专利名称：立体选择性的制备治疗酰胺的酶催化方法
技术领域：
本发明范围本发明涉及合成药用化合物和在合成这样的化合物中所使用的中间体的方法。具体地讲本发明涉及立体选择性制备具有叔醇立体中心的N-芳基或-吡啶基丙酰胺，和用于合成这些化合物的对映中间体的新的酶催化方法。
本发明背景1993年12月21日颁布给Russell等的美国专利5272163中公开了N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺和其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺。这些化合物是细胞钾通道的启动剂(openers)并因此用于治疗尿失禁和其它疾病及紊乱，包括高血压、哮喘、外周血管疾病及咽峡炎，正如上述专利所公开的。美国专利5272163也公开了制备N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的(S)-(-)对映体的方法，该方法应用非对映异构体的酯形成后进行层析分离，随后用碱处理除去酯基团。
本发明概述本发明提供立体选择性制备具有叔醇立体中心的N-芳基或-吡啶基丙酰胺的新的酶催化方法，例如制备(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺。这些化合物是细胞钾通道的启动剂并因此用于治疗尿失禁和其它疾病及紊乱，包括高血压、哮喘、外周血管疾病和咽峡炎。
本发明的新方法使用酶催化步骤选择性从N-芳基或吡啶基丙酰胺所形成酯的外消旋混合物的一个对映体上裂解酯基。酶催化步骤后，从如此所产生的醇中分离剩余的酯。在酶催化步骤中未被裂解的回收酯(若需要)可以水解产生相应的醇。
本发明也提供用于合成上述N-芳基或-吡啶基丙酰胺的中间体的合成方法，例如在制备(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺中所使用的(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的制备。
在此提供立体选择性合成具有叔醇立体中心的N-芳基或-吡啶基丙酰胺，例如(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺，及在合成这些化合物时使用的中间体的方法。
在下列本发明详细描述的优选实施例中描述所附的权利要求书中本发明的各个方面。本发明详细描述本发明的第-个方面是提供制备具有旋光性的活性式Ⅰ化合物的方法
其中E选自氮和CZ，其中C是环碳，Z是下述定义的取代基，其中当E是CZ时，X和Z选自(A)X是ArY，其中Y为选自羰基、亚磺酰基和磺酰基的连接基团，Ar选自用选自卤素、羟基、氰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2个取代基取代的苯基；含有1-2氮原子作为仅有的杂原子的六元杂芳环；含有选自氮、氧和硫的1-2杂原子的五元杂芳环，和Z选自氢、氰基、卤素、羟基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；和(B)X是氰基，Z选自苯硫基，苯基亚磺酰基和苯磺酰基，其中苯环被选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2个取代基所取代；和当E是氮时，X独立选自任在上述(A)中给出的X的任何值；和*是具有旋光性的活性的手性中心，所述方法包括用水解酶处理式Ⅱ的外消旋化合物的步骤。式Ⅱ化合物定义如下式Ⅱ
其中E和X在此具有上述所定义的意义；和R1是由独立选自羟基、卤素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基和C1-C4二烷胺基的一个或多个取代基任选取代的烷基。优选为R1是任选取代的C1-C7烷基，更优选任选取代的C1-C5烷基。优选取代基为卤素，更优选氯。在本发明方法中，水解酶从式Ⅱ酯的一个对映体上裂解酯提供如式Ⅰ醇的(S)或(R)的对映体，这取决于酶的特异性，并将另一对映体留于未反应的底物中。
本发明方法也包括从未反应的原料中分离在酶催化步骤中形成的产物的步骤，即，分离在酶处理中形成的式Ⅰ醇和式Ⅱ原料化合物的未反应酯。酶从式Ⅱ化合物的外消旋混合物的一个对映体中选择地裂解酯基生成醇。使用常规方法如硅胶柱层拆分离式Ⅰ化合物和式Ⅱ未反应的酯原料。当所需的对映体是未反应的酯时，本发明方法可以进一步包括将所述酯转化成相应的醇。通过用碱如氢氧化钠处理可将所述酯转化成相应的醇。
本发明该方面的优选实施例将提供制备(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(式Ⅰ其中*为(S)构型，E是CZ,X是ArY,Y是羰基，Ar是苯基，和Z是氢)的方法。
使用本领域中所知的常规方法将外消旋的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺转化成酯。例如，使外消旋化合物在碱如三乙胺存在下与式Ⅲ酰氯反应式Ⅲ
其中R1具有上述定义的意义，如流程Ⅰ所示。优选式Ⅲ化合物包括一氯乙酰氯和丁酰氯。例如，使用美国专利5382598的方法或在此所述的方法可以制备外消旋的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺。
然后使由N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺衍生的酯与水解酶反应，优选脂酶，更优选粗品猪胰脂酶，它选择地裂解(R)对映体的酯基，留下(S)对映体的酯。该反应优选在约pH7的缓冲水溶液中用叔-丁基甲基醚(MTBE)为共溶剂中进行。然而，可以理解缓冲溶液的pH将取决于反应中所使用的酶。在反应混合物中存在的共溶剂是任选的。使反应进行直到可用底物已反应为止，可能是约一天至约三天。该反应可进行快或慢取决于所使用的酶和反应条件。使用相反特异性酶在酶催化步骤中直接从(S)对映体裂解酯基也是可能的。流程1
(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺通过一般方法如硅胶柱层析或任何其它适当方法可以从N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的(R)对映体分离出(S)酯。当酯是(S)对映体时，用碱如氢氧化钠在甲醇水溶液或其它溶剂中处理除去酯基并提供(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺。
本发明的该方面以合成(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺为例证。用流程Ⅰ所描述的方法，通过N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺这样的化合物的取代外消旋混合物可以制备其它的式Ⅰ的N-芳基或-吡啶基丙酰胺。一些取代基可能需要使用保护基。根据美国专利5382598的方法可以制备式Ⅰ化合物的外消旋混合物。
流程2表示(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的制备，其中通过用拆分试剂选择性结晶而不是酶方法制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中间体。如流程2所示，使1,1,1-三氟丙酮(1)与氰化物如氰化钠在酸如盐酸的存在下反应，形成外消旋的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈(2)。然后外消旋的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈(2)用如盐酸或硫酸水解提供外消旋的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(3)。然后用拆分试剂如(1R,2S)-降麻黄碱选择地结晶外消旋物(3)形成盐(5)，可以重结晶成非对映异构体纯度。纯化的盐(6)含有(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(7)。从盐释出(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(7)与4-氨基二苯酮(8)和SOCl2，使用有机碱如三乙胺或Hunig氏碱反应形成(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(9)，然后通过重结晶纯化。
对制备具有S构型的式Ⅰ其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺而言，如下述定义的式Ⅳ胺取代流程2所示合成中的4-氨基二苯酮。所述的胺与(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸以类似方法反应产生酰胺产物，然后任选经常规方法纯化。在美国专利5272163中也描述了式Ⅳ胺。流程2
式Ⅳ化合物定义如下
式Ⅳ其中X和E具有上述定义的意义。根据美国专利5272163公开的方法可以制备式Ⅳ这样的胺。
除流程2所示的方法，式Ⅳ化合物与(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸在其它适当的溶剂和在其它适当偶合剂存在下可进行偶合反应。可以使用作为一般肽偶合剂的本领域熟知的适当偶合剂，例如亚硫酰氯[Morris等，J.Med.Chem.,34,447,(1991)]，羰基二咪唑(CDI)和二环己基碳二亚胺，并任选在催化剂如二甲基氨吡啶(DMAP)或4-吡咯烷并吡啶的存在下。适当的溶剂包括二甲基乙酰胺、二氯甲烷、苯、四氢呋喃和二甲基甲酰胺。偶合反应在约-40℃～40℃温度范围内进行。
另一方面，本发明提供制备用于合成美国专利5272163中公开的(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺和其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺中的(S)对映体中间体的立体选择性方法。(S)对映体中间体使(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺或式Ⅰ的其它N-芳基或-吡啶基丙酰胺制备不需要使用拆分试剂如α-甲基苄胺或降麻磺碱形成冗长的立体选择盐的步骤。本发明提供立体选择方法，每个方法含有酶催化步骤，用于制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈和(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。
在制备这样中间体的第一个立体选择方法中，通过使用水解酶，优选脂酶如Candida antarctica脂酶选择性裂解外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的酯制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。所述方法包括用水解酶处理优选具有式Ⅴ的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的酯式Ⅴ
其中R2是C1-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基。使用常规方法制备酯，如从外消旋酸用矿物酸作用和适当醇制备。例如，使外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸和丙醇或丁醇在少量浓硫酸或干燥氯化氢存在下反应分别生成丙酯或丁酯来制备丙酯和丁酯。在适当醇的存在下，通过用硫酸水解外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈也可以制备式Ⅴ酯。
通过水解酶，优选脂酶如Candida antarctica脂酶，选择性地裂解式Ⅴ酯生成酯和酸的混合产物。用水解酶的反应优选在所用的酶可接受的pH的缓冲水溶液中进行，通常在约pH5和约pH9之间以得到良好的反应速率。也可以使用共溶剂如甲基-叔丁基醚(MTBE)。使反应进行至有满意量的酯反应为止，通常约1-3天后。实际反应时间取决于多种因素，如所使用的酶、底物和溶剂。然后使用本领域中熟知的硅胶层析或任何其它适当的方法分离所述的酯和酸。根据酶的选择性，所需的(S)对映体可以以回收的未反应的酯或游离酸形式存在。在该情况下未反应的酯含有(S)对映体，通过与碱如氢氧化钠反应，除去酯基生成(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸，随后中和。
为了制备(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺，根据在此的方法，使(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸与4-氨基二苯酮反应。正如所述，使用(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸和在流程2所示合成中用式Ⅳ的胺代替4-氨基二苯酮制备其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺式Ⅰ。式Ⅴ化合物式Ⅴ
其中R2是C3-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基，形成本发明的另一方面。
式Ⅵ化合物式Ⅵ
其中*是具有旋光性的活性手性中心，R2是C2-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基，形成本发明的又一方面。优选*是具有(S)构型的具有旋光性的活性手性中心。
在制备这样的中间体的第二个立体选择方法中，通过处理或使式Ⅶ化合物反应，可制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸，式Ⅶ
其中A是CN、COH、CH(OR3)2、COR4、COOR5、CONH2、CONHR6或CONR7R8；R3、R4、R5、R6、R7和R8独立选自烷基、芳基和芳烷基；R9是烷基、芳基或芳烷基，其中任何一个可独立任选用选自羟基、卤素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基或C1-C4二烷胺基取代基所取代，用水解酶，优选脂酶如粗品猪胰脂肪酶，选择性地裂解酯基提供相应的式Ⅷ醇，
式Ⅷ
其中*是具有旋光性的活性手性中心和A具有先前定义的意义，和将式Ⅷ化合物的A基团转化成酸(即COOH基团)。R9优选为任选取代的C1-C10烷基，更优选C1-C5烷基。A优选CN。优选R3、R4、R5、R6、R7和R8独立是C1-C10烷基，更优选C1-C5烷基。
使用水解酶的反应可在缓冲水溶液中进行，将溶液的pH调至所使用的酶可接受的值，一般在约pH7和约pH7.5之间。也可以使用共溶剂如MTBE。使反应进行至满意量的酯反应为止。通常使反应进行约3天，但实际时间将取决于多种因素，如所使用的酶，底物和溶剂。
然后用常规方法如硅胶柱层析分离醇和酯的混合物。根据酶的选择性，所需的(S)对映体可以以回收的(未反应)酯或醇形式存在。当所需(S)对映体是回收的酯时，可用碱如氢氧化钠处理酯除去酯基。用常规方法将A基团转化成羧基提供(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。根据A的性质可任选将酯基去除和腈基水解步骤结合。
在优选的实施例中，使(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈与酸反应制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。通过使1,1,1-三氟丙酮与氰化钠在盐酸存在反应生成外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈来制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈。然后使外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈与酰氯如丁酰氯反应成酯。使该外消旋酯与脂酶如粗品猪胰脂肪酶反应选择性裂解(R)对映体酯基留下(S)对映体酯。然后使用常规方法除去(S)对映体酯基提供(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈，然后用酸如硫酸或盐酸处理生成(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。
本发明的另一方面提供制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈的方法，该方法包括用水解酶，优选脂酶如粗品猪胰脂肪酶处理式Ⅶ化合物，其中A是CN。
本发明也提供式Ⅶ化合物式Ⅶ
其中A和R9具有先前定义的意义；和式Ⅸ化合物式Ⅸ
其中*是具有旋光性的活性手性中心，A和R9具有上述定义的意义。优选*指具有(S)构型具有旋光性的活性手性中心。
本发明也提供式Ⅷ化合物式Ⅷ
其中*是具有旋光性的活性手性中心，A具有上述定义的意义。优选*指具有(S)构型的具有旋光性的活性手性中心。
使用任何类型具有选择性裂解酯基形成醇的水解酶如脂酶、酯酶、肽酶或蛋白酶来进行在此介绍的酶催化步骤的方法。从微生物培养或从植物或动物中可获得所述的酶。这样的酶市场有售或通过本领域熟知的方法来制备。已发现脂酶能选择裂解由N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺形成的酯和在此描述的其它酯以可接受的收率达到对映体的拆分。已发现市售的脂酶制剂优先地裂解(R)对映体的酯基留下酯形式的(S)对映体。优选脂酶是容易购得的粗品猪胰脂肪酶。也可使用来自其它种类的脂酶。猪胰脂肪酶提供良好的特异性和反应速率。用于本发明的酶市场有售并不需要进一步处理可在反应混合物中使用或可预处理，例如通过溶解在约pH7-7.5的缓冲液中和吸收于载体如玻璃珠、硅藻土、炭、离子交换树酯或硅胶或共价连接于聚合物载体。
一般地讲，以从1∶10-100∶1(重量∶重量)底物∶酶的比率可以进行本发明酶催化步骤的方法。已发现从5∶1-1∶1的底物∶酶的比率可提供令人满意的结果。根据像起始原料、所用的酶等因素和反应条件如温度和溶剂，底物对酶的比率可能需要改变以产生满意的反应速率。使酶催化反应进行至从起始原料裂解酯基形成满意量的醇为止。一般讲，将使酶催化反应进行约12小时至约4或5天，优选从约1-3天。
反应混合物的pH一般从约5-约9，优选从约7-约8。一般在从约15-约40℃，优选从约25-约38℃的温度进行酶催化步骤。根据像起始原料、酶和所用溶剂因素，反应条件可能需要在上述范围内(或甚至超出范围)变化，以提供满意的反应速率。
在反应混合物中所用的溶剂和任何共溶剂将根据像在反应中所用的酶和底物等因素而改变。溶剂也可以影响酶催化反应的选择性和/或反应速率，在该种情况下应选择溶剂以增加反应速率(相对其它溶剂而言)和/或影响酶对所需的对映体的选择性。反应混合物溶剂可以是任何常规缓冲水溶液如磷酸二氢钾缓冲液。对所述反应而言适当的共溶剂包括MTBE。
酶催化拆分反应需要2天几乎完成(即，几乎全部的(R)酯反应)，使用衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺和丁酸的外消旋的酯和粗品猪胰脂肪酶1∶1的底物∶酶(重量∶重量)的比率。相同原料的5∶1(重量∶重量)的底物∶酶的比率在2天内产生约25％的酯水解。猪胰脂肪酶与衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺和丁酸的酯的反应(水解回收的酯后)，提供35％收率中对映体过量98.5％的(S)异构体(可得70％的(S)酯)。
如在此所用，烷基和烷氧基的烷基部分和芳烷基包括直链和支链残基。
烷基的具体实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、异丙基、仲-丁基和叔丁基。
烷氧基的具体基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
芳烷基的具体基团包括苄基、苯乙基、苯丙基。
芳基的具体基团包括苯基。
烷胺基的具体基团包括甲胺基、乙胺基、丙胺基和丁胺基。
二烷胺基的具体基团包括二甲胺基和二乙胺基。
含1-2氮原子的六元杂芳环的Ar具体基团包括2-,3-和4-吡啶基，2-吡嗪基，2-和4-嘧啶基和3-和4-哒嗪基。
含选自氮、氧和硫的1-2杂原子的5元杂芳环的Ar的具体基团包括3,4-和5-异噻唑基。2-,4-和5-噁唑基，2,4-和5-噻唑基，2-和3-呋喃基，和2-和3-呋喃基。
术语卤素指氟、氯、溴和碘，除另有说明外。
*代表R或S构型中具有旋光性的活性手性中心。
参考下列实施例对本发明进一步说明，所述实施例不限制本发明的范围。
实施例实施例1-(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的合成A．衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酸酯的制备在0～5℃，于乙腈(150ml)中搅拌外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(25g)和三乙胺(15ml)，并在＜10℃用15分钟加入丁酰氯(10ml)。在＜10℃2小时45分钟后，再加入三乙胺(2ml)和丁酰氯(1ml)，并在20℃搅拌反应物1小时30分钟，再加入丁酰氯(1ml)。再过30分钟后完成反应。然后加入水(450ml)、乙酸乙酯(175ml)，搅拌混合物15分钟，然后分离。用乙酸乙酯(175ml)再提取水层，用50％盐水(150ml)洗涤合并的有机提取液，过滤和蒸发。通过溶解于热叔-丁基甲基醚(MTBE)(60ml)，用10分钟缓慢加入己烷(400ml)，然后用1小时冷却至5℃来结晶油状物。在5℃30分钟后，滤除衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酸酯，用己烷(50ml)洗涤并在40℃真空干燥。收率26g(86％)B．衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的丁酸酯的酶催化水解用0.1N氢氧化钠溶液(2ml)将5毫摩尔磷酸二氢钾溶液(50ml)调至pH7.1，加入猪胰脂肪酶(生物催化剂Treforest,UK)(0.2g)，并用0.1N氢氧化钠溶液(2ml)再调pH至7.1。将衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(1g)的外消旋丁酸酯溶解于MTBE(10ml)中并加进反应物中，再用MTBE(2ml)洗涤。在38℃控制起始pH7.05最大搅拌反应物7.00分钟。24小时后，再加入猪胰脂肪酶(0.8g)，将pH调至7.55最大/7.50分钟，并保持42小时，同时加入总量10ml的0.1N氢氧化钠。用2N HCl(2ml)酸化反应混合物至pH3.5，搅拌15分钟，然后加入乙酸乙酯(30ml)并再搅拌混合物10分钟。然后过滤所述混合物并用乙酸乙酯(20ml)洗涤残留物。分离出水相并用乙酸乙酯(30ml)提取。用50％盐水(20ml)洗涤合并的有机提取液，过滤和蒸发至部分结晶的油状物。收率0.95g。所述产物是(R)-醇(99％对映体过量)和酯的混合物。
产物分离使用硅胶60(Fluka,Buchs,Switzerland)快速柱层析分离产物，用5％乙酸乙酯/甲苯洗脱得到酯，然后用50％乙酸乙酯/甲苯洗脱得到醇。醇收率338mg；具有97.6％对映体过量的(R)-对映体。酯收率415mg。
C．回收酯的水解将回收酯溶解于甲醇(25ml)中，加入100°TW氢氧化钠溶液并在20℃搅拌30分钟。加水(70ml)，用2N HCl(2ml)酸化混合物至pH2，然后用乙酸乙酯(2×30ml)提取。用50％盐水(20ml)洗涤有机提取液，过滤并蒸发为白色固体。(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的收率297mg(71.7％,98.5％的对映体过量)。
实施例2-酸部分对酯水解速率和反应特异性的影响由外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺和相应的酰氯可制备一系列酯。通过猪胰脂肪酶使之裂解并于24小时后分析。
在38℃将磷酸缓冲液(50ml)调至pH7.6，加入酶(0.2g)并再调pH7.6，加入酶(0.2g)并再调pH至7.6。加入于MTBE中的衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(1.0g)的外消旋酯，随后用MTBE洗涤(总量12ml)，使用自动滴定仪和0.1NNaOH控制pH下，于约38℃搅拌混合物。在反应结束时，用2N HCl调混合物pH至＜5，并将产物提取到乙酸乙酯中。通过层析分离酯和醇，并用甲醇中的NaOH水解回收酯。使用Chiracel OJ(Daicel Chemical Industries)柱进行高压液相层析(HPLC)分析(R)和(S)醇以测定对映体的纯度。
除了苯甲酸酯和苯基乙酸酯反应非常慢外，从未反应酯分离后测定转化程度以及(R)醇产物的对映体过量。结果列在表1中。
表1酯 使用1∶5w/w酶∶酯的(R)异构体产物的选24小时后转化率 择性ee(对映体过量)乙酸酯 2.5％ 86％ee丙酸酯 6％ 87％ee丁酸酯 10％ 99％ee己酸酯 4.7％ 98％ee苯甲酸酯 ＜1％N/A苯基乙酸酯 ＜1％N/A单氯乙酸酯约65％ 约30％ee单氯乙酸酯水解实际比任何其它所试验的酯都快；所述反应进行至远远超出50％标记并在从残基酯中回收的(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺中未测到(R)异构体，表明良好的选择性。实施例3-由N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺和丁酸形成的外消旋酯的水解A．根据流程2由外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸和4-氨基二苯酮制备外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺并转化成丁酯。所述丁酯经一系列酯酶和脂酶筛分。将DMSO(0.3ml)中的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酯(0.5g)加入于酶(0.1g)的保持在30℃ pH7.5的缓冲液中。结果列于表2。
表2酶 反应程度 产物醇(S)∶(R)比率手性酶L5(Chirazyme L5) ＜20％ 1∶1(Boehringer)(脂酶)羊肝丙酮粉(Sigma)＜2％ 2∶1猪肝丙酮粉(Sigma) ＜10％ 1.1.3胰脂酶(生物催化剂) ＜10％ 1∶10手性酶L7＜10％ 1∶3.6(Boehringer)(脂酶)胰脂酶(Fluka)＜5％ 1∶15.6B．根据流程2由外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸和4-氨基二苯酮制备外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺，并转化为丁酯。用猪胰脂酶(生物催化剂)水解丁酯。将于MTBE(5ml)中的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酯(0.5g)加入于酶(0.1g)的保持在30℃,pH 7.5的缓冲液中。使用猪胰脂酶，在两天中，反应进行约25％的转化并显示出所需的(S)对映体几乎不水解。加入更多的猪胰脂酶(0.2g)再过3小时后得出35％反应，处理后获得约99％对映体过量的(R)醇。所述产物经层析得到99％对映体过量的(R)醇，以及水解后具有50％的对映体过量的回收酯。
使用1∶1(重量/重量)酶∶底物在两天内反应几乎完成，水解回收酯后得到(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺，以及基于引入N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺的量计算收率35％的98.5％对映体过量(即可得(S)酯的70％)。
实施例4-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的酯的酯催化拆分在38℃使用pH控制器在7.10最大/7.07分钟进行反应。将5克摩尔磷酸二氢钠溶液(100ml)和固化Candida antaretia脂酶(NovozymeSP 435,Boehringer Mannhein)(2g)共同搅拌并在38℃用0.5N氢氧化钠(2ml)调pH至7.1。加入任选溶解于甲基叔-丁基醚(MTBE)(50ml)或叔-丁醇(50ml)中的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的外消旋甲基、乙基或丁基酯(5g)。搅拌反应混合物，加入适量的0.5N氢氧化钠溶液，至相应约50％水解为止。任选加入更多的酶增加水解速率。
再加入MTBE(50ml)，将反应混合物搅拌15分钟，然后过滤，用MTBE(15ml)洗涤残留物。分出水层并用MTBE(30ml)提取。合并的有机提取液用盐水(30ml)洗涤，然后过滤，蒸发得到未反应的酯。用手性位移试剂如2,2,2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(tfae)经NMR分析测定酯的对映体比率。分离的水层酸化至约pH2，并用MTBE或乙酸乙酯(2×50ml)提取。经硅灌土(2g)过滤有机提取物，用盐水洗，过滤并蒸发得到拆分的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸，将其用己烷研制，滤除固体。在L-(-)-α-甲基苄胺存在下经NMR测定酸对映体纯度。
(ⅰ)在未用共溶剂时3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的甲基、乙基和丁基酯的水解结果列下面表3中。
表3
(ⅱ)用各种共溶剂时3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的乙基酯水解结果列下面表4中。
表4
实施例5-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸酯的酶催化拆分实施例5A反应按下列之一进行(a)在含有50mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液，pH7.6(4ml)的7ml玻璃管形瓶中。
将3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的乙基酯(40mg)悬浮于缓冲液中并加入酶(10mg)开始反应。在22℃轻轻搅拌反应物。或(b)在含有5mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液，pH7.6(30ml)的50ml夹套玻璃反应器中。
将3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的乙基酯(300mg)悬浮于缓冲液中，并用0.1M氢氧化钠调pH至7.6。加入酶(75mg)开始反应。在28℃搅拌反应物并用0.1M氢氧化钠经自动滴定仪保持pH在7.6。
间隔取反应混合物样品(0.2ml)并用己烷(1.8ml)提取。通过气相层析测定残留酯浓度分析样品的水解程度。在自动滴定仪中进行反应时，从氢氧化钠溶液的消耗也能测定水解程度。
在下列条件下经气相层析测定酯的浓度层析仪Perkin Elmer8500；柱DB5(30米，J&W Scientific；加热室120℃；检测室250℃；进样室250℃；载气氦气；压力8psi；检测器FID。乙基酯的保留时间是2.8分钟。
在下列条件下经气相层析也可测定残留酯的对映体过量层析仪Perkin Elmer 8500；柱CP Chirasil-Dex CB(25米)，Chrompak；加热室温度梯度等温1在80℃3分钟，20℃/分升温2分钟，等温2于120℃6分钟；其它设定同非手性分析。(S)-对映体保留时间是4.0分和对(R)-对映体是4.1分。
结果列于表5中。如表5所示，经米曲霉、地衣型芽胞杆菌，Aspergillus sojae和SP539酶水解3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸，对3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的乙基酯的(R)对映体有良好选择性。实施例5B也可以使用得自Aspergillus sojae(Sigma)(蛋白酶)和SP539(Novo)(蛋白酶)的酶水解3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的丁基酯。分析方法与实施例5A乙基酯所使用的相同。丁基酯的保留时间是4.6分钟(DB5柱)。(S)对映体的保留时间是6.1分钟。(R)对映体的保留时间是6.3分钟(CP Chirasil-Dex CB柱)。
与在实施例5A中所述的乙基酯相同，在pH自动滴定仪中进行实验。取样一定时间。结果列表6和7中。
表5
表6Aspergillus sojae(Sigma)
表7SP539(Novo)
实施例6-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈的丁酯的酶催化拆分在38℃使用pH控制器在7.50最大/7.45分钟进行反应。搅拌5毫摩尔磷酸二氢钾溶液(100ml)和粗品猪胰脂肪酶(PPL)(1g)，并在38℃用0.1N氢氧化钠水溶液(5ml)调pH至7.5。加入溶解于MTBE(20ml)的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙腈外消旋丁酯(5g)，用MTBE(5ml)洗涤。7小时后，再加入PPL(1g)，当加入30ml的0.1NNaOH时搅拌反应过夜。7小时后，再加入14ml的0.1NNaOH，再加入PPL(2g)，需要10ml的0.1NNaOH用于中和。再加入69ml0.1N NaOH后再搅拌反应物2天(消耗总量113ml用于酶催化水解，理论值为119ml)。
加入MTBE(50ml)、硅藻土(2g)和2N盐酸(5ml)调pH至5，搅拌反应混合物15分钟，然后过滤。分离出水层和用MTBE(50ml)提取。合并的有机提取液用50％盐水洗涤，然后过滤并蒸发。将得到的油状物(3.3g)上硅胶快速层析柱，用二氯甲烷作为洗脱剂。回收未反应酯(950mg)，在位移试剂存存在下通过NMR显示为单一的对映体。
在100℃共同加热回收酯(100mg)，水(1ml)和浓盐酸(2ml)6小时，然后在20℃搅拌过夜。加入饱和盐水(2ml)，用MTBE(2×5ml)提取混合物。过滤MTBE溶液并蒸发得到油状物及部分固体用己烷(2ml)研磨。滤除固体物(14.5mg)并用已烷(5ml)洗涤。在L(-)-(α)-甲基苄胺存在下，NMR显示3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸为(S)-对映体。
权利要求
1．制备具有旋光性的式Ⅰ活性化合物的方法
其中E选自氮和CZ，其中C是环碳，Z是下述定义的取代基，其中当E是CZ时，X和Z选自(A)X是Ar Y，其中Y为选自羰基、亚磺酰基和磺酰基的连接基团，Ar选自用选自卤素、羟基、氰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2个取代基取代的苯基；含有1-2氮原子作为仅有的杂原子的六元杂芳环；含有选自氮、氧和硫的1-2杂原子的五元杂芳环；和Z选自氢、氰基、卤素、羟基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；和(B)X是氰基，Z选自苯硫基，苯亚磺酰基和苯磺酰基，其中苯环被选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2个取代基所取代；和当E是氮时，X独立选自任何在上述(A)中给出的X；和*是旋光活性的手性中心，所述方法包括用水解酶处理式Ⅱ外消旋化合物的步骤式Ⅱ
其中X和E如上述定义，R1是由独立选自羟基、卤素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基和C1-C4二烷胺基的一个或多个取代基任选取代的烷基。
2．权利要求1的方法进一步包括从旋光活性式Ⅰ化合物分离未反应的式Ⅱ化合物的步骤。
3．权利要求1的方法进一步包括将未反应的式Ⅱ化合物转化成式Ⅰ相应醇的步骤。
4．权利要求1的方法，其中所述水解酶是脂酶。
5．权利要求4的方法，其中所述脂酶是猪胰脂肪酶。
6．权利要求1的方法，其中R1是任选取代的C1-C7烷基。
7．权利要求1的方法，其中所述的旋光活性式Ⅰ化合物是(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺，用式Ⅱ化合物，其中E是CZ,X是ArY,Y是羰基，Ar是苯基，和Z是氢完成用水解酶处理式Ⅱ化合物的外消旋物的所述步骤。
8．制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的方法，包括用水解酶处理式Ⅴ外消旋化合物式Ⅴ
其中R2是C1-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基。
9．权利要求12的方法，其中所述水解酶是脂酶。
10．权利要求13的方法，其中所述的脂酶是Candida antarctica脂酶。
11．式Ⅴ或式Ⅵ的化合物式Ⅴ 式Ⅵ
或
其中R2是C2-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基和*是旋光活性手性中心，条件为当所述的化合物具有式Ⅴ时，R2不是乙基。
12．制备(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的方法，包括用水解酶处理式Ⅶ化合物的步骤式Ⅶ
其中A是CN、COH、CH(OR3)2、COR4、COOR5、CONH2、CONHR6或CONR7R8；R3、R4、R5、R6、R7和R8独立选自烷基、芳基和芳烷基；和R9是烷基、芳基或芳烷基，其中R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9可被选自羟基、卤素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基或C1-C4二烷胺基的取代基任选独立取代；得到相应的式Ⅷ式Ⅷ
其中A具有上述定义的意义和*是旋光活性手性中心；并转化式Ⅷ化合物成酸。
13．权利要求15的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
14．权利要求16的方法，其中所述的脂酶是猪胰脂肪酶。
15．权利要求15的方法，其中式Ⅷ中A是CN。
16．式Ⅷ的化合物式Ⅷ
其中*是旋光活性手性中心和A是CN、COH、CH(OR3)2、COR4、COOR5、CONH2、CONHR6或CONR7R8；R3、R4、R5、R6、R7和R8独立选自烷基、芳基；其中R3、R4、R5、R6、R7和R8可被选自羟基、卤素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基或C1-C4二烷胺基的取代基任选独立取代。
17．权利要求16的化合物，其中A是CN。
18．式Ⅶ或式Ⅸ的化合物式Ⅶ 式Ⅸ
或
其中*是旋光活性手性中心；和A是CN、COH、CH(OR3)2、COR4、COOR5、CONH2、CONHR6或CONR7R8；R3、R4、R5、R6、R7和R8独立选自烷基、芳基和芳烷基；R9是烷基、芳基或芳烷基，且其中R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9可被选自羟基、卤素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基或C1-C4二烷胺基的取代基任选独立取代；条件为当A是CN时，R9不是甲基。
全文摘要
本发明提供制备旋光活性式Ⅰ化合物酶催化方法,其中X、E和
文档编号C12P7/40GK1215434SQ97193598
公开日1999年4月28日 申请日期1997年4月7日 优先权日1996年4月10日
发明者J·克罗斯拜, R·A·霍尔特, J·D·皮特曼 申请人:曾尼卡有限公司