专利名称：可分解水产废弃物的菌株及使用该菌株生产水溶性氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及可分解水产废弃物的本土菌株，及使用该等菌株分解水产废弃物为水溶性基酸的方法，及其产物。
水产废弃物，如鱼头、鱼内脏及鱼蒸煮液，富含蛋白质及维生素，可再利用制成具经济价值的产品，如有机肥、鱼粉及鱼精。鱼精由水溶性综合氨基酸所组成，为再制品中经济价值较高的产品，可作为农用植物营养剂，用于促进植物生长、发芽、开花、结果，及增加果实甜度。
为有效利用水产废弃物，提高水产废弃物再制品之品质及经济价值，必须寻得一有效方法，可分解水产废弃物中的蛋白质为水溶性氨基酸，以进一步生产高品质产物。
本发明的目的在于提供一种可分解水产废弃物的本土化菌株。
本发明再一目的在于提供利用该等本土化菌株将水产废弃物分解成水溶性氨基酸的方法及产物。
本发明提供一种可将水产废弃物分解成水溶性氨基酸的本土化菌株，该菌株是由土壤中分离而得，经食品工业发展研究所鉴定为枯草杆菌，命名为枯草杆菌18-1及19-2(Bacillus subtilis18-1及19-2)，上述两菌株已保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏日为1998年5月4日，保藏号分别为ATCC202123及ATCC202124。
本发明还提供一种使用上述菌株分解水产废弃物为水溶性氨基酸的方法，包括使用上述菌株之一处理水产废弃物，当该水产废弃物与菌株的混合液的pH值达7.0-7.5时，控制反应通气量至几近于零，待达到所欲甲醛态氮含量时回收水溶性氨基酸。
上述方法中当该混合液pH值达7.0-7.5时，温度达约38.5-40℃。反应通气量几近于零，即0-0.03vvm。
适用于本发明方法的“水产废弃物”来自水产加工厂的水产废弃物，特别是鱼废料，如鱼渣，较佳为鱼蒸煮液。进行该方法前，反应混合物最好先经高温高压处理以灭菌。
根据本发明方法，发酵菌株的接种量较传统方法为低；本发明使用的可生产蛋白酶菌株的接种量约为0.1％至20％，较佳的菌种浓度为OD600值大于7％。
以上述方法所回收的水溶性氨基酸产物，可依习知过滤及浓缩方式进行；例如，可采用压滤法经滤布过滤之，并可视情况添加滤剂，诸如白滤土或硅藻土；浓缩方式如真空浓缩。
根据本发明方法，作用时间较短，可免除传统发酵方法常见的腐败现象，因而降低产物的臭味。
根据本发明方法制得的水溶性氨基酸产物，包含6.25-9.75％的水溶性氨基酸，其中氨基酸态氮为1.38-1.61％，甲醛态氮为1.47-1.79％，总氮为约9％，较传统发酵方法的发酵产物为高，具有鱼香味，符合一般鱼精产品的需求。亦可进一步制成适用于植物叶面的高品质植物营养剂。
上述说明是用以阐述本发明的精神，本领域熟练技术人员当能据以推及本发明的其他态样。下述实施例是进一步例示本发明的实施，但非用以限制本发明范围。
实施例实施例1 甲醛态氮(FN)值的计算及氨基态氮(AN)值的测定
(I)FN值的计算％FN＝(V2-B.K)×N×F×1.4B.K空白 滴定量(ml)V2样品 滴定量(ml)NNaOH浓度FNaOH力价氨基态氮(Aminor nitrogen，AN)的分析为甲醛态氮(FN)减除氨态氮含量即得。
(II)氨基态氮(AN)分析(A)标准品及A、B剂配制1.氨基态氮的标准品(1)100mg/l的NH4贮存液(100mg/l)4克NH4Cl在100℃干燥1小时后，取3.819克溶在H2O中，定量至1升。
(2)200mg/l的NH4贮存液(200mg/l)；稀释2毫升前述(1)得到的NH4贮存液至100毫升。
2.A剂(苯酚硝普盐缓冲剂)(1)将30克Na3PO4.12H2O，30克Na3C6H8O7.2H2O，3克EDTA溶于1000毫升H2O中。
(2)于800毫升(1)中得到的缓冲液中溶入60克苯酚。
(3)加0.2克Na2Fe(CN)5NO.2H2O到(2)中得到的缓冲液中。
(4)用(2)得到的缓冲液定量至1升，只能保存3周。
3.B剂(Alkalin Hycochlorite Reagent)(1)将40克NaOH溶于1000毫升水中成1N NaOH溶液。
(2)将30毫升市售一般漂白水加入到400毫升1N NaOH溶液中。
(3)加水定量至1升。
(B)标准品配制氨溶液浓度0～1ppm参考样品，进行反应操作程序作出标准曲线。
(C)样品处理样品稀释至氨基态氮小于1ppm(约稀释2000～1000倍)，取2.5毫升至试管中，加A剂1毫升，B剂1.5毫升振荡均匀，置于抽风箱，于室温下静置45分钟，测λ＝635nm的吸光值，对照标准品浓度求出其浓度。
实施例2 菌种分离及筛选培养基成份胰蛋白大豆琼脂(TSA)Bacto胰蛋白胨15克/升Bacto大豆蛋白胨 5克/升氯化钠 5克/升琼脂 15克/升胰蛋白大豆培养液(TSB)Bacto胰蛋白胨17克/升Bacto大豆蛋白胨 3克/升Bacto右旋葡萄糖 2.5克/升氯化钠 5克/升磷酸氢二钾 2.5克/升土壤以无菌水稀释至103～106倍，均匀涂布在以牛乳为培养基的培养皿中。在37℃下培育24小时，再于TSA培养皿37℃下培养24小时活化。或直接涂布在TSA培养皿上或于45℃或于37℃培育24小时，取不同菌株再接种至牛乳培养液中。
取出的菌株或在45℃下，50rpm振荡培养，或在37℃，100rpm振荡培养24小时。筛选菌株，再以TSB活化，取菌液4％植入无菌鱼汁发酵液25毫升中(于250毫升摇瓶中)，于37℃中100rpm振荡培养3天，以甲醛态氮(FN)值筛选出其中较佳的菌种。
于本实验中筛选出18-1及19-2两株，经食品工业发展研究所鉴定为枯草杆菌，故命名为枯草杆菌18-1及19-2，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏日为1998年5月4日，保藏号为ATCC202123及ATCC202124。
实施例3 摇瓶实例菌株接种液的制备是取一枯草杆菌菌落置于250毫升摇瓶内装的25毫升TSB培养液中，在37℃，175rpm振荡培养过夜后，取5毫升菌液接种于另一25毫升TSB培养液中，以相同生长条件，培养4小时，随后作为接种于发酵培养液的接种液。
鱼蒸煮液，或鱼渣混合液(其甲醛态氮含量为0.1至0.4％间)50毫升放入250毫升摇瓶中作为发酵培养液，经高温高压灭菌后加入1毫升枯草杆菌18-1或19-2接种液，在37℃或45℃下175rpm振荡发酵培养。
经三天发酵培养后，pH由5.0-6.4上升至7.3-8.5，甲醛态氮(FN)自0.13～0.4％提高至0.25～0.65％。其结果如表1及表2所列。所得之一代表性产物进一步作氨基酸分析，其结果如表3所示。摇瓶测试结果37℃发酵表1
*初级鱼精鱼下滓经绞碎、蒸煮及浓缩制成45℃发酵表2
摇瓶测试的水溶性氨基酸含量对照表鲔鱼蒸煮液加初级鱼精发酵液于37℃作用三天表3氨基酸(mg/L)不加菌加Bacillus 18-1加Bacillus 19-2ASP 543.62208.36 109.46THR 541.89250.42 280.11SER 471.05139.51 131.48GLU 963.691569.272238.09PRO 507.051180.211129.00GLY 833.191008.691447.02ALA 1489.66 917.31 1901.62VAL 721.661384.871663.23MET 406.781319.401403.65ILE 630.14713.12 894.49LEU 1251.61 2127.732713.55TYP 504.631139.011153.19PHE 606.471486.961475.22LYS 1043.18 3070.613039.69HIS 3405.51 3551.144022.11ARG 988.25195.84 385.17TRP 99.47 211.53 202.29TOTAL(％) 1.501 2.047 2.47FN(％) 0.357 0.584 0.622
实施例4 通气量控制比较实验将含有鱼蛋白原料(如鲔鱼蒸煮或鱼渣等)的1公升(pH为6.2)无菌溶液引入配有搅拌器、控温及供气系统的2公升发酵槽中，将40毫升枯草杆菌18-1接种液(接种量为4％)于38.5℃至39.5℃时加入此发酵槽中。
枯草杆菌接种液的制备，是于100毫升无菌TSB培养基中，在37℃、175rpm转速下，摇瓶培育15至16小时而成。
以剧烈搅拌，通气于2公升主发酵槽中发酵。经26.5小时发酵终止，甲醛态氮(FN)自0.214％提高至0.294％，pH为8.172。
在上述相同培养条件下，只是在主发酵槽中当pH值自6.2上升至7.2-7.5时(约9-12小时)，将供气系统关闭，保持内外槽压至最低，并再继续搅拌发酵，至26小时发酵终止，甲醛态氮(FN)自0.217％提高至0.377％，pH为7.05。
上述两项实验结果显示利用本发明方法所得甲醛态氮较未控制通气量的方法为高。
实施例5 放大实例100公升鱼蛋白原料的无菌培养基装入150公升发酵槽中。18-1菌株接种液0.1公升(接种量为0.1％)于39.5℃至40.0℃时加入此150公升发酵槽中。在通气、搅拌及39.5℃至40℃下发酵培养。直至pH值自6.4上升至7.0～7.5时(约9～12小时)，将供气系统关闭，保持内外槽压至最低，并再继续发酵，至24小时发酵终止，甲醛态氮(FN)自0.244％升至0.378％，pH为7.07。
枯草杆菌接种液的制备，是在300毫升无菌TSB培养基中，在37℃、160～175rpm转速下，摇瓶培育15至16小时而成。
将此发酵液经离心、过滤及真空浓缩4～5倍后，FN为1.67％、AN为1.38％、TN为9.08％及总氨基酸含量(综合氨基酸总含量；18种一般氨基酸)为7.8％，pH为6.94。
实施例6 放大实例300公升鱼蛋白原料的无菌培养基引入500公升发酵槽中。18-1菌株接种液3.0公升(接种量为1％)于38.5℃至39.5℃时加入此500公升发酵槽中。在通气、搅拌及39℃至41℃下发酵培养。直至pH值自6.2上升至7.0～7.5时(约9～12小时)，将供气系统关闭，保持内外槽压至最低，并再继续发酵，至24小时发酵终止，FN自0.294％至0.409％，pH为7.15。
枯草杆菌接种液的制备，是于500毫升无菌TSB培养基中，在37℃、175rpm转速下，摇瓶培育15至16小时而成。
将此发酵液经离心、过滤及真空浓缩4～5倍后，FN为1.79％、AN为1.61％、TN为9.56％及总氨基酸含量为9.75％，pH为7.015。
实施例7 放大实例700公升鱼蛋白原料的无菌培养基引入1500公升发酵槽中。18-1菌株接种液4.5公升(接种量为0.64％)于40℃时加入此1500公升发酵槽中。在通气、搅拌及40℃下发酵培养。直至pH值自6.2上升至7.0～7.5时(约9～12小时)，将供气系统关闭，保持内外槽压至最低，并再继续发酵，至24小时发酵终止，FN自0.218％升至0.349％，总氨基酸含量自0.86％提升为1.16％，pH为7.01。
枯草杆菌接种液的制备，是于10公升无菌TSB培养基于20公升发酵槽中，在通气、搅拌及39℃下，培养15至16小时而成。
将此发酵液经离心、过滤及真空浓缩4～5倍后，FN为1.47％及总氨基酸含量为6.25％，pH为6.92。
权利要求
1.一种可分解水产废弃物为水溶性氨基酸的枯草杆菌18-1，其于1998年5月4日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC202123。
2.一种可分解水产废弃物为水溶性氨基酸的枯草杆菌19-2，其于1998年5月4日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC202124。
3.一种分解水产废弃物为水溶性氨基酸的方法，其是使用如权利要求1或2定义的菌株处理水产废弃物，当该水产废弃物与菌株的混合液的pH值达7.0-7.5时，控制反应通气量至几近为零；待甲醛态氮达到所欲含量时，回收分解水溶性氨基酸产物。
4.根据权利要求3的方法，其中该水产废弃物为鱼废弃物。
5.根据权利要求4的方法，其中该鱼废弃物为鱼蒸煮液。
6.根据权利要求3的方法，其中反应通气量为0～0.03vvm。
7.根据权利要求3的方法，其中该混合液pH值达7.0-7.5时，温度为38.5-40℃。
8.一种水溶性氨基酸组合物，其是由权利要求3，4，5，6或7的方法所制得。
9.根据权利要求8所述的水溶性氨基酸组合物，可作为鱼精或施用于植物叶面的植物营养剂。
全文摘要
本发明提供了可分解水产废弃物成为水溶性氨基酸的本土化菌株,枯草杆菌18—1及19—2,特别适合用来处理鱼废料,以及以此本土化菌株处理得到水溶性氨基酸的方法及产物。
文档编号C12P13/04GK1240827SQ9810273
公开日2000年1月12日 申请日期1998年6月25日 优先权日1998年6月25日
发明者纪威光, 罗淑慧, 张宝玉, 赖润芝 申请人:财团法人生物技术开发中心