型lysC基因产生更好的消除抑制效果的突变株看起来应在L-赖氨酸浓度达0.4M以上的培养条件中选出。也证明即使同时加入高丝氨酸和二氨基庚二酸，这种生长抑制也能被消除。在检测引入的突变时，用含有浓度为0.4-ML-赖氨酸的基本琼脂培养基M9来筛选含有带LysC突变质粒的菌株。在实施例1中，这种培养基被称作选择性培养基。<4>AKIII基因的诱变及突变型AKIII基因的获得将突变引入pMLYSC1质粒中使用了两种方法，一种是用羟胺直接处理质粒的体内诱变法，另一种是PCR诱变法，该方法能根据希望产生各种突变而仅仅导致由胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。用0.4M的羟胺[溶液中含有由0.1MKH2PO4，1-mMEDTA(pH值为6.0)的混合物100μl及1-M羟胺和1-mMEPTA(pH值为6.0)和2-MgDNA的混合物，加水调至总体积为200μl]在75℃下反应1到4小时。这样处理后得到的DNA用玻璃粉纯化，然后引入AK完全缺失的E.coliGT3菌株中。所得到的转化菌株在完全培养基(含有1％L-肉汤，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠50mg/l的氨苄西林及1.5％的琼脂糖)中涂布培养形成菌落。将菌落影印到选择培养基上，筛选出在选择培养基上能生长的菌落作为候选菌株。通过PCR进行随机诱变处理是用C.Cadwell等人的方法实施的。(Cadwell，C.和G、F、Joyce，PCR方法应用2，28，(1982)]。即按上述方法用pMLYSC2和M13通用引物对lysC片段进行扩增。用EcoRI和HindIII对该片段进行消化，然后插入pMW119的EcoRI-HindIII切害位点之间，并将重组DNA引入完全缺失AK的E.coliGT3菌株中。在完全培养基中(含1％L-肉汁，0.5％的细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.5％氯化钠，50mg/l的氨苄西林及1.5％的琼脂糖)。涂布培养转化菌株形成菌落。将菌落影印到选择培养基上，筛选出在选择培养基上能生长的菌落作为候选菌株。可从上述47株候选菌株中回收质粒，44个菌株是用羟胺诱变得到的，另3株是通过PCR方法随机诱变获得的。突变型lgsC碱基序例已被确定，并且证实了突变位点。碱基序列的确定是用ABL373A型DNA序列分析仪(由ABI公司提供)按常规方法进行的。结果是，可从用羟胺诱变的菌株中获得有4种突变位点(Nos.1，6，14和21)的突变型AKIII菌株，从用PCR方法进行随机诱变的菌株中可获得有3种突变位点(Nos，28，29和30)的突变型AKIII菌株(见表2)。表2</tables>七种质粒(pMLYSC2*Y1，pMLYSC2*Y6，pMLYSC2*Y14，pMLYSC2*Y21，pMLYSC2*Y28，pMLYSC2*Y29和pMLYSC2*Y30)均导入了AK完全缺失的GT3菌株中，由这些转化菌株中制备不含菌体细胞的提取液。用同样的方法可测定AKIII的酶活力。制备无菌体细胞提取液和测量AKIII活性所用的是E.R.Stadtman等人的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，生物化学杂志，236，2033(1961)]。而且，测量AKIII的酶活力大小时，需在酶反应液中加入不同浓度的L-赖氨酶来测定消除L-赖氨酸抑制的程度。结果如表3所示。消除抑制的程度系指AK残基在存在0.4ML-赖氨酸时的活性与不存在L-赖酸时的活性的比值。表3从上述结果可清楚地看出，与传统的典型突变型AKIII(在pMLYSC2*80和pMLYSC2*117中编码的突变型AKIII)相比，突变型AKIII的消除抑制的效果更好，同时又可从所用筛选方法中获得突变型AKIII。由全蛋白所决定的专一活性通常受到细胞生长条件或制备样品的影响。其专一活性同野生型菌株和传统突变株相同，引入突变后几乎未观察到活性的增加。相应地，可推测其AKIII的活性中心和L-赖氨酸的控制位点是相互独立的。实施例2突变型AKIIII基因的获取(2)用LAPCR在体外诱变试剂盒(由TakaraShuzo有限公司提供)引入特异位点突变从而制备能使358位丝氨酸被亮氨酸取代的LysC基因。这次，分别用在国际公开文本WO94/11517和WO95/16042中描述的PLYSC工作母体，以及在序例表No.4中所描述的引物作为引物束引入突变。用EcoRI和HindIII来切割PCR扩增片段的22末端，将所得到的裂解片断同用EcoRI和HindIII裂解的pllC19片段连接起来得到pLYSC358L。除了用序列表No.5或6中的引物作为引物外，其它均按上述方法来制备354位丝氨酸被诱变为异亮氨酸或缬氨酸的突变型AKIII基因。把该基因同用EcoRI和HindIII裂解后的pLLC19片段联接起来。如此得到了pLYSC345I和pLYSC354V。把含有用EcoRI和HindIII裂解pLYSC1*48，pLYSC1*117，pLYSC1*126，pLYSC1*150和pLYSC1*158得到的LysC片段插入pUC19的Eco-HindIII裂解位点中，所得的片段分别记作pLYSC2*48，pLYSC2*117，pLYSC2*126，pLYSC2*150和pLYSC2*158。国际公开文本WO94/11517和WO95/16042公开了pLYSC1的结构及pLYSC1*48，pLYSC2*117，pLYSC1*126，pLYSC2*150和pLYSC2*158的突变位点。因此，可以用上述pLYSC1*80来制备这些质粒。然后，可制备含两种突变类型的突变型，LysC基因，即用所得到的单基突变型LysC的突变中心附近的SspI裂解位点，及pUC19的lysC下游的SspI裂解位点。即，将含有pLYSC2*48lysC基因上游SspI片段同含有pLYSC2*158lysC基因的下游SspI片段连接起来；从而制备pU2547M；把含有pLYSC2*126的lysC基因上游区的SspI片段同含有pLYSC2*158的lysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，从而制备pU2347M；把含有pLYSC2*48lysC基因上游区的Ssp1片段同含有pLYSC2*117lysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，可得到pU2545L；把含有pLYSC2*126的lysC基因上游区的Ssp1片段同含有pLYSC358L的lysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，可得到pU2358L；把含有pLYSC2*126的LysC基因上游区的Ssp1片段同含有pLYSC345VLysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，从而得到pU2345V；把含有PLYSC2*126的LysC基因上游区的SspI片段同含有pLYSC345I的LysC基因下游区的SspI片段连接起来，从而得到pU2345I；由于pLYSC2*150和pLYSC2*126的突变位点比SpsI裂解位点处于更上游区，有两个突变位点的双位点突变型lysC的制备方法如下。首先，用pLYSC2*126作模板扩增含有两个突变位点的DNA片段，将序列表No.7所示的寡核苷酸作为引物及上边提到的试剂盒。然后，用EcoRI和HindIII将所得到的DNA双末端裂解，并将片段连接到用EcoRI和HindIII裂解pUC19后所得的片段上。由此所得到的产物记作pU1823D。如此获得的双位点突变lysC基因产物(AKIII)消除赖氨酸抑制的程序在实施例1中作了描述，然后，任何双位点突变AKIII消除抑制的程度均比单位点突变AKIII要高(表4)。另外，pLYSC582L，pLYSC345I和pLYSC345V的突变lysC是一个新的突变基因。每种基因产品均消除了赖氨酸的反馈抑制，与其它突变基因连接后进一步增强了抑制程度。该基因产品亦可用作构建双位点突变型AKIII的中间物。表4</tables>实施例3用含有导入突变型DDPS基因和突变AKIII基因的菌株发酵生产L-赖氨酸。在国际公开文本WO95/16042中描述了突变型DDPS基因和突变型AKIII基因对生产L-赖氨酸产生的效果。为了增强这种效果，要把实施例1中得到的突变型AKIII基因与突变型DDPS基因联合起来。在国际公开文本WO95/16042中描述了一种将含有突变型DDPS基因的质粒RSF24P导入E.coli.JM109所得的菌株，即AJ12395。它保藏在工业科学与技术部的国家生物科学与人类技术研究所(No.1-3，Higashj1-chome，Tsukubashi，lbargi-Ken，305)，保藏号为No.FERMp-13935，保藏日为1993年10月28日。按照布达佩斯条约，该菌株于1994年11月1日提交了国际保藏，新分配的保藏号是No.FERMBP-4845。如图2所示，由含有突变型AKIII基团，pMLYSC2*Y1，pMLYSC2*Y6，pMLYSC2*Y14，pMLYSC2*Y21，pMLYSC2*Y28，pMLYSC2*Y9，pMLYSC2*Y30，pU2547M，pU2347M，pU2545L，pU2358L，pU2545V，pU2345I和pU1823D中选出一种类型用来制备质粒RSFDY1，RSFDY6，RSFDY14，RSFDY21，RSFDY28，RSFDY29，RSFDY30，RSFD2547M，RSFD2347M，RSFD2545L，RSFI2358L，RSFD2345V，RSFD2345I和RSFD1823D。将在国际公开文本中描述的质粒RSFD80用来作为对照。将质粒RSFD80引入E.coliJM109菌株后所得的菌株记作AJ12396。它被保藏在工业科学与技术部的国家生物科技与人类技术研究所中(No.1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，305)保藏号为No.FERMp-13936，保藏日为1993年10月28日。按照布达佩斯条约，该菌株于1994年11月1日提交了国际保藏，新分配的保藏号为No.FERMBP-4859。按照常规方法将上述获得的质粒RSFDY1，RSFDY6，RSFDY14，RSFD21，RSFD28，RSFD29，RSFD30，RSFD2547M，RSFD2347M，RSFD2545L，RSFD2358L，RSFD2345V，RSFD2345I和RSFD1823D导入B-399菌株，从而获得生产L-赖氨酸的菌株。对上述菌株的赖氨酸的生产能力作了评价，评价时仍使用B-399/RSFD80作为对照。在国际公开文本WO95/16042中公开了获得B-399菌株的方法。按照国际公开文本WO95/16042描述的方法，在生产L-赖氨酸培养基中，37℃F，搅拌培养48小时，搅拌速度为114～116rmp。结果如表5所示。表5</tables>实施例4用含有导入的突变型DDPS基因和突变型AKIII基因的菌株发酵生产L-赖氨酸(3)实施例3证明，使埃希氏菌属中的一种细菌拥有了突变型DDPS基因和突变型AKIII基因后，可提高L-赖氨酸的产量。本实施例用来检测在宿主变化后能否保持这种效果。用E.coliW3110(tyrA)菌株作为宿主。在欧洲专利公开文本No.488,424/1992中对该菌株作了描述。该文本中描述了大量将质粒导入W3110(tyrA)菌株后得到的菌株。例如，将质粒pHATerm引入后的菌株记作E.coliW3110(tyrA)/pHATerm菌株。该菌株按布达佩斯条约于1991年11月18日在工业科学与技术部国家生物科学与人类技术研究所(No.1-3，Higashi1-chome，TsukubaShi，Ibaragi-ken，305)提交了国际保藏。分配的保藏号为No.FERMBP-3653。W3110(tyrA)菌株也可通过消除E.coliW3110(tgrA)/pHATerm菌株中的质粒而获得。质粒的消除可用常规方法实施。由实施例3中获得的含有突变DDPS基因和突变型AKIII基因的质粒，即RSFDY1，RSFDY6，RSFDY14，RSFDY21，RSFDY28，RSFDY29，RSFDY30，RSFD2547M，RSFD2347M，RSFD2545L，RSF2358L，RSFD2345V，RSFD23451和RSFD1823D均被导入上述W3110(tyrA)菌株中，如同实施例3中一样，对L-赖氨酸的生产能力进行了评价。把W3110(tyrA)/RSFD80菌株作为对照，该菌株把RSFD80导入W3110(tgrA)菌株中获得的，对该菌株的生产L-赖氨酸的能力也作了评价。结果如表6所示。表6实施例5用导入了突变型AKIII基因的菌株发酵生产L-苏氨酸作为生产苏氨酸的E.coli菌株，B-3996菌株是目前已知的产量最高的菌株。因此，在评价突变型AKIII时，将B-3996菌株作为宿主。在美国专利5,175,107中对该菌株作了描述。并说明该菌株保藏在遗传学及工业微生物杂交研究所，保藏号为No.BKIIMB-3996。而且，为评价AKIII基因，选出实施例4中具有高L-赖氨酸生产能力的突变基因中的三种(RSFDY6，RSFE254M和RSFD1823D的突变型AKIII基因)，进行检测。首先，为了提高突变型AKIII基因的表达量，需将PMLYSC2*Y6的突变型AKIII基因连接到pUC19(由TakaraShuzo有限公司提供)的lacZ启动子的下游区。所得到的新的质粒被记作pLLC*Y6(图3)。由于在pU2547M和pU1823D中，突变AKIII基因最初位于pUc19(由TakaraShuzo有限公司提供)的lacz启动子下游，所以这样用。按常规方法将这些质粒导入B-3996菌株中，进行评价。用在国际公开文本WO94/11517中公开的培养方法进行培养。将pLLC*Y6，pU2547M和pU1823D转入B-3996菌株，在含有或不含有1克/升的赖氨酸的情况下进行培养。将国际公开文本WO94/11517中所描述的宿主B-3996菌株及B-3996/PLLC*80作为对照。结果如表7所示。表7中赖氨酸敏感性指的是(含有赖氨酸时糖类的消耗量)和(不含赖氨酸时糖消耗量)的比率。对于B-3996菌株中，含有赖氨酸的培养条件下，培养时糖消耗量与不含赖氨酸条件时相比较减少了约0.74；对于带有质粒的B-3996/pLLC*80菌株，含有赖氨酸的培养条件下，培养时糖消耗量与不含赖氨酸的条件时相比较减少了约0.90。这减得到的新的突变AKIII基因在生产苏氨酸和对赖氨酸敏感性上仅略有优势。表7发明效果本发明使从L-赖氨酸反馈抑制被消除的较好的埃希氏菌属细菌得到突变型AKIII基因成为可能。将上述基因导入埃希氏菌属细菌中可得到改善较多的生产L-氨基酸的菌株。并且提供用这种菌株发酵生产L-氨基酸的优于传统生产方法的方法。关键特征-10信号肽位点265..273测定方法S关键特征引物连接位点536..555测定方法E关键特征引物连接位点2128..2147测定方法E关键特征RBS位点575..578测定方法S关键特征CDS位点584..1933测定方法S关键特征末端位点1941..1968测定方法STCGAAGTGTTTCTGTAGTGCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTTGGATTGATGTTTTTCATT60AGCAATACTCTTCTGATTTTGAGAATTGTGACTTTGGAAGATTGTAGCGCCAGTCACAGA120AAAATGTGATGGTTTTAGTGCCGTTAGCGTAATGTTGAGTGTAAACCCTTAGCGCAGTGA180AGCATTTATTAGCTGAACTACTGACCGCCAGGAGTGGATGAAAAATCCGCATGACCCCAT240CGTTGACAACCGCCCCGCTCACCCTTTATTTATAAATGTACTACCTGCGCTAGCGCAGGC300CAGAAGAGGCGCGTTGCCCAAGTAACGGTGTTGGAGGAGCCAGTCCTGTGATAACACCTG360AGGGGGTGCATCGCCGAGGTGATTGAACGGCTGGCCACGTTCATCATCGGCTAAGGGGGC420TGAATCCCCTGGGTTGTCACCAGAAGCGTTCGCAGTCGGGCGTTTCGCAAGTGGTGGAGC480ACTTCTGGGTGAAAATAGTAGCGAAGTATCGCTCTGCGCCCACCCGTCTTCCGCTCTTCC540CTTGTGCCAAGGCTGAAAATGGATCCCCTGACACGAGGTAGTTATGTCTGAAATT595MetSerGluIle1GTTGTCTCCAAATTTGGCGGTACCAGCGTAGCTGATTTTGACGCCATG643ValValSerLysPheGlyGlyThrSerValAlaAspPheAspAlaMet5101520AACCGCAGCGCTGATATTGTGCTTTCTGATGCCAACGTGCGTTTAGTT691AsnArgSerAlaAspIleValLeuSerAspAlaAsnValArgLeuVal253035GTCCTCTCGGCTTCTGCTGGTATCACTAATCTGCTGGTCGCTTTAGCT739ValLeuSerAlaSerAlaGlyIleThrAshLeuLeuValAlaLeuAla404550GAAGGACTGGAACCTGGCGAGCGATTCGAAAAACTCGACGCTATCCGC787GluGlyLeuGluProGlyGluArgPheGluLysLeuAspAlaIleArg556065AACATCCAGTTTGCCATTCTGGAACGTCTGCGTTACCCGAACGTTATC835AsnIleGlnPheAlaIleLeuGluArgLeuArgTyrProAsnValIle707580CGTGAAGAGATTGAACGTCTGCTGGAGAACATTACTGTTCTGGCAGAA883ArgGluGluIleGluArgLeuLeuGluAsnIleThrValLeuAlaGlu859095100GCGGCGGCGCTGGCAACGTCTCCGGCGCTGACAGATGAGCTGGTCAGC931AlaAlaAlaLeuAlaThrSerProAlaLeuThrAspGluLeuValSer105110115CACGGCGAGCTGATGTCGACCCTGCTGTTTGTTGAGATCCTGCGCGAA979HisGlyGluLeuMetSerThrLeuLeuPheValGluIleLeuArgGlu120125130CGCGATGTTCAGGCACAGTGGTTTGATGTACGTAAAGTGATGCGTACC1027ArgAspValGlnAlaGlnTrpPheAspValArgLysValMetArgThr135140145AACGACCGATTTGGTCGTGCAGAGCCAGATATAGCCGCGCTGGCGGAA1075AsnAspArgPheGlyArgAlaGluProAspIleAlaAlaLeuAlaGlu150155160CTGGCCGCGCTGCAGCTGCTCCCACGTCTCAATGAAGGCTTAGTGATC1123LeuAlaAlaLeuGlnLeuLeuProArgLeuAsnGluGlyLeuValIle165170175180ACCCAGGGATTTATCGGTAGCGAAAATAAAGGTCGTACAACGACGCTT1171ThrGlnGlyPheIleGlySerGluAsnLysGlyArgThrThrThrLeu185190195GGCCGTGGAGGCAGCGATTATACGGCAGCCTTGCTGGCGGAGGCTTTA1219GlyArgGlyGlySerAspTyrThrAlaAlaLeuLeuAlaGluAlaLeu200205210CACGCATCTCGTGTTGATATCTGGACCGACGTCCCGGGCATCTACACC1267HisAlaSerArgValAspIleTrpThrAspValProGlyIleTyrThr215220225ACCGATCCACGCGTAGTTTCCGCAGCAAAACGCATTGATGAAATCGCG1315ThrAspProArgValValSerAlaAlaLysArgIleAspGluIleAla230235240TTTGCCGAAGCGGCAGAGATGGCAACTTTTGGTGCAAAAGTACTGCAT1363PheAlaGluAlaAlaGluMetAlaThrPheGlyAlaLysValLeuHis245250255260CCGGCAACGTTGCTACCCGCAGTACGCAGCGATATCCCGGTCTTTGTC1411ProAlaThrLeuLeuProAlaValArgSerAspIleProValPheVal265270275GGCTCCAGCAAAGACCCACGCGCAGGTGGTACGCTGGTGTGCAATAAA1459GlySerSerLysAspProArgAlaGlyGlyThrLeuValCysAsnLys280285290ACTGAAAATCCGCCGCTGTTCCGCGCTCTGGCGCTTCGTCGCAATCAG1507ThrGluAsnProProLeuPheArgAlaLeuAlaLeuArgArgAsnGln295300305ACTCTGCTCACTTTGCACAGCCTGAATATGCTGCATTCTCGCGGTTTC1555ThrLeuLeuThrLeuHisSerLeuAsnMetLeuHisSerArgGlyPhe310315320CTCGCGGAAGTTTTCGGCATCCTCGCGCGGCATAATATTTCGGTAGAC1603LeuAlaGluValPheGlyIleLeuAlaArgHisAsnIleSerValAsp325330335340TTAATCACCACGTCAGAAGTGAGCGTGGCATTAACCCTTGATACCACC1651LeuIleThrThrSerGluValSerValAlaLeuThrLeuAspThrThr345350355GGTTCAACCTCCACTGGCGATACGTTGCTGACGCAATCTCTGCTGATG1699GlySerThrSerThrGlyAspThrLeuLeuThrGlnSerLeuLeuMet360365370GAGCTTTCCGCACTGTGTCGGGTGGAGGTGGAAGAAGGTCTGGCGCTG1747GluLeuSerAlaLeuCysArgValGluValGluGluGlyLeuAlaLeu375380385GTCGCGTTGATTGGCAATGACCTGTCAAAAGCCTGCGGCGTTGGCAAA1795ValAlaLeuIleGlyAsnAspLeuSerLysAlaCysGlyValGlyLys390395400GAGGTATTCGGCGTACTGGAACCGTTCAACATTCGCATGATTTGTTAT1843GluValPheGlyValLeuGluProPheAsnIleArgMetIleCysTyr405410415420GGCGCATCCAGCCATAACCTGTGCTTCCTGGTGCCCGGCGAAGATGCC1891GlyAlaSerSerHisAsnLeuCysPheLeuValProGlyGluAspAla425430435GAGCAGGTGGTGCAAAAACTGCATAGTAATTTGTTTGAGTAAATACTGT1940GluGlnValValGlnLysLeuHisSerAsnLeuPheGlu440445ATGGCCTGGAAGCTATATTTCGGGCCGTATTGATTTTCTTGTCACTATGCTCATCAATAA2000ACGAGCCTGTACTCTGTTAACCAGCGTCTTTATCGGAGAATAATTGCCTTTAATTTTTTT2060ATCTGCATCTCTAATTAATTATCGAAAGAGATAAATAGTTAAGAGAAGGCAAAATGAATA2120TTATCAGTTCTGCTCGCAAAGGAATTC2147序列描述序列长度20序列类型核苷酸链型单链拓朴结构线状分子类型其它DNA序列描述CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG20序列长度18序列类型核苷酸链型单链拓朴结构线状分子类型其它DNA序列描述GAATTCCTTTGCGAGCAG18SEQIDNO4序列长度32序列类型核苷酸链类型单链拓朴结构线型分子类型其它DNA序列描述GAGGTCAGACCGGTGGTATCAAGGGTTAATGC32SEQIDNO5序列长度51序类类型核苷酸链类型单链拓朴结构线型分子类型其它DNA序列描述GGTATCAAGGGTTAATGCCACGCTCACTTCGATCGTGGTGATTAAGTCTAC51SEQIDNO6序列长度51序列类型核苷酸链类型单链拓朴结构线状分子类型其它DNA序列描述GGTATCAAGGGTTAATGCCACGCTCACTTCAACCGTGGTGATTAAGTCTAC51SEQIDNO7序列长度30序列类型核苷酸链类型单链拓朴结构线状分子类型其它DNA序列描述TGCAGTATATTCAGGCTGTGCAAAGTGAGC30简要图1制备pMLYSC2的方法说明图2制备RSFD系列质粒的方法说明图3制备pLLC*Y6的方法说明权利要求1.一种编码埃希氏杆菌属细菌天冬氨酸激酶III的DNA，含有编码区的突变以消除所述天冬氨酸激酶的赖氨酸反馈抑制，所述突变是天冬氨酸激酶III的318位甲硫氨酸残基由另一个氨基酸取代且第323位甘氨酸残基由另一个氨基酸取代的突变，所述酶的第325位亮氨酸残基由另一个氨基酸取代且第347位缬氨酸残基由另一个氨基酸取代的突变，所述酶的第323位甘氨酸残基由另一个氨基酸取代且第347位缬氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，所述酶的第325位亮氨酸残基由另一个氨基酸残基取代且第345位丝氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，第323位甘氨酸残基被另一个氨基酸残基取代且第358位丝氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，第344位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，第250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，第346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第347位亮氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，第250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第364位苏氨酸被另一氨基酸残基取代的突变，第202位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，第283位精氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第333位丙氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第338位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第414位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，或者是第318位甲硫氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第328位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第349位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第405位谷氨酸残基被另一氨基酸残基所取代。2.权利要求1所述DNA，突变位点是天冬氨酸激酶的318位甲硫氨酸的残基被异亮氨酸残基所取代且第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代，第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第345位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代且第358位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，第344位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代的突变，突变由346位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，且347位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代所造成，突变由250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，且364位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基取代造成，突变由202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代造成，突变是第283位精氨酸残基被丝氨酸残基取代，第333位丙氨酸残基被苏氨酸残基取代，第338位丝氨酸残基被苏氨酸残基取代，第346位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代，第414位天冬氨酸残基被丝氨酸残基取代，或者，突变是第318位甲硫氨酸残基被赖氨酸残基取代，第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代，第328位缬氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，第349位缬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第405位谷氨酸残基被缬氨酸残基取代。3.一种DNA重组体，由权利要求1所述DNA连接到载体DNA上构成，该载体在埃希氏菌属细菌内具有自我复制功能。4.一种含有权利要求1所述DNA的埃希氏菌属的微生物。5.一种生产L-氨基酸的方法，包含有对能够在一种发酵培养基中生产一种L-氨基酸的权利要求4所述的微生物体的培养，由所述培养物中产生并积累L-氨基酸，从培养物中收集L-氨基酸6.权利要求5所述的方法，所述L-氨基酸为L-赖氨酸或L-苏氨酸。全文摘要提供一种高效发酵生产L－氨基酸的方法。一种来自埃希氏菌属细菌的编码天冬氨酸激酶Ⅲ的DNA,该DNA有能够消除L－氨酸反馈抑制的突变,将该DNA导入埃希氏菌属细胞中形成转化菌株,并在适宜的培养基中培养。培养基中一种L－氨基酸的产生并积累,以及从培养基中收集L－氨基酸。文档编号C12N15/00GK1182133SQ9712285公开日1998年5月20日申请日期1997年10月15日优先权日1996年10月15日发明者菊池庆实,中西一夫,児岛宏之申请人:味之素株式会社